一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法。本发明设计了ZYC349/ZYC350，ZYC357/ZYC358，ZYC412/ZYC415，ZYC479/ZYC4804对特异性引物，这些引物可用于扩增含有外源绿色荧光蛋白基因，驱动其翻译的柑桔衰退病毒p23基因启动子，进而通过双酶切将连接后的片段插入柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148中p23基因的末端，从而使得柑桔衰退病毒能够作为表达载体在本生烟中稳定、高效的表达绿色荧光蛋白基因达2个月以上。本发明为研究柑桔衰退病毒在植株中的分布、移动，以及将其作为生物反应器大量表达优质蛋白提供了极其重要的技术平台。
【专利说明】一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种病毒的表达载体构建方法，尤其涉及一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法及试剂盒，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]中国的柑桔种植面积和产量均居世界第一。柑桔衰退病毒(Citrus tristezavirus，CTV)引起的柑桔衰退病是一种重要的世界性柑桔病害，通过蚜虫和带病苗木传播。我国广泛分布柑桔衰退病毒的多种强毒株和强力传媒褐色桔蚜，随着20世纪80年代末进行柑桔产业结构调整，柚类和甜橙的种植比例增加，柑桔衰退病对柚类和某些甜橙的为害加剧。
[0003]随着分子生物学技术的发展，农杆菌表达载体和植物病毒载体是当前表达外源基因的两种主要途径载体。与农杆菌表达载体相比，植物病毒载体具有寄主范围广、表达效率高等优点，且大多数植物病毒可通过机械接种进行传播，适于大规模商业操作，除用于获得大量、优质的外源重组蛋白外，植物病毒载体也是反向遗传学中研究基因功能，以及基因沉默现象等的重要工具。由于目前研究中主要使用的基于草本植物病毒的表达载体不能侵染果树，且其稳定性较差，容易丢失插入的外源基因，因此该类载体无法满足果树研究的需要。
[0004]绿色荧光蛋白(GFP)也越来越多的被作为基因表达的标记物用于科研的各个领域，其产物GFP对细胞无毒性，且检测简单，不用任何底物或者其他辅助物即可以在荧光显微镜下直接观察到荧光，极大地方便了基因表达水平的检测与定位等。
【发明内容】
[0005]针对我国现有基于果树病毒的表达载体研究不足的问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法。
[0006]本发明所提供的柑桔衰退病毒的表达载体构建方法，包括以下步骤:
[0007]I)提取病株中柑桔衰退病毒的总RNA ；
[0008]2)以上述总RNA为模板，用引物ZYC357/ZYC358扩增启动子，用引物ZYC412/ZYC415和ZYC479/ZYC480分别扩增柑桔衰退病毒基因组的片段I和片段2，所述的引物核苷酸序列分别为:
[0009]ZYC357:5’ -TACGCGATTTGGGTAAGTACCTATAGCAATTACAGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACT-3，
[0010]ZYC358:5’ -ACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATGGACGACGAA ACAAAGAAATTGAAGA-3’
[0011]ZYC412:5’ -GCCTCTTAGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCAGTG-3，
[0012]ZYC415:5’ -CGAGAAGTCCTACCACTTTATAGTTGGCCTTTA-3，
[0013]ZYC479:5’ -CAAAC CATGCGAGCTTACTTTAGTATG-3’[0014]ZYC480:5’ -ATTCCCGGGGGTGATTTTGGGTTTAGAC-3’
[0015]3)用含有绿色荧光蛋白的质粒和特异引物ZYC349/ZYC350扩增绿色荧光蛋白基因，引物ZYC349/ZYC350序列为:
[0016]ZYC349:5’ -AGTTCTTCTCCTTTGCTAGCCATCTGTAATTGCTATAGGTACTTACCCAAATCGCGTA-3’
[0017]ZYC350: 5，-AGAGCTAATGTGGGTAGTTGAGTCAGGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3，
[0018]4)将步骤2、3中获得的启动子、片段1、片段2和绿色荧光蛋白基因的扩增产物经切胶纯化后，分别与载体进行链接、转化，并对获得的菌液进行质粒纯化；
[0019]5)取步骤4中的纯化后分别含启动子和片段2的质粒混合,通过overloop PCR进行连接，正反向引物为ZYC479/ZYC358，从而得到35S-127，并进行浓缩；将纯化后分别含片段I和绿色荧光蛋白基因的质粒进行混合，通过overloop PCR进行连接，正反向引物为ZYC349/415，从而得到35S-126 ;将浓缩后的35S-126和35S-127混合，再次通过overloopPCR进行连接，正反向引物为ZYC479/ZYC415，从而得到35S-128，并进行浓缩；
[0020]6)取步骤5中所述浓缩后的35S-128与柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148分别进行StuI/PacI双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，进行切胶回收，纯化后的酶切产物混合并进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后从而得到柑桔衰退病毒的表达载体35S-149。
[0021]所述步骤2中的启动子为柑桔衰退病毒p23基因启动子，所述片段I为柑桔衰退病毒基因组19025-19296nt的区域，片段2为柑桔衰退病毒基因组17261_19024nt的区域；所述扩增反应条件为:94°C 2min ；45°C 30min ；92°C Imin ；92°C 20sec，55°C 20sec,68°C 2min循环35次，最`后68°C延伸lOmin。
[0022]所述步骤3 中的扩增反应条件为:94°C 2min ；94°C 30sec, 58°C 45sec, 72°C Imin循环35次，最后72°C延伸lOmin。
[0023]所述步骤4中的克隆载体为PMD18-T，所述步骤4和6中的感受态细胞为JM109。
[0024]所述步骤5中启动子和片段2连接反应条件为94°C2min ；94°C 30sec, 58°C 45sec,72°C 2min循环35次；最后72°C延伸IOmin ;所述步骤5中片段I与绿色荧光蛋白质粒连接反应条件为 94°C 2min ；94°C 30sec, 58°C 45sec, 72°C 2min 循环 35 次；最后 72°C延伸 IOmin ；所述步骤 5 中 35S126 与 35S-127 的连接反应条件为 94°C 2min ；94°C 30sec，58°C 45sec,72°C 4min循环35次；最后72°C延伸IOmin。
[0025]所述步骤6中的柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148的获得，包括以下步骤:
[0026]I)提取柑桔病株中柑桔衰退病毒分离株FS-577的总RNA ；
[0027]2)以所述总RNA为模板，用随机引物反转录合成第一链cDNA ；
[0028]3)用柑桔衰退病毒分离株FS-577的全序列设计的6对特异性引物，分段扩增所述步骤2中第一链cDNA的6个片段:cDNA片段I~6，所述的特异性引物的核苷酸序列分别为:
[0029]弓丨物I上游引物序列ZYC214:
[0030]5， -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3，；
[0031]弓丨物I下游引物序列ZYC1293:
[0032]5， -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3，；[0033]引物2上游引物序列ZYC749:
[0034]5’ -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3’ ；
[0035]弓丨物2下游引 物序列ZYC1894:
[0036]5， -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3，；
[0037]弓丨物3上游引物序列ZYC253:
[0038]5’ -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3’ ；
[0039]弓丨物3下游引物序列ZYC1436:
[0040]5， -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3，；
[0041]引物4 上游引物序列 ZYC126:5’ -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3’ ；
[0042]弓丨物4下游引物序列ZYC1493:
[0043]5， -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3，；
[0044]弓丨物5上游引物序列ZYC431:
[0045]5’ -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3’ ；
[0046]弓丨物5下游引物序列ZYC1478:
[0047]5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，；
[0048]弓丨物6上游引物序列ZYC2158:
[0049]5’ -CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3’ ；
[0050]引物6 下游引物序列 ZYCl 14:5’ -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3’ ；
[0051]4)将步骤3中扩增得到的cDNA片段I与双元载体pUC119_ Λ 9分别进行PmeI/PstI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-143 ;将35S-143与cDNA片段2分别进行Pstl/Swal双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S-144 ;将35S-144与cDNA片段3分别进行Xmal/Pmel双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-145 ;将35S-145与cDNA片段4分别进行XmaI/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-146 ;将35S-146与cDNA片段5分别进行Rsr II/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S-147 ;将35S-147与cDNA片段6分别进行Rsr II/AscI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148。
[0052]本发明还提供了一种柑桔衰退病毒的表达载体构建试剂盒，包括:
[0053]I)柑桔衰退病毒的表达载体构建的4对特异性引物:
[0054]ZYC357:5’ -TACGCGATTTGGGTAAGTACCTATAGCAATTACAGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACT-3，
[0055]ZYC358:5’ -ACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATGGACGACGAA ACAAAGAAATTGAAGA-3’
[0056]ZYC412:5’ -GCCTCTTAGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCAGTG-3’
[0057]ZYC415:5’ -CGAGAAGTCCTACCACTTTATAGTTGGCCTTTA-3’
[0058]ZYC349:5’ -AGTTCTTCTCCTTTGCTAGCCATCTGTAATTGCTATAGGTACTTACCCAAATCGCGTA-3’[0059]ZYC350:5’ -AGAGCTAATGTGGGTAGTTGAGTCAGGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3，
[0060]ZYC479:5’ -CAAAC CATGCGAGCTTACTTTAGTATG-3’
[0061 ] ZYC480: 5，-ATTCCCGGGGGTGATTTTGGGTTTAGAC-3，
[0062]所述的柑桔衰退病毒的表达载体构建试剂盒，还包括:2X —步法缓冲液:200mMρΗ8.8Tris-HCl，IOOmM(NH4)2S04，IOOmM KCl，20mM MgSO4,l%Triton X-100,IOmM dNTP,0.02M DTT，10 μ M正反向引物。
[0063]10XPCR 缓冲液:200mM pH8.8Tris-HCl, IOOmM(NH4)2S04, IOOmM KCl,20mM MgSO4,l%Triton?X-100, IOmM dNTP, 10 μ M 正反向引物。
[0064]双酶切缓冲液:100XBSA，IOmMBis-Tris-Propane-HCl, IOmM MgCl2, ImMDTT。
[0065]链接缓冲液:0.5M Tris-HCl pH7.8,0.1M MgCl2, 50mM DTT,5mM ΑΤΡ,Ο.25mg/LBSA,2% ~3%PEG3500。
[0066]裂解液I:2mg/ml 溶菌酶，IM ρΗ8.0Tris HCl，0.5Μ EDTA0
[0067]裂解液I1:0.2Μ NaOH, 1%SDS。
[0068]有益效果:本发明公开了一种基于柑桔衰退病毒的表达载体构建方法，为提高柑桔衰退病毒表达载体对外源基因的表达量和稳定性，发明人根据柑桔衰退病毒蛋白表达策略的特殊性，设计了 ZYC349/ZYC350，ZYC357/ZYC358，ZYC412/ZYC415 和 ZYC479/ZYC4804 对特异性引物，这些引物可用于扩增含有外源绿色荧光蛋白基因和驱动其翻译的柑桔衰退病毒p23基因启动子序列，以及柑桔衰退病毒基因组中19025-19296nt和17261_19024nt的区域，并通过overloop PCR`将这四个片段连接起来，进而通过双酶切将连接后的片段插入到柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148基因组19024nt的位置，从而使得柑桔衰退病毒能够作为表达载体在本生烟中稳定、高效的表达绿色荧光蛋白基因达2个月以上。本发明为研究柑桔衰退病毒在植株中的分布、移动，以及将其作为生物反应器大量表达优质蛋白提供了极其重要的技术平台。
【专利附图】
【附图说明】
[0069]图1为本发明本生烟接种柑桔衰退病毒的表达载体后检测结果图；A:白光照射；B:紫外激发荧光
[0070]图2为本发明本生烟接种柑桔衰退病毒的表达载体后提取的总蛋白溶液;A:白光照射:紫外激发荧光
【具体实施方式】
[0071]本发明中的DTT为Dithiothreitol的简称，中文名称为二硫苏糖醇(鼎国，中国)。Triton X-100中文名称为聚乙二醇辛基苯基酿(鼎国，中国)。Bis-Tris-Propane为1，3- 二 [三(轻甲基)甲氨基]丙烷(Sigma，美国)，用HCl调节为ρΗ7.8，得到Bis-Tris-Propane-HCl。ATP 为 Adenosine Triphosphate 的简称，中文名称为三憐酸腺苷(鼎国，中国)。EDTA为Ethylene Diamine Tetraacetic Acid的简称，中文名称为乙二胺四乙酸(鼎国，中国)。SDS为Sodium lauryl sulfate的简称，中文名称为十二烷基硫酸钠(鼎国，中国)。BSA为bovine serum albumin,中文名称为小牛血清白蛋白(Bio Basic Inc,加拿大)。溶菌酶为来源于鸡蛋白的溶菌酶(Sigma，美国)。PEG3500为聚乙二醇(Sigma，美国)。
[0072]柑桔衰退病毒分离株FS-577的全序列公布在NCBI网站上，ID号为KC517488.1。
[0073]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明:
[0074]实施例一、柑桔衰退病毒分离株FS-577的鉴定、分离和保存
[0075](I)柑桔衰退病毒的鉴定、分离
[0076]从田间植株的四个不同方向采集已经老熟且带有叶片的枝条。采用直接组织点免疫的方法进行检测，具体操作如下:用剃须刀片横切样品的茎干或叶柄，随即均匀地压在硝酸纤维素膜上，并设置正负对照，室温下干燥15min以上。将印迹膜置于含1%BSA的0.02M, pH7.2 的磷酸缓冲液(0.13M NaCl, 0.02M Na2HPO4.12H20,14mM KH2PO4, 20mM KCl,20mM NaN3)中封闭Ih后直接加入1000:1 (v/v)碱性磷酸酯酶(Ap)标记的CTV专化抗体IgG (BioRad，美国)中，在室温下摇动反应2h。倒去含Ap-1gG的缓冲液，加入磷酸吐温缓冲液(0.13M NaCl, 0.02M Na2HPO4.12H20,14mM KH2PO4, 20mM KCl,20mM NaN3,0.5%吐温-20)洗膜3次，每次在室温下摇动反应5min。倒出磷酸吐温缓冲液，依次加入5ml碱性磷酸缓冲液(1M Tris-base, 0.15M NaCl, 0.34M MgCl2), 1.7 μ g 氣化硝基四氣唑蓝(Promega,美国)和0.85 μ g5-溴-4-氯_3_ Π引哚基-磷酸盐(Promega,美国),在室温下避光摇动15min后，用蒸馏水冲洗硝酸纤维素膜终止反应。通过观察待测样品的叶柄或枝条在硝酸纤维素膜上的印记是否与正对照一样在其韧皮部处出现了黑褐色环状物的方式来判断植株是否感染 了柑桔衰退病毒。如果在韧皮部出现了黑褐色环状物，则说明感染了柑桔衰退病毒。
[0077]由于柑桔衰退病毒FS-577属于T36基因型，因此使用Hilf M E等
[0078](Phytopathology, 2005)发表的针对T36基因型柑桔衰退病毒的外壳蛋白基因、5’非翻译区、K17和POL的特异性引物对T36CP (正向引物:5’ -ATGGACGACGAAACAAAGAAATTG-’ 3，反向引物:5’ -TCAACGTGTGTTGAATTTCCCA-3’)，T36-5(正向引物:5’ -AATTTCACAAATTCAACCTG-3’，反向引物:5’ -CTTTGCCTGACGGAGGGACC-3’)，T36K17F (正向引物:5’ -GTTTTCTCGTTTGAAGCGGAAA-3’，反向引物:5’ -CAACACATCAAAAATAGCTAGT-3’)，T36P0L (正向引物:5’ -TGACGCTAACGACGATAACG-3’，反向引物:5’ -ACCCTCGGCTTGTTTTCTTATG-3’)进行鉴定。具体操作如下:使用RNAisoplus试剂盒(Takara，日本)提取感染了柑桔衰退病毒的植株叶片中的总RNA。I μ L总RNA在95°C下变性3min后置于冰上，并混入4μ L水，40 μ L2X反应缓冲液(200mM pH8.8Tris_HCl，IOOmM(NH4)2SO4, IOOmM KCl，20mM MgSO4, l%Triton X-100, IOmM dNTP，0.02M DTT，5mMMgCl2，10mM正反向引物)，lyL RT/Taq 酶(Invitrogen，美国)。反应条件为:42°C,20min,94°C, lmin, [94°C, 30sec,45°C, 30sec, 72°C,60sec]循环 35 次，72°C，5min。RT-PCR 产物经切胶纯化后取I μ L纯化产物，与I μ L平末端载体pSMPLE-19EcoR V/BAP (Takara,日本)，2 4 1^水，5“1^链接缓冲液(300通 pH7.8Tris-HCl, IOOmM MgCl2, IOOmM DTT，IOmM ATP),I μ L3U/ μ L T4DNA连接酶(Promega，美国)混合，16°C反应30min，加入50 μ L感受态细胞JM109 (Promega，美国)轻轻混匀，冰上放置30min。42°C水浴热激90sec，冰浴2min。沿管壁轻轻加800 μ L室温平衡后的LB液体培养基(l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)，37°C，150rpm复苏培养lh。吸取50 μ L菌液涂布于含抗生素的LB培养基(0.1%氨苄青霉素，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)中。37 °C过夜培养。挑取单个白斑在Iml LB液体培养基(l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)中37°C，150rpm培养10h。按照质粒纯化试剂盒(Takara，日本)纯化质粒。纯化方法参照试剂盒操作说明书，在此不做赘述。对分别插入到质粒中的4个PCR片段进行测序分析。如果上述4个PCR片段分别与NCBI数据库中ID号为KC517488.1序列中的外壳蛋白基因、5’端区域、K17区域和POL区域的序列都完全匹配时，则可确认分离到了柑桔衰退病毒分离株FS-577。
[0079](2 )柑桔衰退病毒FS-577的保存:
[0080]将田间感染了 FS-577的植株枝条的皮和芽嫁接于锦橙实生苗。每株锦橙实生苗上腹接毒源植株枝条的一个芽和两块皮，并各设立3株作为正负对照，接种后保存在网室中。每半个月观察一次，若发现有接芽或接皮死亡，需立即补接，至少每株有两块皮存活。每隔一个月施用一次复合肥。接种3个月后步骤I用“柑桔衰退病毒的鉴定、分离”中的直接组织点免疫方法检测FS-577是否保存成功。
[0081]实施例二、一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法，按照以下步骤操作:
[0082](I)总RNA提取:采用Trizol试剂盒(Invitrogen,美国)提取病株中柑桔衰退病毒分离株FS-577的总RNA。提取方法参照Trizol试剂盒操作说明书，在此不做赘述。
[0083](2)第一链cDNA的合成:将8 μ L提取的总RNA，与I μ L50ng/ μ L随机引物(Promega公司，美国)，I μ LlOmM dNTP混合后65°C下反应5min,冰上放置lmin。随后在此反应液中加入 10μ LlOX 反转录缓冲液(IOOmM pH9.0Tris-HCl, 500mM KCl, l%TritonX-100, IOmM MgC12，0.02M DTT)，4U RNaseOUT (Invitrogen，美国)，2U SuperScript IIIRT (Invitrogen，美国)。混匀后分别在25°C下反应lOmin，50°C下反应50min，85°C下反应5min。随后在冰上至少放置lmin再加入I μ L2U/ μ L RnaseH (Invitrogen,美国),在37。。下反应20min终止反应。-20°C保存。
`[0084](3) cDNA片段的扩增:根据NCBI已公布的柑桔衰退病毒FS-577全序列(ID号KC517488.1)设计 6 对特异性引物 ZYC214/ZYC1293, ZYC749/ZYC1894, ZYC253/ZYC1436,ZYC126/ZYC1493, ZYC431/ZYC1478和ZYC2158/ZYC114，从而依次合成柑桔衰退病毒分离株FS-577 全序列上 PmeI 到 PstI (cDNA 片段 I), PstI 到 SwaI (cDNA 片段 2)，PmeI 到 XmaI(cDNA 片段 3)，XmaI 到 Bsu36I (cDNA 片段 4)，Rsr II 到 Bsu36I (cDNA 片段 5)和 Rsr II到AscI (cDNA片段6)的序列。200 μ L扩增体系中含有140 μ L10XPCR缓冲液(200mMpH8.8Tris-HCl,IOOmM(NH4)2S04,IOOmM KCl,20mM MgS04,l%TritoniX-100,IOmM dNTP),10 μ M正反向引物，2 μ L4U/μ L Vent DNA聚合酶(ΝΕΒ，美国)，50 μ L水和4 μ L第一链cDNA。其中 cDNA 片段 I 使用引物 ZYC214/ZYC1293，cDNA 片段 2 使用引物 ZYC749/ZYC1894，cDNA片段3使用引物ZYC253/ZYC1436，cDNA片段4使用引物ZYC126/ZYC1493，cDNA片段5使用引物 ZYC431/ZYC1478，cDNA 片段 6 使用引物 ZYC2158/ZYC114。反应条件为 94°C，2min，[94°C，30sec，58°C，45sec，72°C，4min]循环 35 次，最后在 72°C延伸 lOmin，终止反应。
[0085]所述的根据柑桔衰退病毒分离株FS-577全序列设计的6对特异引物序列如下:
[0086]弓丨物I上游引物序列ZYC214:
[0087]5， -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3，；
[0088]弓丨物I下游引物序列ZYC1293:
[0089]5， -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3，；
[0090]弓丨物2上游引物序列ZYC749:
[0091]5’ -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3’ ；[0092]弓丨物2下游引物序列ZYC1894:
[0093]5， -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3，；
[0094]弓丨物3上游引物序列ZYC253:
[0095]5’ -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3’ ；
[0096]弓丨物3下游引物序列ZYC1436:
[0097]5’ -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3’ ；
[0098]引物4 上游引物序列 ZYC126:5’ -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3’ ；
[0099]弓丨物4下游引物序列ZYC1493:
[0100]5， -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3，；
[0101]引物5上游引物序列ZYC431:
[0102]5’ -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3’ ；
[0103]弓丨物5下游引物序列ZYC1478:
[0104]5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，；
[0105]弓丨物6上游引物序列ZYC2158:`[0106]5’ -CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3’ ；
[0107]引物6 下游引物序列 ZYCl 14:5’ -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3’ ；
[0108](4) PCR 产物的浓缩:200 μ L cDNA 片段 I 的 PCR 产物加入 20 μ L3M pH5.2Na0Ac和200 μ L无水乙醇。充分混匀后置于-80°c中15分钟。12000rpm离心lOmin，去除上清。加入700 μ L70%乙醇清洗、干燥后用87 μ L双蒸水溶解待用。同样的方法用于浓缩其余的cDNA 片段 2-6。
[0109](5)改造PUC119获得双元载体pUC119-A9:在华大基因公司(中国)合成2条双链DNA片段:多克隆位点I (其为ASC1-RSrI1-BSu361-XmaI酶切位点的序列:5’ -AGGCGCGCCTGCWGGWCCG CCTNAGGCCCCCGGGGG-3’，及相应的互补链)和多克隆位点 2 (为Xmal-Pmel-Pst1-Swa1-SacI 酶切位点的序列:CCCCCCGGGGGGITTAAACCTGCACTGCAGTGCAITTAAATTCCGAGCTCGGA，W:A/T, N:A/C/G/T)以及相应的互补链，由此构成双链的多克隆位点I和双链的多克隆位点2。
[0110]将5 μ g多克隆位点I的双链DNA与25 μ L pUC119(Promega，美国)分别进行AscI/XmaI双酶切。酶切体系为限制性内切酶AscI (NEB，美国)和XmaI (NEB，美国)各10U，10 μ L双酶切缓冲液(100 X BSA，IOmMBis-Tris-Propane-HCl, IOmM MgCl2, ImM DTT)，其余用水将总体积定为100 μ L0 37°C下反应过夜。多克隆位点I和PUC119经Ascl/Xmal双酶切后进行1%琼脂糖凝胶电泳，用20 μ L水溶解切胶回收、纯化后的双酶切产物，并取15.5 μ L混入
3.5μ L链接缓冲液(300mM pH7.8Tris-HCl, IOOmM MgCl2, IOOmM DTT，IOmM ΑΤΡ)，I μ L3U/μ L T4DNA连接酶(Promega，美国)。16°C下反应过夜。链接液中加入50 μ L感受态细胞JM109 (Promega，美国)，冰上放置30min，42°C水浴热激90sec后，冰浴2min，加入400 μ LLB液体培养基(l%NaCl,0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)，37°C，150rpm复苏培养Ih，菌液涂布于含卡那霉素的LB培养基(0.1%卡那霉素，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，1.5%琼脂粉)中，37°C培养过夜。挑取阳性克隆置于40ml含卡那霉素的LB培养基(0.1%卡那霉素，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)中，37°C，220rpm，过夜培养。
[0111]提取上述菌液中的质粒并进行纯化:将上述培养过夜的菌液4°C，4000rpm离心15min，用 3ml 裂解液 I (2mg/ml 溶菌酶，IM pH8.0Tris HCl，0.5M EDTA)溶解沉淀，并依次加入 6ml 裂解液 II (0.2M NaOH，1%SDS)，和 3.75ml3M pH5.8NaOAc。12000rpm 离心 15min后在上清中加入20 ii LlOOmg/ml RnaseA。37°C处理30min。取上清，并加入等体积95%冰乙醇，-20°C过夜。4°C 1000Orpm离心lOmin。70%乙醇清洗沉淀。沉淀干燥后用300 y L水溶解，从而得到pUC119- A 7。通过测序进行验证。
[0112]5u g多克隆位点2的DNA与25 ii LpUCl 19-A 7分别进行Xmal/SacI双酶切。双酶切时，除限制内切酶为XmaI (NE B，美国)和SacI (NEB，美国)各IOU外，其余酶切体系与多克隆位点I和PUC119双酶切时相同。此外，后续的切胶纯化、链接、转化反应和质粒的纯化方法都与获得PUC119- A 7时的方法一致。由此得到改造后的载体pUC119- A 9，通过测序进行验证。
[0113](6)35S-143的获得:将25iiL pUC119_ A 9载体与浓缩后的87 y L cDNA片段I分别进行Pmel/PstI双酶切。双酶切时，除限制性内切酶为PmeI (NEB，美国)和PstI (NEB，美国)各IOU外，其余酶切条件与步骤5中的双酶切条件一致。后续的切胶纯化、链接、转化反应和质粒纯化方法也与步骤5中的方法相同。从而将cDNA片段I插入到pUC119-A9中，由此得到35S-143。
[0114](7) 35S-144的获得:取20 u L35S-143与浓缩后87 y L的cDNA片段2分别进行Pstl/Swal双酶切。双酶切时，除限制性内切酶为PstI (NEB，美国)和SwaI (NEB，美国)各IOU外，双酶切体系与步骤5中的相同。此外，后续的切胶纯化、链接、转化反应和质粒纯化方法也与步骤5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段I和2的35S-144。
[0115](8) 35S-145的获得:取20 u L35S-144与浓缩后87 y L的cDNA片段3分别进行Xmal/Pmel双酶切。双酶切时，除限制性内切酶为XmaI (NEB，美国)和PmeI (NEB，美国)各IOU外，双酶切体系与步骤5中的相同。此外，后续的切胶纯化、链接、转化反应和质粒纯化方法也与步骤5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1-3的35S-145。
[0116](9) 35S-146的获得:取20 u L35S-145与浓缩后87 y L的cDNA片段4分别进行XmaI/Bsu36I双酶切。双酶切时，除限制性内切酶为XmaI (NEB，美国)和Bsu36I (NEB，美国)各IOU外，双酶切体系与步骤5中的相同。此外，后续的切胶纯化、链接、转化反应和质粒纯化方法也与步骤5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1-4的35S-146。
[0117](10) 35S-147的获得-M 20UL35S-146与浓缩后87 y L的cDNA片段5分别进行RsrII/Bsu36I双酶切。双酶切时，除限制性内切酶为RsrII/Bsu36I各IOU外，双酶切体系与步骤5中的相同。此外，后续的切胶纯化、链接、转化反应和质粒纯化方法也与步骤5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1-5的35S-147。
[0118](11) 35S-148的获得:取20UL35S-147与浓缩后87 y L的cDNA片段6分别进行RsrII/AscI双酶切。双酶切时，除限制性内切酶为Rsr II (NEB，美国)和AscI (NEB，美国)各IOU外，双酶切体系与步骤5中的相同。此外，后续的切胶纯化、链接、转化反应和质粒纯化方法也与步骤5中的方法相同。由此得到含有cDNA片段1-6的35S-148，即柑桔衰退病毒全长克隆35S-148。
[0119]将获得的全长侵染性克隆35S-148测序，到NCBI网站与野生型FS-577序列(ID号KC517488.1)进行Blast比对，序列完全一致。
[0120]实施例三、一种柑桔衰退病毒表达载体构建方法，按照以下步骤操作:[0121](I)柑桔衰退病毒的鉴定、获得。
[0122]按照实施例1中的直接组织点免疫方法在田间筛选出感染了柑桔衰退病毒的植株。
[0123](2)总RNA提取。采用Trizol试剂盒(Invitrogen,美国)提取直接组织点免疫法确定感染了柑桔衰退病毒病株的总RNA。提取方法参照Trizol试剂盒操作说明书，在此不做赘述。
[0124](3)启动子、片段I和片段2的扩增。将8iiL提取的总RNA在95°C下解链2min后，与 190iiL2X —步法缓冲液(200mM pH8.8Tris-HCl, IOOmM (NH4) 2S04, IOOmM KCl,20mMMgSO4, l%Triton X-100，IOmM dNTP，0.02MDTT), IOuM 正反向引物(引物 ZYC357/ZYC358 用于扩增p23基因的启动子，引物ZYC412/ZYC415和ZYC479/ZYC480分别用于扩增柑桔衰退病毒基因组19025-19296nt,以及17261_19024nt区域的片段I和片段2,2u L2.5U/ u LRT/Taq 混合酶混合。反应条件为 94°C，2min, 45°C，30min ；92°C，Imin ； [92°C，20sec ；55°C,20sec ；68°C,2min]循环 35 次，最后 68°C，lOmin。所述引物 ZYC357 序列为:5，_TACGCGATTTGGGTAAGTACCTATAGCAATTACAGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACT-3，；
[0125]ZYC358 序列为:
[0126]5， -ACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATGGACGACGAA ACAAAGAAATTGAAG A_3，；
[0127]ZYC412 序列为:
[0128]5’ -GCCTCTTAGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCC
[0129]CAGTG-3，；
[0130]ZYC415 序列为:5’ -CGAGAAGTCCTACCACTTTATAGITGGCCTTTA-3’ ；ZYC479 序列为:5’ -CAAAC CATGCGAGCTTACTTTAGTATG-3’ ；
[0131]ZYC480 序列为:5 ’ -ATTCCCGGGGGTGATTTTGGGTTTAGAC-3 ’。
[0132](4)绿色荧光蛋白基因的扩增。200111扩增体系中含有14011110\?0?缓冲液(200mM pH8.8Tris-HCl, IOOmM(NH4)2S04, IOOmM KCl,20mM MgS04, l%Triton X-100, IOmMdNTP), IOuM 正反向引物 ZYC349/ZYC350,1 u L2U/ u LPrimeStar HS DNA 聚合酶(Takara，日本)，51iiL水和8iiL含有绿色荧光蛋白基因的质粒pCMV-GFP (Addgene，美国)。反应条件为 94°C，2min，[94°C, 30sec, 58°C, 45sec, 72°C, lmin]循环 35 次，最后 72°C，lOmin。所述引物 ZYC349 序列为:5’ -AGTTCTTCTCCTTTGCTAGCCATCTGTAATTGCTATAGGTACTTACCCAAATCGCGTA-3，；
[0133]ZYC350 序列为:
[0134]5’ -AGAGCTAATGTGGGTAGTTGAGTCAGGATGGCTAGCAAAGGA
[0135]GAAGAACTTTTCA-3，。
[0136](5)启动子、片段I和绿色荧光蛋白基因的克隆、纯化。将步骤3、4中获得的p23基因的启动子、片段I和绿色荧光蛋白基因的扩增产物分别经切胶纯化后，各取2 y L纯化产物与I U L平末端载体pSIMPLE-19EcoR V/BAPCTakara,日本)，3.5 y L水，5 y L链接反应液(0.5M Tris-HCl pH7.8,0.1M MgCl2,50mMDTT, 5mM ATP,0.25mg/L BSA，2%~3%PEG3500)，I u L3U/ u L T4DNA连接酶(Promega，美国)混合。16°C过夜。将连接液与50 y L感受态细胞JM109 (Promega，美国)轻轻混匀，冰上放置30min。42°C水浴热激90sec，冰浴2min。沿管壁轻轻加800 u L室温平衡后的LB液体培养基(l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)，37°C，150rpm复苏培养lh。吸取50uL菌液涂布于含抗生素的LB培养基(0.1%氨苄青霉素，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨冲。37 °C过夜培养。挑取单个白斑在1ml LB液体培养基(l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)中37°C，150rpm培养10h。按说明书，使用微量质粒纯化试剂盒(Takara,日本)纯化质粒。
[0137](6)启动子与片段2的连接。在200u L反应体系中含有:步骤5中纯化后分别含启动子和片段2的质粒各4 u L，140 u LlO X PCR缓冲液(200mM pH8.8Tris_HCl，1OOmM(MM)2SO4，1OOmM KCl,20mM MgSO4, l%Triton?X-100, IOmM dNTP)，10uM 正反向引物ZYC479/ZYC358,1.5 u L2U/ u L Vent DNA 聚合酶(NEB，美国)和 50.5uL 水。反应条件为94°C，2min，[94°C，30sec，58°C，45sec，72°C，2min]循环 35 次，最后 72°C，lOmin。终止反应。从而将启动子与片段2连接在一起，得到35S-127。
[0138](7) 35S-127 的浓缩。200u L35S-127 的 PCR 产物加入 20 uL3M pH5.2Na0Ac 和200uL无水乙醇。充分混匀后置于_80°C中15分钟。12000rpm离心lOmin，去除上清。加A 700 u L70%乙醇清洗、干燥后用50uL双蒸水溶解待用。
[0139](8)片段1与绿色荧光蛋白的连接与浓缩。按照步骤5的方法，在200 uL反应体系中含有:纯化后分别含有片段I和绿色荧光蛋白质粒各4 uL，140 u HO X PCR缓冲液(200mMpH8.8Tris-HCl, 1OOmM(NH4)2SO4, lOOmM KCl,20mM MgSO4, l%Triton?X-100, 1OmM dNTP, 1Ou M正反向引物2￥0349/415)，1.51u2U/uL Vent DNA 聚合酶(NEB，美国)和 50.5u L 水。反应条件为 94°C，2min, [94°C，30sec, 58°C，45sec, 72°C，2min]循环 35 次，最后 72°C，1Omin0从而将35S-127与绿色荧光蛋白连接在一起，得到35S-126。按照步骤7的方法进行浓缩。
[0140](9) 35S-126与35S-127的连接和浓缩。在200uL反应体系中含有:步骤7、8中浓缩后的 35S-126 和 35S-127 各 L，140 u LlOXPCR 缓冲液(200mM pH8.8Tris_HCl，1OOmM(MM)2SO4，1OOmM KCl,20mM MgSO4, l%Triton X-100, IOmM dNTP)，10u M 正反向引物ZYC479/ZYC415,1.5 u L2U/ u L Vent DNA 聚合酶(NEB，美国)和 50.5u L 水。反应条件为94°C 2min ； [94°C 30sec，58°C 45sec，72°C 4min]循环 35 次；最后 72°C延伸 lOmin，从而得到35S-128。按照步骤7的方法进行浓缩。
[0141](10)柑桔衰退病毒表达载体的构建。将50iiL浓缩后的35S-128与2iig柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148分别进行StuI/PacI双酶切。双酶切反应液为，1OU/u L限制性内切酶StuI (NEB，美国)和PacI (NEB，美国)各1 uL，10 uL双酶切缓冲液(100XBSA，1OmM Bis-Tris-Propane-HCl, 1OmM MgCl2, ImMDIT)，用水补足到 100u L。37°C下反应过夜。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收、纯化后用20yL水进行溶解。溶解后混入
3.L链接缓冲液(0.5M Tris-HCl pH7.8,0.1M MgCl2, 50mM DTT,5mM ATP，0.25mg/L BSA,2% ~3%PEG3500)和 luL3U/uL T4DNA 连接酶(Promega，美国)。15°C下反应过夜。链接液中加入50 u L感受态细胞JM109 (Promega，美国)，冰上放置30min，42°C水浴热激90sec后，冰浴2min，加入400 uL LB液体培养基(l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)，37°C，150rpm复苏培养lh，菌液涂布于含抗生素的LB培养基(0.1%卡那霉素，l%NaCl,0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，1.5%琼脂粉)中，37°C培养过夜。挑取阳性克隆置于40ml含抗生素的LB培养基(0.1%卡那霉素，l%NaCl,0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)中，37°C，220rpm,培养2d。
[0142](11)表达载体的纯化。步骤9中的菌液在4°C,4000rpm离心15min,用3ml裂解液I (2mg/ml溶菌酶，IM pH8.0Tris HC1,0.5M EDTA)溶解沉淀，并依次加入6ml裂解液II (0.2M NaOH，1%SDS)和 3.75ml3M pH5.2NaOAc。12000rpm 离心 15min 后在上清中加入20 u L100mg/ml RnaseA。37°C处理30min。取上清，并加入等体积95%冰乙醇，_20°C过夜。40C 1000Orpm离心lOmin。70%乙醇清洗沉淀。沉淀干燥后用300 y L水溶解，从而得到基于柑桔衰退病毒的表达载体35S-149。
[0143]实施例四、基于柑桔衰退病毒的表达载体35S-149的应用实例。具体操作如下:
[0144]分别将35S-149，沉默抑制子pl9和p24各2 y g加入到50 y L农杆菌EHA105感受态细胞中，37°C热激5min，冰上放置5min后加入Iml LB培养基(l%NaCl，0.5%酵母提取物，1% 胰蛋白胨)，28°C，220rpm 摇动生长 4h。菌液 4000rpm 离心 5min，用 100 u L LB(l%NaCl,
0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)溶解沉淀，并涂布于含抗生素的LB培养基(0.1%卡那霉素，
0.1%利福平，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，1.5%琼脂粉)，28°C生长2天。挑单斑在5ml LB培养基(0.1%卡那霉素，0.1%利福平，l%NaCl，0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨)中28 0C，220rpm摇动生长1-2天。取50 yl菌液接种到IOml LB (l%NaCl，0.5%酵母提取物，1% 胰蛋白胨，IOmM pH5.85MES，20 u M 乙酰丁香酮，50 u g/ml
[0145]卡拉霉素,50 ii g/ml利福平)28°C, 220rpm摇菌过夜。菌液室温下5000rpm离心15min。用 15ml 接种缓冲液(IOmM pH5.85MES，IOmMMgCl2,150 y M 乙酰丁香酮)溶解沉淀。最后将获得的分别含有35S-149和沉默抑制子pl9、p24的菌液按等比例混合后注射接种于I月龄的本生烟(25°C，16h光照，8h黑暗)。如图1所示，接种I个半月后在植株上可以观察到强烈的绿色荧光信号，并持续表达绿色荧光蛋白基因达2个月以上。由此表明本发明中构建的基 于相結裳退病毒的表达载体可稳定、闻效的表达插入的外源基因。
【权利要求】
1.一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法，包括以下步骤: 1)提取病株中柑桔衰退病毒的总RNA； 2)以上述总RNA为模板，用引物ZYC357/ZYC358扩增启动子，用引物ZYC412/ZYC415和ZYC479/ZYC480分别扩增柑桔衰退病毒基因组的片段I和片段2，所述的引物核苷酸序列分别为:
ZYC357:5’ -TACGCGATTTGGGTAAGTACCTATAGCAATTACAGATGGCTAGCA AAGGAGAAGAACT-3，
ZYC358:5’ -ACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATGGACGACGAA ACAAAGAAATTGAAG A-3’
ZYC412:5’ -GCCTCTTAGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCAGTG-3，
ZYC415:5’ -CGAGAAGTCCTACCACTTTATAGTTGGCCTTTA-3，
ZYC479:5’ -CAAAC CATGCGAGCTTACTTTAGTATG-3’
ZYC480:5’ -ATTCCCGGGGGTGATTTTGGGTTTAGAC-3’ 3)用含有绿色荧光蛋白的质粒和特异引物ZYC349/ZYC350扩增绿色荧光蛋白基因，弓丨物 ZYC349/ZYC350 序列为:
ZYC349:5’ -AGTTCTTCTCCTTTGCTAGCCATCTGTAATTGCTATAGGTACTTACCCAAATCGCGTA-3，
ZYC350:5’ -AGAGCTAATGTGGGTAGTTGAGTCAGGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3， 4)将步骤2、3中获得的启动子、片段1、片段2和绿色荧光蛋白基因的扩增产物经切胶纯化后，分别与载体进行链接、转化，并对获得的菌液进行质粒纯化； 5)取步骤4中的纯化后分别含启动子和片段2的质粒混合，通过overloopPCR进行连接，正反向引物为ZYC479/ZYC358，从而得到35S-127，并进行浓缩；将纯化后分别含片段I和绿色荧光蛋白基因的质粒进行混合，通过overloop PCR进行连接，正反向引物为ZYC349/415，从而得到35S-126 ;将浓缩后的35S-126和35S-127混合，再次通过overloopPCR进行连接，正反向引物为ZYC479/ZYC415，从而得到35S-128，并进行浓缩； 6)取步骤5中所述浓缩后的35S-128与柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148分别进行StuI/PacI双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，进行切胶回收，纯化后的酶切产物混合并进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后从而得到柑桔衰退病毒的表达载体35S-149。
2.根据权利要求1所述的一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法，其特征在于:所述步骤6中的柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148的获得，包括以下步骤: O提取柑桔病株中柑桔裳退病毒分尚株FS-577的总RNA ； 2)以所述总RNA为模板，用随机引物反转录合成第一链cDNA； 3)用柑桔衰退病毒分离株FS-577的全序列设计的6对特异性引物，分段扩增所述步骤2中第一链cDNA的6个片段:cDNA片段I~6,所述的特异性引物的核苷酸序列分别为: 引物I上游引物序列ZYC214:
5’ -CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3’ ； 引物I下游引物序列ZYC1293:
5’ -GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3’ ； 引物2上游引物序列ZYC749:
5’ -AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3’ ； 引物2下游引物序列ZYC1894:
5’ -GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3’ ；引物3上游引物序列ZYC253:
.5’ -GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3’ ； 引物3下游引物序列ZYC1436:
.5’ -AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3’ ； 引物 4 上游引物序列 ZYC126:5’ -CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3’ ； 引物4下游引物序列ZYC1493:
.5’ -GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3’ ； 引物5上游引物序列ZYC431:
.5’ -GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3’ ； 引物5下游引物序列ZYC1478: . 5， -GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3，； 引物6上游引物序列ZYC2158:
.5’ _CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3’ ； 引物 6 下游引物序列 ZYCl 14:5’ -CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3’ ； .4)将步骤3中扩增得到的cDNA片段I与双元载体pUCl 19-Λ 9分别进行Pmel/PstI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-143 ；将35S-143与cDNA片段2分别进行Pstl/Swal双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S-144 ;将35S-144与cDNA片段3分别进行Xmal/Pmel双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-145 ;将35S-145与cDNA片段4分别进行XmaI/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-146 ;将35S-146与cDNA片段5分别进行Rsr II/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S-147 ;将35S-147与cDNA片段6分别进行Rsr II/AscI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148。
3.根据权利要求1所述的一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法，其特征在于:所述步骤2中的启动子为柑桔衰退病毒p23基因启动子，所述片段I为柑桔衰退病毒基因组19025-19296nt的区域，片段2为柑桔衰退病毒基因组17261_19024nt的区域；所述扩增反应条件为:94°C 2min ；45°C 30min ；92°C Imin ；92°C 20sec,55°C 20sec,68°C 2min 循环 35次，最后68°C延伸lOmin。
4.根据权利要求1所述的一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法，其特征在于:所述步骤3中的扩增反应条件为:94°C 2min ；94°C 30sec，58°C 45sec，72°C Imin循环35次，最后 72°C延伸 IOmin0
5.根据权利要求1所述的一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法，其特征在于:所述步骤4中的克隆载体为PMD18-T，所述步骤4和6中的感受态细胞为JM109。
6.根据权利要求1所述的一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法，其特征在于:所述步骤5中启动子和片段2连接反应条件为94°C 2min ；94°C 30sec, 58°C 45sec, 72°C 2min循环35次；最后72°C延伸IOmin ;所述步骤5中片段I与绿色荧光蛋白质粒连接反应条件为940C 2min ；94°C 30sec, 58°C 45sec, 72°C 2min 循环 35 次；最后 72°C延伸 IOmin ;所述步骤 5中 35S126 与 35S-127 的连接反应条件为 94°C 2min ；94°C 30sec，58°C 45sec，72°C 4min 循环35次；最后72°C延伸lOmin。
7.一种柑桔衰退病毒的表达载体构建试剂盒，其特征在于:包括4对特异性引物: ZYC357:5’ -TACGCGATTTGGGTAAGTACCTATAGCAATTACAGATGGCTAGCA AAGGAGAAGAACT-3， ZYC358:5’ -ACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATGGACGACGAA ACAAAGAAATTGAAG A-3’ ZYC412:5’ -GCCTCTTAGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCAGTG-3’
ZYC415:5’ -CGAGAAGTCCTACCACTTTATAGTTGGCCTTTA-3’
ZYC349: 5，-AGTTCTTCTCCTTTGCTAGCCATCTGTAATTGCTATAGGTACTTACCCAAATCGCGTA-3，
ZYC350:5’ -AGAGCTAATGTGGGTAGTTGAGTCAGGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3，
ZYC479:5’ -CAAAC CATGCGAGCTTACTTTAGTATG-3’
ZYC480:5’ -ATTCCCGGGGGTGATTTTGGGTTTAGAC-3’。
8.根据权利要求7所述的一种柑桔衰退病毒的表达载体构建试剂盒，其特征在于:还包括以下溶液: 2X —步法缓冲液:200mM pH8.8Tris-HCl, IOOmM(NH4)2SO4, IOOmM KCl,20mM MgSO4,l%Triton X-100,IOmM dNTP，0.02M DTT ；
10XPCR 缓冲液:200mM pH8.8Tris-HCl, IOOmM(NH4)2S04, IOOmM KCl,20mM MgSO4,l%Triton X-100,IOmM dNTP ； 双酶切缓冲液:100XBSA，IOmM Bis-Tris-Propane-HCl, IOmM MgCl2, ImMDTT ；
链接缓冲液:0.5M Tris-HCl pH7.8,0.1M MgCl2, 50mM DTT,5mM ΑΤΡ,Ο.25mg/L BSA,2% ~3%PEG3500 ；
裂解液 I:2mg/ml 溶菌酶，IM ρΗ8.0Tris HCl，0.5Μ EDTA ；
裂解液 II:0.2Μ NaOH，1%SDS。
【文档编号】C12N15/82GK103642834SQ201310703042
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】周彦, 周常勇, 李中安 申请人:中国农业科学院柑桔研究所