一株可以还原制备纳米银的解淀粉芽孢杆菌的制作方法
【专利摘要】一株可以还原制备纳米银的解淀粉芽孢杆菌，它涉及一株解淀粉芽孢杆菌。一株可以还原制备纳米银的解淀粉芽孢杆菌，它为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus?amyloli?quefaciens）zxw01，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC?No.8464，保藏日期为2013年11月11日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号。本发明一株可以还原制备纳米银的解淀粉芽孢杆菌，它在含有硝酸银的LB培养基生长培养中胞外合成纳米银，能够通过连续添加含有硝酸银的培养基来连续合成纳米银，为连续生产纳米银提供菌源，实现了利用发酵原理连续大量合成纳米银。
【专利说明】一株可以还原制备纳米银的解淀粉芽孢杆菌
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌。
【背景技术】
[0002]纳米银因呈现出不同于普通材料的光、电、磁、热力学和化学反应等方面的奇异性能，被广泛应用在化工、医药、抗菌、冶金、航空、航天、电子等领域。纳米银主要由化学方法合成，不足之处在于合成成本高、所需能耗大和易吸附有机溶剂等，这就限制了纳米银在医药方面的应用。因此，纳米银生物合成法因其成本低廉、条件温和和环境友好等优势引起了人们广泛的关注。
[0003]近年来，细菌、放线菌、真菌和植物提取物等都被用来用来合成纳米银，细菌因便于基因操作，可以使用 基因工程技术使特定的还原酶活其稳定作用的蛋白过量表达，，在制备纳米银方面有很大的优势。目前，细菌还原制备纳米银多采用细菌的培养上清液和菌体浸泡液，都属于胞外液间歇式生产纳米银的过程，限制了纳米银的产量。因此，寻找能在生长培养过程中胞外合成纳米银的细菌菌株并应用于连续生产纳米银是提高纳米银产量的关键问题。
【发明内容】
[0004]本发明目的是提供一株可以还原制备纳米银的解淀粉芽孢杆菌，为连续生产纳米银提供菌源。
[0005]一株可以还原制备纳米银的解淀粉芽孢杆菌，它为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloli quefaciens) zxwOl,属于芽孢杆菌属(Bacillus),已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.8464，保藏日期为2013年11月11日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路I号院3号。
[0006]解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloli quefaciens) zxwOl,菌株的形态特征:它为杆菌，长1.5~1.8 μ m,宽0.3~0.4 μ m,有中生芽孢,无鞭毛,无荚膜,生长菌落为圆形,表面粗糙不透明，边缘不整齐。
[0007]解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloli quefaciens) zxwOl,菌株的生理生化特征:它为革兰氏阳性菌，过氧化氢酶接触实验阳性，酪素水解、淀粉水解、明胶水解、尿素水解阳性，葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糖实验均产酸，D-木糖、L-阿拉伯糖、蜜二糖、麦芽糖、山梨醇、肌醇、甘露醇、乳糖、鼠李糖实验不产酸，硝酸盐还原实验、伏普实验、柠檬酸盐实验、马尿酸实验阳性，苯丙氨酸实验阴性。
[0008]解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloli quefaciens)zxw01,菌株的分子生物学鉴定结果:它的16srDNA序列在GenBank的注册号是KF700242，利用BLAST搜索与所得到的序列相似性高的序列，该菌的序列与解淀粉芽孢杆菌dhs-28的相似性达到99%，通过MEGA软件构建系统进化树，如图3所示，结合其形态鉴定及生理生化实验结果，确定该菌是解淀粉芽孢杆菌；但是传统的解淀粉芽孢杆菌可以利用麦芽糖和L-阿拉伯糖产酸，而该菌株不可以利用这两种糖，说明该菌株是解淀粉芽孢杆菌的一个新种。
[0009]本发明一株可以还原制备纳米银的解淀粉芽孢杆菌，它为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloli quefaciens) zxwOl,属于芽抱杆菌属(Bacillus),已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.8464，保藏日期为2013年11月11日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路I号院3号。
[0010]本发明一株可以还原制备纳米银的解淀粉芽孢杆菌，它在含有硝酸银的LB培养基生长培养中胞外合成纳米银，能够通过连续添加含有硝酸银的培养基来连续合成纳米银，为连续生产纳米银提供菌源，实现了利用发酵原理连续大量合成纳米银。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为【具体实施方式】一中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloli quefaciens)zxw01的透射电镜图；
[0012]图2为【具体实施方式】一中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloli quefaciens)zxw01的PCR的扩增电泳图；
[0013]图3为【具体实施方式】一中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloli quefaciens)zxw01的系统进化树图；
[0014]图4为【具体实施方式】一中解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloli quefaciens)zxw01合成纳米银的电镜图。
【具体实施方式】
[0015]【具体实施方式】一:本实施方式一株可以还原制备纳米银的解淀粉芽孢杆菌，它为解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloli quefaciens) zxwOl,属于芽抱杆菌属(Bacillus),已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微`生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.8464，保藏日期为2013年11月11日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路I号院3号。
[0016]本实施方式中一株可以还原制备纳米银的解淀粉芽孢杆菌，它使用常规的筛选方法获得，过程如下:
[0017]称量IOg取自东北林业大学林场的土壤，于90ml蒸馏水中制成悬浮液，取2ml悬浮液接种于LB培养基中培养20h，加入0.5mmol/L的AgNO3避光培养3天，取2ml该培养液接种于含有1.0mmoI/L AgNO3的改良LB培养基中避光培养3天，取2ml该培养液接种于含有1.5mmol/L AgNO3的改良LB培养基中避光培养3天，依据此方法，将AgNO3的浓度提高到5mmol/L ;将含有5mmol/L AgNO3的培养液涂布于LB固体培养基平板培养24h，将长出的单菌落进行划线纯化，即得到了能耐银的细菌菌株。
[0018]改良的LB培养基成分:酵母提取物5g，蛋白胨10g，溶于IL水中，pH7.0~7.2。
[0019]结果:所得到的菌，其菌体形态如图1所示，它为杆菌，长1.5~1.8 μ m，宽0.3~
0.4 μ m，有中生芽孢，无鞭毛，无荚膜。
[0020]参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》，对筛选到的菌进行生理生化特征测定:它为革兰氏阳性菌，过氧化氢酶接触实验阳性，酪素水解、淀粉水解、明胶水解、尿素水解阳性，葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糖实验均产酸，D-木糖、L-阿拉伯糖、蜜二糖、麦芽糖、山梨醇、肌醇、甘露醇、乳糖、鼠李糖实验不产酸，硝酸盐还原实验、伏普实验、柠檬酸盐实验、马尿酸实验阳性，苯丙氨酸实验阴性。
[0021]对筛选到的菌进行分子生物学鉴定:用购买自北京庄盟生物公司的细菌基因组提取试剂盒提取该菌的基因组DNA，用细菌通用引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTGAG-3’和1492R:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’对细菌的 16srDNA 进行 PCR 扩增；PCR 扩增体系:5yL模板 DNA，5 μ LlOXBuffer (含 15mmol/LMgCl2)，I μ L10mmol/L dNTP, 10 μ L2.5mmol/L 的引物 27F, 10μ L2.5mmol/L 的 1492R，0.5 μ L5U/L 聚合酶，18.5 μ L 去离子水；PCR 扩增条件:94°C 预变性 5min，94°C 变性 30s，52°C 退火 30s，72°C 延伸 3min，循环 30 次，72°C 延伸 IOmin ；得到目的片段，电泳后胶回收PCR产物，将产物连接到T载体后转入E.coli DH5 α，得到带有细菌16srDNA的转化子，将转化子大肠杆菌送上海生工生物公司进行测序。电泳图谱如图2所示，目的片段16srDNA在1600bp左右；然后利用拼接软件将测序结果进行拼接，得到该细菌16srDNA的序列，序列长度为1514bp。[0022]鉴定结果:它的16srDNA序列在GenBank的注册号是KF700242，利用BLAST搜索与所得到的序列相似性高的序列，该菌的序列与解淀粉芽孢杆菌dhs-28的相似性达到99%，通过MEGA软件构建系统进化树，如图3所示，结合其形态鉴定及生理生化实验结果，确定该菌是解淀粉芽孢杆菌；但是传统的解淀粉芽孢杆菌可以利用麦芽糖和L-阿拉伯糖产酸，而该菌株不可以利用这两种糖，说明该菌株是解淀粉芽孢杆菌的一个新种，它为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloli quefaciens) zxwOl。
[0023]解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloli quefaciens)zxw01,取I接菌环接种在含有200ml LB培养基的锥形瓶里，在37°C，120r/min的振荡培养箱中培养20_24h，获得培养液；将2ml培养液接种到含有200ml LB培养基的锥形瓶里，在37°C，150rpm的振荡培养箱中培养到对数期，然后加入IOmllOmM AgNO3溶液避光培养20天，在4000rpm的条件下将培养液离心收集菌体沉淀，再利用TECNAIG2仪器(荷兰)在60kV下进行成像；结果如图4所示，该细菌胞外合成了纳米银，近似球行，小部分有团聚现象，可见本实施方式筛选出的菌，是一株可以还原制备纳米银的解淀粉芽孢杆菌。
[0024]将解淀粉芽抱杆菌(Bacillusamyloli quefaciens) zxwOl,取 2 环接种于 100mlLB培养基中，于37°C，150rpm恒温培养20h，使培养液的0D_达到1.5，制成摇瓶种子，按
0.5:1的接种量将摇瓶种子中的培养液接种到含有5L改良LB培养基的种子罐中培养12h，搅拌转速为340r/min，然后按5%的接种量，利用注射器在含有10L含有2.5mmol/L改良LB培养基的发酵罐的接种口橡皮膜上进行注射接种，发酵5天，流出罐内6L培养物收集纳米银，重新加入6L新鲜的含有2.5mmol/L改良LB培养基连续发酵5天，将罐内6L培养物流出，重新加入6L新鲜的含有2.5mmol/L改良LB培养基连续发酵5天，这就实现了利用发酵原理连续大量合成纳米银。可见，本实施方式中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) zxwOl为连续生产纳米银提供了新的菌源。
【权利要求】
1.一株可以还原制备纳米银的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于它为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloli quefaciens) zxwOl,属于芽抱杆菌属(Bacillus),已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.8464，保藏日期为2013年11月11日，保藏 地址为北京市朝阳区北辰路I号院3号。
【文档编号】C12N1/20GK103627664SQ201310682200
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】张 杰, 王滨松, 张映, 王娇, 熊文 申请人:东北林业大学