诊断乳腺癌的组合物和试剂盒、及用其诊断乳腺癌的方法

诊断乳腺癌的组合物和试剂盒、及用其诊断乳腺癌的方法
【专利摘要】提供乳腺癌诊断组合物和试剂盒、以及通过使用所述组合物或试剂盒诊断乳腺癌或获得用于乳腺癌诊断的信息的方法。所述组合物或试剂盒包括与选自囊泡中的hsa-miR-126、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa-miR-30c的至少一种微RNA(miRNA)或所述微RNA的片段相同或互补的多核苷酸。
【专利说明】诊断乳腺癌的组合物和试剂盒、及用其诊断乳腺癌的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求在韩国知识产权局2012年12月18日提交的韩国专利申请N0.10-2012-0148873、2013 年 4 月 17 日提交的韩国专利申请 N0.10-2013-0041965 和 2013年7月12日提交的韩国专利申请N0.10-2013-0082465的权益，其公开内容通过参考引入本文中。
【技术领域】
[0003]本发明构思涉及用于乳腺癌诊断的组合物和试剂盒、以及使用其的乳腺癌诊断方法。
【背景技术】
[0004]微泡是存在于多种类型的细胞中或者从多种类型的细胞分泌的小的膜状囊泡。从细胞分泌的微泡包括:(i)外来体，其为来源于细胞的具有30-100nm的直径的囊泡；(ii)核外粒体(也称作脱落微泡(SMV))，其为从质膜直接释放并具有50-1000nm的直径的囊泡；和(iii)凋亡泡，其为具有50-5000nm的直径的从濒死细胞分泌的囊泡。
[0005]已通过使用电子显微镜证实，外来体不从质膜直接释放，而是来源于称作多泡体(MVB)的特定的细胞内区域，然后释放到细胞外环境中作为外来体。尽管尚未明确地确定在外来体的产生中涉及哪些分子机理，但是已知红细胞、其它多种类型的免疫细胞(包括B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、树突状细胞、血小板和巨噬细胞)、和甚至肿瘤细胞当处于正常的活的状态时能够产生和分泌外来体。还已知取决于外来体处于正常状态、病理状态或异常状态，外来体被分离和分泌作为不同的细胞类型。
[0006]微泡可包含微RN·A(miRNA)，其可用于个体细胞或有机体的状况的检测。所述状况可为疾病，例如癌症、遗传性疾病、心脏病、或神经元疾病如精神分裂症。
[0007]现有的乳腺癌诊断方法是侵入性的并因此对于患者是痛苦的，且是非常昂贵的，这可导致人具有不太频繁的检查。在用于乳腺癌诊断的验血中具有高的准确度的血液蛋白标记物目前是不可得到的，且已知循环肿瘤细胞(CTC)仅可应用于转移性乳腺癌的诊断中，而不是癌症的早期诊断中。
[0008]因此，对于使用较小侵入性的方式的乳腺癌的早期诊断，存在对于乳腺癌-特异性血液标记物的选择性筛选的需要。

【发明内容】

[0009]提供用于乳腺癌诊断的组合物和试剂盒。所述组合物和试剂盒包括:(a)至少一种具有与选自囊泡中的 hsa-miR-126、hsa_miR-23a、hsa-miR-24、hsa_miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142_3p、hsa-miR-144、hsa_miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa-miR-30c的微RNA(miRNA)或所述微RNA的片段相同或互补的序列的多核苷酸，和(b)(i)特异性地结合到所述囊泡的物质、(ii)能够插进所述囊泡的脂双层中的物质、或(iii)能够特异性地结合到整联蛋白或其片段的物质。
[0010]提供诊断乳腺癌和获得用于乳腺癌诊断的信息的方法。所述方法包括:提供从受试者获得的包括囊泡的生物样品；测量所述样品中的微RNA的量，所述微RNA为选自如下的至少一种:hsa_miR-126、hsa_miR-23a、hsa-miR-24、hsa_miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142_3p、hsa-miR-144、hsa_miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93、和 hsa_miR-30c ；将测量的所述微RNA的量与对照(control)相比较；和基于来自所述样品的所述微RNA的量与对照的比较提供乳腺癌诊断。
[0011]另外的方面将在以下描述中部分地阐明，和部分地将从所述描述明晰，或者可由所提供的实施方式的实践获知。
【专利附图】

【附图说明】
[0012]从结合附图考虑的实施方式的以下描述，这些和/或其它方面将变得明晰和更容易理解，其中:
[0013]图1A-1C为在良性肿瘤患者组和乳腺癌患者组中通过使用缀合有作为靶蛋白的抗-CD83抗体、抗-FASL抗体或抗-ERBB2抗体的免疫珠分离的微泡的量的图。使用抗-CD9抗体确定在经分离的微泡中的CD9蛋白的量。对于各良性肿瘤和乳腺癌组，微泡的以任意单位(AU)的强度显示在y轴上；
[0014]图2A和2B为在良性肿瘤患者组和乳腺癌患者组中的微RNA的量的对比图。对于在X-轴上显示的微RNA的样品，交叉点(Cp)值(即循环)显示在y-轴上；
[0015]图3A-3C分别为经由通过使用缀合有抗-⑶83抗体、抗-FASL抗体、或抗-ERBB2抗体的免疫珠从良性肿瘤患者组和乳腺癌患者组分离的微泡的免疫印迹获得的整联蛋白-β蛋白带的相对强度。
`[0016]图4为在从良性肿瘤患者组和乳腺癌患者组分离的微泡中的整联蛋白和微RNA的曲线下面积(AUC)、以及整联蛋白-β和微RNA的总AUC的图。虚线表示整联蛋白-β的AUC’黑条表示微RNA的AUC，且白条表示整联蛋白-β和微RNA的总AUC。
【具体实施方式】
[0017]现在将详细介绍实施方式，其实例说明于附图中，其中相同的附图标记始终是指相同的要素。在这点上，本实施方式可具有不同的形式且不应解释为限于本文中阐明的描述。因此，下面仅通过参照附图描述实施方式，以解释本描述的方面。如本文中所使用的术语“和/或”包括相关列举项目的一个或多个的任何和全部组合。表述例如“……的至少一种”当在要素列表之前或之后时，修饰整个要素列表且不修饰所述列表的单独要素。
[0018]根据本发明构思的一个方面，用于诊断乳腺癌的组合物或试剂盒包括至少一种具有与选自囊泡中的 hsa-miR-126、hsa_miR-23a、hsa-miR-24、hsa_miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142_3p、hsa-miR-144、hsa_miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93 和 hsa_miR-30c的微RNA(miRNA)或所述微RNA的片段相同或互补的序列的多核苷酸。所述组合物可包括两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种、或十一种囊泡，其各自包含具有与选自hsa-miR-126、hsa_miR-23a、hsa-miR-24、hsa_miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142_3p、hsa-miR-144、hsa-miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93 和 hsa_miR-30c 的微 RNA(miRNA)或所述微RNA的片段相同或互补的序列的不同多核苷酸。所述组合物可包括其它额外的组分，例如包含不同的核酸的其它囊泡或其它物质。
[0019]“囊泡”是指被脂双层包围的膜状结构。例如，囊泡可为外来体或微泡。“微泡”是指来源于细胞的具有膜状结构的小囊泡。术语“微泡”可在本文中与术语“循环微泡”或“微粒”可互换地使用。微泡可存在于细胞中或者可从细胞分泌。从细胞分泌的微泡可包括外来体、核外粒体(脱落微泡(SMV))、或凋亡泡。外来体为来源于吞噬细胞的约30-约IOOnm直径的膜状囊泡。核外粒体(SMV)为从质膜直接释放的约50-约1000nm直径的大的膜状囊泡。凋亡泡为从濒死细胞漏出的约50-约5000nm直径的囊泡。体内微泡可包含微RNA或信使RNA (mRNA)。微泡的表面蛋白可为疾病-特异性标记物。
[0020]微RNA是在真核细胞中发现的短的核糖核酸(RNA)。微RNA调节在身体中的基因的表达，长度为约17-25个核苷酸(在下文中，“nt”)，且由DNA编码。微RNA可增加或减少在从基因组转录和断裂之后特异性蛋白的表达。迄今已知的哺乳动物微RNA可调节胰岛素分泌、淋巴细胞分化、细胞分裂、细胞死亡、病毒复制等。
[0021]所述用于诊断乳腺癌的组合物中的微RNA可为例如hsa-miR-126、hsa_miR-23a、hsa-miR-24、hsa_miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142_3p、hsa-miR-144、hsa_miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93、hsa_miR-30c、或其组合。所述 hsa-miR-126、hsa_miR-23a、hsa-miR-24、hsa_miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142_3p、hsa-miR-144、hsa_miR-15a、hsa-miR-185、hsa_miR-93和hsa_miR-30c可为来自人(缩写为“hsa”)的那些。对应于所述微RNA的序列如下:
[0022]hsa-miR-126对应于SEQ ID N0.1的核苷酸序列；
[0023]hsa-miR-23a对应于SEQ ID N0.2的核苷酸序列；
[0024]hsa-miR-24对应·于SEQ ID N0.3的核苷酸序列；
[0025]hsa-miR-19b对应于SEQ ID N0.4的核苷酸序列；
[0026]hsa-miR-103对应于SEQ ID N0.5的核苷酸序列；
[0027]hsa-miR-142-3p 对应于 SEQ ID N0.6 的核苷酸序列；
[0028]hsa-miR-144对应于SEQ ID N0.7的核苷酸序列；
[0029]hsa-miR-15a对应于SEQ ID N0.8的核苷酸序列；
[0030]hsa-miR-185对应于SEQ ID N0.9的核苷酸序列；
[0031]hsa-miR-93对应于SEQ ID N0.10的核苷酸序列；和
[0032]hsa-miR-30c 对应于 SEQ ID N0.11 的核苷酸序列。
[0033]所述微RNA的片段是指具有连续核苷酸序列的微RNA的多核苷酸。所述片段的长度可为，例如，约 2nt-25nt、3nt-24nt、4nt-23nt、5nt-22nt、6nt-21nt、7nt-20nt、8nt_19nt、9nt_18nt、10nt_17nt、llnt_16nt、12nt_15nt、或 13nt-14nt。
[0034]例如，所述多核苷酸可具有与所述微RNA或其片段的核苷酸序列相同的核苷酸序列。所述多核苷酸可具有与所述微RNA或其片段互补的核苷酸序列。所述多核苷酸可为引物或探针。所述多核苷酸的长度可为，例如，2nt-25nt、3nt-24nt、4nt-23nt、5nt-22nt、6nt-21nt、7nt-20nt、8nt-19nt、9nt_18nt、10nt_17nt、llnt_16nt、12nt_15nt、或13nt_14nt0[0035]所述用于诊断乳腺癌的组合物或试剂盒可进一步包括特异性地结合到囊泡的物质、能够插进囊泡的脂双层中的物质、或能够特异性地结合到整联蛋白或其片段的物质、或其组合。例如，所述特异性地结合到囊泡的物质可为能够结合到所述囊泡的表面蛋白、月旨质、或糖的物质。囊泡的表面蛋白可为，例如，CD83、CD9、EpCAM,小窝蛋白、FasL, HLA-DRA,CD36、CD63、CD81、MUCl、ERBB4、GPER、ERBB2、MLANA, AMHR2、或其组合。所述特异性地结合到囊泡的物质可为，例如，对蛋白具有结合亲和力的物质、酶的底物、辅酶、调节因子、受体-特异性结合物质、凝集素、糖、糖蛋白、抗原、抗体或其抗原-结合片段、激素、神经递质、磷脂-结合蛋白、包含血小板白细胞C激酶底物(pleckstrin)同源(PH)结构域的蛋白、胆固醇-结合蛋白、或其组合。所述抗原-结合片段可包括抗原-结合位点。例如，所述抗原-结合片段可为单域抗体、Fab、Fab'、或scFv。所述能够插进囊泡的脂双层中的物质可为，例如，包括亲脂性部分、两亲性部分、两性离子部分、或其组合的物质。所述亲脂性部分的实例为脂肪酸、留醇和甘油酯。所述两亲性部分的实例为磷脂和鞘脂。所述两性离子部分的实例为磺基甜菜碱、羧基甜菜碱和磷酸胆碱。所述特异性地结合到囊泡的物质或所述能够插进囊泡的脂双层中的物质可与固体载体结合。所述固体载体的实例为聚苯乙烯板、聚苯乙烯珠和磁珠。所述特异性地结合到囊泡的物质可为与正常对照例如不具有乳腺肿瘤或具有良性乳腺肿瘤的受试者相比，更加特异性地结合到得自乳腺癌患者的囊泡例如微泡的物质。所述特异性地结合到囊泡的物质可为乳腺癌特异性微泡标记物例如CD83、ERBB2、FASL、或其组合。
[0036]所述整联蛋白为穿过细胞 膜并且与细胞信号转导、以及细胞循环、细胞形状和细胞运动的调节有关的受:体蛋白。所述整联蛋白为由α亚基和β亚基组成的异质二聚体。所述整联蛋白可包括整联蛋白Ct亚基、整联蛋白β亚基、或其组合。例如，所述整联蛋白可包括选自如下的多肽:CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、整联蛋白 a 8(ITGA8)、整联蛋白 a9(ITGA9)、整联蛋白 a 10 (ITGAlO)、整联蛋白 a 11 (ITGAll)、CD11D、CD103、CDlla、CDllb、CD51、CD41、CDllc、CD29、CD18、CD61、CD104、整联蛋白 β 5(ITGB5)、整联蛋白
i36(ITGB6)、整联蛋白i3 7(ITGB7)、和整联蛋白β 8 (ITGB8) 0所述整联蛋白的片段是指具有所述整联蛋白的连续氨基酸序列的多肽。
[0037]所述能够特异性地结合到整联蛋白或其片段的物质可为特异性地结合到整联蛋白的抗体。所述特异性地结合到整联蛋白的抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。所述特异性地结合到整联蛋白的抗体可为全长抗体或抗原-结合片段。包括抗原-结合区的抗原-结合片段可为，例如，单域抗体、Fab、Fab'、或scFv。所述特异性地结合到整联蛋白的抗体可为抗-整联蛋白α亚基抗体或抗-整联蛋白β亚基抗体。
[0038]根据本发明构思的另一方面，诊断乳腺癌的方法包括:提供从受试者获得的包括囊泡的生物样品；测量所述样品中的微RNA的量，所述微RNA为选自如下的至少一种:hsa-miR-126、hsa_miR-23a、hsa-miR-24、hsa_miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142_3p、hsa-miR-144、hsa_miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93 和 hsa_miR-30c ;将测量的所述微RNA的量与对照(例如，测量的在从阳性或阴性对照样品分离的囊泡中的微RNA的量、或代表在阳性或阴性对照样品中的微RNA的量的数据)相比较；和基于来自所述样品的所述微RNA的量与所述对照的比较提供乳腺癌诊断。
[0039]所述方法可包括提供从受试者获得的包括囊泡的生物样品，和测量所述样品中的微RNA的量，其中所述微RNA包括如下的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种、或全部十一种微 RNA:hsa_miR-126、hsa_miR-23a、hsa-miR-24、hsa_miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142_3p、hsa-miR-144、hsa_miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93 和 hsa_miR-30co
[0040]所述诊断乳腺癌的方法包括提供从受试者取得的生物样品。
[0041]所述受试者可为哺乳动物，包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猫、狗、猪、牛、马、或灵长目(例如人)。
[0042]所述生物样品可为，例如，尿、粘液、唾液、眼泪、血浆、血清、痰、脊髓液、来自胸膜腔的浆液、乳头抽吸物、淋巴、微气管液、肠液、泌尿生殖道液、母乳、精液、腹膜液、囊性瘤液、羊水、或其任意组合。所述生物样品可包含囊泡或可为囊泡自身。
[0043]所述提供生物样品可包括从个体进行血液收集、取样、活组织检查、分离或单离样品。所述提供生物样品可包括从样品分离或单离囊泡。从生物样品分离囊泡可例如使用固体载体或离心力、密度梯度方法、超速离心法、过滤、渗析、使用抗体的免疫亲和层析法、自由流动电泳、或其组合进行。从生物样品分离囊泡可包括将囊泡与例如特异性地结合到所述囊泡的物质或能够插进囊泡的脂双层的物质一起温育。所述温育可在体外进行。在一些实施方式中，从生物样品分离囊泡可包括洗涤。
[0044]所述微RNA的量可使用与选自囊泡中的hsa-miR-126、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa_miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142_3p、hsa-miR-144、hsa_miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa_miR-30c的至少一种微RNA(miRNA)或所述微RNA的片段相同或互补的多核苷酸的探针或引物测量。所述多核苷酸的长度可为，例如，2nt-25nt、3nt-24nt、4nt-23nt、5nt-22nt、6nt-21nt、7nt-20nt、8nt-19nt、9nt_18nt、10nt_17nt、Ilnt_16nt、12nt-15nt、或13nt_14nt。所 述微RNA的量可使用例如定量反转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)测量。
[0045]所述诊断乳腺癌或获得乳腺癌诊断所需的信息的方法可包括将测量的在生物样品中的微RNA的量与对照(例如，测量的在参比(对照)样品的囊泡中的微RNA的量)相比较。
[0046]所述对照样品可为从正常或良性肿瘤患者(阴性对照)获得的样品。或者，所述对照样品可为从乳腺癌患者(阳性对照)获得的样品。所述对照还可由表示在正常或良性患者、或乳腺癌阳性患者库(pool)中的miRNA的量的数据提供。
[0047]所述诊断乳腺癌的方法可包括基于来自所述样品的所述微RNA的量与对照的比较提供乳腺癌诊断。所述提供乳腺癌诊断可包括确定测量的来自所述生物样品的所述微RNA的量是大于还是小于来自对照的所述微RNA的量。例如，相对于阴性对照增加的来自所述生物样品的微RNA的量指示所述受试者中的乳腺癌。阴性对照可为来自不具有乳腺肿瘤或具有良性乳腺肿瘤的受试者的生物样品的微RNA的量。相对于阴性对照增加的来自所述生物样品的微 RNA 的量可为超过约 0.2,0.4,0.5,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0、
2.2,2.4,2.6、或2.8Cp单位的增加。相对于阳性对照样品中的微RNA的量减少的来自所述生物样品(例如囊泡自身)的微RNA的量指示所述受试者中的非乳腺癌的诊断。阳性对照可为来自具有乳腺癌的受试者的生物样品的微RNA的量。相对于阳性对照减少的来自所述生物样品的微 RNA 的量可为 超过约 0.2,0.4,0.5,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0、2.2、2.4、2.6、或2.8Cp单位的减少。
[0048]所述诊断乳腺癌或获得乳腺癌诊断所需的信息的方法可进一步包括:测量所述生物样品(例如囊泡)中的整联蛋白的量；将所述整联蛋白的量与对照(例如，测量的在从阳性或阴性对照分离的囊泡中的整联蛋白的量；或反映在阳性或阴性对照患者样本或这样的样本库中存在的整联蛋白的水平的数据)相比较。所述方法进一步包括:当来自所述生物样品的所述囊泡中的所述整联蛋白的量大于阴性对照或小于阳性对照时，确定所述受试者为乳腺癌患者或具有高的具有乳腺癌的可能性。
[0049]所述整联蛋白的量可使用电泳、蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白芯片、质谱仪、或其组合测量。
[0050]所述诊断乳腺癌或获得乳腺癌诊断所需的信息的方法可为体外方法。所述诊断乳腺癌的方法可进一步包括对根据所述诊断乳腺癌的方法诊断为具有乳腺癌或较高的具有乳腺癌的可能性的受试者给予一种或更多种用于治疗乳腺癌的药物以治疗乳腺癌。所述药物可为对乳腺癌特异性的抗-癌症药物、或与其它癌症药物的组合。
[0051]所述诊断乳腺癌或获得乳腺癌诊断所需的信息的方法可包括将生物样品(例如，囊泡)例如溶解在包含例如离液盐、有机溶剂或表面活性剂的溶剂中。所述将生物样品溶解可例如通过加热、搅拌、旋转、涡旋、或其组合进行。
[0052]现在将参照以下实施例更详细地描述一个或多个实施方式。然而，这些实施例仅用于说明的目的且不意图限制所述一个或多个实施方式`的范围。
[0053]实施例1:乳腺癌特异性蛋白和微RNA标记物
[0054](I)乳腺癌有关的微泡的表面蛋白标记物的筛选
[0055]从20名良性肿瘤患者(作为非乳腺癌患者)和22名乳腺癌患者(乳腺癌，第二期Luminal B型)取样8ml-10ml血液到BD Vacutainer ? Plus塑料全血管中。通过将各血液样品在4°C下以1300xg离心10分钟而从所述样品分离血浆，然后将其在_80°C储存直至使用。在使用之前，将血浆解冻并在约4°C下以约3，OOOxg离心5分钟以除去血浆脂质和细胞碎片，由此在以下试验中使用上清液。
[0056]将所获得的血浆集中并使用具有为血浆样品的3倍体积的PBS缓冲液进行稀释。将经稀释的血浆顺序地在4°C下以2，OOOxg离心30分钟和在4°C下以12，OOOxg离心30分钟。从离心所得物移出离心沉淀，并通过使用0.22 μ m过滤器将上清液过滤。将经过滤的溶液通过使用300kDa截留膜柱(Vivaproducts)浓缩和在4°C下以110，OOOxg超高速离心2小时以获得作为其沉淀物的微泡。
[0057]为了鉴别与正常人相比在乳腺癌患者中微泡中的⑶83、ERBB2和FASL蛋白的量是增加还是减少，测量CD9的量，其为作为内部对照组的微泡标记物。使所获得的沉淀物(即微泡)悬浮在PBS中，将包括十二烷基硫酸锂的pH为8.4的NuPAGE LDS样品缓冲液(LifeTechnologies)和溶解(lysis)缓冲液添加到管中，和通过将所得物在加热块中在95°C下热处理10分钟，所述微泡经历溶解。对溶解产物进行电泳,并对其进行免疫印迹。由免疫印迹的检测通过使用作为第一抗体的兔抗-⑶83抗体(BD Pharminen)、兔抗-ERBB2抗体(R&DSystems)、兔抗-FASL 抗体(BD Pharmingen)和兔抗-CD9 抗体(Novus Biologicals)和作为第二抗体的HRP-缀合的抗-兔抗体进行，且通过使用Las min4000分析发光图像。在免疫印迹的分析结果中，基于对来自两个患者组的微泡的免疫印迹的结果，证明CD83、ERBB2和FASL蛋白在良性肿瘤患者组和乳腺癌患者组之间的量的显著差异。
[0058]因此，乳腺癌特异性微泡可使用抗-CD83抗体(BD Pharmingen)、抗-ERBB2抗体(R&D Systems)、或抗-FASL 抗体(BD Pharmingen)从血液分离。
[0059](2)表面蛋白标记物的确认
[0060]为了确定从良性肿瘤患者和乳腺癌患者各自获得的⑶83、ERBB2或FASL蛋白表达的微泡的量，使用缀合有抗-CD83抗体、抗-ERBB2抗体或抗-FASL抗体的免疫珠从实施例1(1)的血浆分离微泡，并且通过使用特异性结合到CD9蛋白(微泡标记物)的抗-CD9抗体的免疫印迹确定经分离的微泡的量。
[0061]将100ml Dynabeads ? M-270 胺溶液(Life Technologies)置于 Eppendorf 管中并用包含NaCl的MES缓冲液(pH6.0)洗涤。在MES缓冲液中制备聚丙烯酸(PAA) (Aldrich)溶液，并向所述溶液添加作为偶联剂的EDC和NHS。然后使珠子在室温下反应，用MES缓冲液(PH6.0)洗涤，然后再悬浮在包含EDC和NHS的MES缓冲液中。然后，将珠子用MES缓冲液洗涤并在MES缓冲液中与蛋白G溶液反应。在反应之后，向所述溶液添加1.2mg磺基甜菜碱(Aldrich)并温育。在温育之后，将珠子用PBST和PBS洗涤。在PBS溶液(pH7.4)中制备抗-⑶83原液并将其用NaOAc (pH5.0)稀释。将结合了蛋白G的珠子用抗-⑶83溶液(80mg抗-CD83抗体)温育。然后将珠子用硼酸钠缓冲液(pH9.3)洗涤，并使用溶解在硼酸钠缓冲液(PH9.3)中的庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐使所述抗体交联到蛋白G。所述反应通过用乙醇胺洗涤和温育免疫珠而终止。在温育之后，用PBST和PBS洗涤免疫珠。将制备的免疫珠用PBS洗涤并且在PBS中在4°C下储存直至使用。
[0062]在从30名良性肿瘤患者(作为非乳腺癌患者)和30名乳腺癌患者(乳腺癌，第二期，Luminal B型)取样血液之后，如在部分(I)中描述的那样从各血液样品分离血浆，将其使用而不集中。
·[0063]将300 μ I各血浆样品与30 μ I (抗体0.8 μ g/珠子I μ I)的包被有抗-⑶83抗体的珠子在试管(Axygen)中混合,并在用Grant Bio Rotator旋转的同时在室温下温育约4小时。在从反应混合物除去上清液之后，用PBS洗涤珠子。然后将珠子再悬浮于PBS中并在30rpm和室温下再温育3小时。在除去上清液之后，将珠子再悬浮于LDS上样缓冲液(Invitrogen)中并在100°C下沸腾10分钟。如在部分(I)中所描述的那样通过免疫印迹测定来评估CD9蛋白的量。通过非参数威尔科克森(Wilcoxon)秩和检验确定两个组之间的使用抗体分离的微泡中表达的CD9蛋白的量的差异。认为P-值小于0.05的威尔科克森秩和检验的检验结果是统计学上显著的。
[0064]参照图1A-1C，当使用抗-CD83 抗体(BD Pharmingen)、抗-ERBB2 抗体(R&DSystems)或抗-FASL抗体(BD Pharmingen)分离微泡且然后使用抗-0)9抗体(R&DSystems)确定经分离的微泡中的CD9蛋白的量时，在良性肿瘤患者组和乳腺癌患者组之间发现所获得的微泡的量的统计学上显著的差异。该结果表明在微泡的表面上表达或显示⑶83、ERBB2和FASL蛋白，且与良性肿瘤患者组相比，在乳腺癌有关的微泡中⑶83蛋白集中得更多(浓度更高)。
[0065](3)对于乳腺癌有关的微泡的微RNA标记物的筛选
[0066]如在部分(2)中所描述的那样使用结合有抗-CD83抗体的免疫珠从血浆分离微泡，并通过使用miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen)根据制造商的方案提取来自经分离的微泡的 miRNA。
[0067]通过使用Universal cDNA合成试剂盒(Exiqon)将经分离的RNA反转录为cDNA。将所有室温产物与SYBR Green Master Mix以4ml的最终体积混合。将混合物上样到微RNA即用型PCR人嵌板I V2.R的384孔板中。还使用miRCURY LNA UniversalRT microRNA PCR(Exiqon)进行定量反转录-聚合酶链式反应(qRT_PCR)。使用LightCycler480Real-Time PCR System(Roche)根据制造商的指不进行实时 PCR:95°C进行10分钟，随后是95°C进行10秒和60°C进行I分钟的总共45次循环。基于用于比较的qRT-PCR对照校正个体患者中由交叉点(Cp)代表的测量的miRNA的量。qRT_PCR的结果示于图2A和2B中。qRT-PCR结果的分析结果示于下表1中。
[0068][表 I]
【权利要求】
1.用于诊断乳腺癌的组合物，包括 (a)至少一种具有与选自囊泡中的hsa-miR-126、hsa_miR-23a、hsa-miR-24、hsa_miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142_3p、hsa-miR-144、hsa_miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa-miR-30c的微RNA或所述微RNA的片段相同或互补的序列的多核苷酸，和 (b)(i)特异性地结合到所述囊泡的物质、(ii)能够插进所述囊泡的脂双层中的物质、(iii)能够特异性地结合到整联蛋白或其片段的物质、或其组合。
2.权利要求1的组合物，其中所述囊泡为微泡或外来体。
3.权利要求1的组合物，其中所述特异性地结合到所述囊泡的物质为能够结合到囊泡的表面蛋白、脂质、或糖的物质。
4.权利要求3的组合物，其中所述表面蛋白为⑶83、⑶9、EpCAM、小窝蛋白、FasL、HLA-DRA, CD36、CD63、CD81、MUC1、ERBB4、GPER、ERBB2、MLANA、AMHR2、或其组合。
5.权利要求1的组合物，其中所述能够插进所述囊泡的脂双层中的物质包括亲脂性部分、两亲性部分、两性离子部分、或其组合。
6.权利要求1的组合物，其中所述整联蛋白包括整联蛋白α亚基、整联蛋白β亚基、或其组合。
7.权利要求1的组合物，其中所述整联蛋白包括选自如下的多肽:⑶49a、⑶49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、整联蛋白α 8、整联蛋白α 9、整联蛋白α 10、整联蛋白all、CDllD、CD103、CDlla、CDllb、CD51、CD41、CDllc、CD29、CD18、CD61、CD104、整联蛋白 β 5、整联蛋白β 6、整联蛋白β 7和整联蛋白β8。
8.权利要求1的组合物，其中 hsa-miR-126包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列， hsa-miR-23a包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列， hsa-miR-24包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列， hsa-miR-19b包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列， hsa-miR-103包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列， hsa-miR-142-3p包括SEQ ID NO:6的核苷酸序列， hsa-miR-144包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列， hsa-miR-15a包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列， hsa-miR-185包括SEQ ID NO:9的核苷酸序列， hsa-miR-93包括SEQ ID NO: 10的核苷酸序列，和 hsa-miR-30c包括SEQ ID NO: 11的核苷酸序列。
9.包括权利要求1-8任一项的组合物的用于诊断乳腺癌的试剂盒。
10.至少一种多核苷酸在制造用于诊断乳腺癌的试剂或试剂盒中的用途，其中所述至少一种多核昔酸具有与选自 hsa-miR-126、hsa_miR-23a、hsa-miR-24、hsa_miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142_3p、hsa-miR-144、hsa_miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa-miR-30c的微RNA或所述微RNA的片段相同或互补的序列。
11.权利要求10的用途，其中所述多核苷酸与整联蛋白或其片段组合使用。
12.权利要求11的用途，其中所述整联蛋白包括整联蛋白α亚基、整联蛋白β亚基、或其组合。
13.权利要求11的用途，其中所述整联蛋白包括选自如下的多肽:⑶49a、⑶49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、整联蛋白α 8、整联蛋白α 9、整联蛋白α 10、整联蛋白all、CDllD、CD103、CDlla、CDllb、CD51、CD41、CDllc、CD29、CD18、CD61、CD104、整联蛋白 β 5、整联蛋白β 6、整联蛋白β 7和整联蛋白β8。
14.权利要求10的用途，其中 hsa-miR-126包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列， hsa-miR-23a包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列， hsa-miR-24包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列， hsa-miR-19b包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列， hsa-miR-103包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列， hsa-miR-142-3p包括SEQ ID NO:6的核苷酸序列， hsa-miR-144包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列， hsa-miR-15a包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列， hsa-miR-185包括SEQ ID NO:9的核苷酸序列， hsa-miR-93包括SEQ ID NO: 10的核苷酸序列，和 hsa-miR-30c包括SEQ ID NO: 11的核苷酸序列。
15.权利要求1-8任一`项的组合物在制造用于诊断乳腺癌的试剂或试剂盒中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK103865999SQ201310701099
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2012年12月18日
【发明者】朴卿希, 龙声昤, 姜贤珠, 金嘉姬, 朴东贤, 李妙龙 申请人:三星电子株式会社