一种葡萄糖淀粉酶的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种氨基酸序列为SEQ?ID?NO:1的葡萄糖淀粉酶。本次发明首次公开了粉红粘帚霉的葡萄糖淀粉酶基因，通过对重组菌进行摇瓶发酵实验并测得发酵液酶活高达292U/ml。本发明所述葡萄糖淀粉酶能从糖链的非还原端高效分解α-1,4-糖苷键，水解出葡萄糖，也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖可广泛应用于淀粉糖工业。
【专利说明】一种葡萄糖淀粉酶
【技术领域】:
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种葡萄糖淀粉酶及其应用。
【背景技术】:
[0002]葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase, EC3.2.1.3),是水解淀粉的外切作用糖酶。它能把淀粉从非还原性未端水解α -1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，从糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。
[0003]多种细菌、真菌、酵母和植物都生产葡萄糖淀粉酶，并且工业上运用的葡萄糖淀粉酶大都来源于真菌。例如来自下列菌体:曲霉属(Aspergillus) (Svenssonet al.,Carlsberg Res.Commun.48:529-544(1983) ;Boel et al.,Agric.Biol.Chem.53:923-929(1989);美国专利号 5，024，941;美国专利号 4，794，175 和W088/09795);蓝状菌属(Talaromyces)(美国专利号 4，247，637;美国专利号 6，255，084;和美国专利号 6,620,924);根霉属(Rhizopus) (Ashikari et al., Agric.Biol.Chem.50:957-964(1986);Ashikari et al., App.Microbi0.Biotech.32:129-133(1989)和美国专利号 4，863，864);以及毛霉属(Mucor) (Houghton-Larsen et al., Appl.Microbiol.Biotechnol.62:210-217(2003)等等。
[0004]目前国 内外还没有粉红粘帚霉葡萄糖淀粉酶基因的研究报道，本发明运用分子克隆及基因工程技术手段从粉红粘帚霉菌中克隆出葡萄糖淀粉酶基因，并将其转入到黑曲霉Gl中得到了高效表达。
【发明内容】
:
[0005]本发明的目的是提供一种新型高产葡萄糖淀粉酶的菌株进而运用于工业生产。所述葡萄糖淀粉酶来源于粉红粘帚霉菌，本发明采用基因工程技术手段将来源于粉红粘帚霉菌的葡萄糖淀粉酶基因转化到黑曲霉Gl中并且得到了高效表达。这种新型葡萄糖淀粉酶其特征在于:
[0006]I)其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖淀粉酶；
[0007]2)在I)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有I)中葡萄糖淀粉酶活性的酶。
[0008]本发明另一方面提供了编码上述葡萄糖淀粉酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQID N0:2。
[0009]本发明提供了一种用于表达氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖淀粉酶的重组表达载体。
[0010]本发明还提供了一种能特异性表达这种新型葡萄糖淀粉酶的重组菌。
[0011 ] 本发明所用的转化宿主菌为黑曲霉Gl。
[0012]本发明的葡萄糖淀粉酶及上述的重组工程菌用于制备葡萄糖。
[0013]本次发明首次公开了粉红粘帚霉的葡萄糖淀粉酶基因，通过对重组菌进行摇瓶发酵实验并测得发酵液酶活高达292U/ml。本发明所述葡萄糖淀粉酶能从糖链的非还原端高效分解α -1, 4-糖苷键，水解出葡萄糖，也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖可广泛应用于淀粉糖工业。
【专利附图】
【附图说明】:
[0014]图1:构建的重组表达载体pGm-3440示意图。
[0015]图2:重组菌发酵液上清SDS-PAGE电泳图，箭头所指地方为56KD的葡萄糖淀粉酶。
[0016]图3:葡萄糖淀粉酶活性随温度变化曲线。
[0017]图4:葡萄糖淀粉酶活性随pH变化曲线。
【具体实施方式】:
[0018]下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。
[0019]实施例1:葡萄糖淀粉酶基因的筛选
[0020]通过比较蛋白质组学将本实验室(蛋白质表达及分子生物学实验室)预先建立的葡萄糖淀粉酶序列与粉红粘帚霉全基因组预测蛋白质序列进行本地Blastp，从中获得一些同源性较高的序列。将这些同源性较高的序列进行NCBI在线Blastp并将比对结果进行分析确定最有可能的葡萄糖淀粉酶序列。运用SignalP4.1Server对这些可能的序列进行分析，把含有信号肽的序列作为克隆的目的基因。
[0021]葡萄糖淀粉酶基因的克隆
[0022]以粉红粘帚霉全基因组DNA为模板进行PCR扩增获得目的基因，其中PCR过程所用到的引物分别为:
[0023]正向引物5' ~CCGCTCGAGAGGATGGTGAAGATAATTCCCACTGTGC~3/
[0024]反向引物5' ~TGCTCTAGATCATCGCCAGTTATCATTAGTCGAG~3/
[0025]其中下划线处分别表示XholUXball两限制酶切位点。
[0026]PCR扩增条件为:98°C 30S ；98°C IOs ；72°C lmin30 个循环；72°C lOmin，所用的 DNA聚合酶为Phusion DNA聚合酶；采用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
[0027]用Xholl和Xball两种限制性内切酶分别对PCR产物以及载体pGm进行酶切。运用胶纯化试剂盒对这两种酶切产物进行纯化并用T4DNA连接酶连接上述两个酶切产物，制成重组表达载体pGm-3440 (图1)。将连接后的产物转化大肠杆菌DH5a用氨苄青霉素进行选择。
[0028]为确保正确，对若干个转化子进行菌落PCR并进行测序。测序结果通过软件(DNAMAN)与原序列比对显示:粉红粘帚霉中葡萄糖淀粉酶的基因序列为SEQ ID N0:2;其cDNA的序列为SEQ ID NO: 3，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1 ;多个克隆的测序结果都一致。经NCBI的blast比对发现,其基因序列与来源于Leptosphaeria maculans的葡萄糖淀粉酶基因具有62%的同源性,与来源于Fusarium oxysporum的葡萄糖淀粉酶基因具有58%的同源性。因此证明本发明所筛选到的葡萄糖淀粉酶基因为新的，与已知葡萄糖淀粉酶来源不同的新的等位基因。
[0029]使用质粒中量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的阳性克隆中提取质粒。
[0030]实施例2:重组质粒转化黑曲霉Gl囷株及验证
[0031]吸取黑曲霉Gl孢子悬浮液于CMA平板中心(9cm培养皿)，待菌落长满整个培养皿，切1/4大小的培养基于200mL CMA液体培养基中，在30°C、200rpm的条件培养14~16h。 [0032]用无菌的Miracloth滤布收集菌体,并用solutionA冲洗一次,在无菌条件下用棉签将其转移到40ml的裂解液中，在30°C、200rpm条件下裂解两个小时，用显微镜观察原生质体的形成情况。
[0033]用无菌的Miracloth滤布过滤上述裂解液,用两个50ml无菌离心管收集原生质体并用solutionB冲洗定容使每管大约25ml。在2000rpm条件下离心5min弃去上清,用20mlsolutionB对沉淀再清洗沉淀两次。将沉淀重悬浮于IOmLsolution B中，并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再次离心并弃去上清液，根据血球计数板计数结果，加入适量溶液B重悬沉淀，使得原生质体数目在I X IO7个/mL左右。
[0034]在冰上向预先冷却的15ml离心管中加入100 μ L上述原生质体、10 μ L质粒DNA、12.5μ L solutionC冰浴20min。与此同时将预先配制好的上层试管MMSA融化并置于55°C水浴中。
[0035]取出冰浴中的15ml离心管，向其加入Iml solutionC、2ml solutionB并混匀后作为混合液。
[0036]向3个融化的上层丽SA试管中的每一个中加入Iml上述混合液混匀并立即倒于MMSA平板中，将平板在30°C培养箱中培养7-10d直到长出转化子为止。
[0037]将长出的转化子菌株接入到二次筛选培养基中培养直至长出黑色菌落。用试剂盒所给方法提取其基因组DNA并用上述PCR反应条件进行PCR扩增。通过胶回收与测序验证，验证结果正确的菌株即为阳性转化子，并命名为ZL-1。
[0038]solutionA:2.5mLlM K2HPO4, 2.5mLlM KH2PO4,48.156g MgSO4,加入 dlH20 至终体积500mL,用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0039]solutionB:5mLlM Tris (ρΗ7.5)，2.77g CaCl2,109.32g 山梨醇，加入 dlH20 至终体积500mL，用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0040]solutionC:250g PEG4000，2.77g CaCl2, 5mLlM Tris (pH7.5)，加入 dlH20至终体积500mL,用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0041]裂解液:将0.6g 裂解酶(Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum, Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0042]MMSA 平板:0.59g 乙酰胺(Sigma) ,3.4g CsCl (Sigma) ,0.52g KCl，1.52gKH2P04,218.5g山梨醇，Iml微量元素(见下)，20g琼脂，加入dlH20至终体积972.5mL,高压蒸汽灭菌后加入用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04。
[0043]MMSA 上层琼脂试管:0.59g 乙酰胺(Sigma)，3.4g CsCl (Sigma)，0.52g KCl，1.52g KH2PO4, 218.5g山梨醇，Iml微量元素(见下)，IOg低熔点琼脂糖，加入dlH20至终体积972.5mL,高压蒸汽灭菌后，在培养基未凝固时，加入用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04,之后立即分装于无菌试管中，每管10mL。
[0044]微量元素:在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4.7Η20，8.8g ZnSO4.7Η20，0.4gCuSO4.5Η20，0.15g MnSO4.4Η20，0.Ig Na2B4O7.IOH2O, 50mg (NH4) 6Μο7024.4Η20，0.2mL 浓 HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0045]CMA平板:20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，Ig蛋白胨，15g琼脂，加入dlH20至终体积1000mL,高压蒸气灭菌。
[0046]CMA液体培养基:20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，Ig蛋白胨，加入dlH20至终体积1000mL,高压蒸气灭菌。
[0047]二筛培养基:0.59g 乙酰胺(Sigma)，3.4g CsCl (Sigma)，0.52g KCl，1.52gKH2P04，Iml微量元素(见下)，20g琼脂，加入dlH20至终体积972.5mL,高压蒸汽灭菌后加入用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04。
[0048]实施例3:阳性转化子菌株的发酵验证。
[0049]挑取上述的阳性转化子菌株，接种于20mlTSB发酵培养基中在30°C，200rpm的条件下培养5d ;所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在14000g条件下离心lOmin，收集上清液；将上清液在浓度为12%的SDS-PAGE胶上进行电泳。电泳图如图2。
[0050]TSB 发酵培养基:12g NaNO3,0.5g KCl, 1.5g KH2PO4, 2.05g MgSO4.7H20，3.5gNaH2PO4.H20，45g胰蛋白大豆肉汤，70g柠檬酸钠，Ig吐温80，ImL微量元素(见下)，加入dlH20至终体积700mL，高压蒸气灭菌后加入300mL用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌的40%麦芽糖。
[0051]微量元素:在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4.7Η20，8.8g ZnSO4.7Η20，0.4gCuSO4.5Η20，0.15g MnSO4.4Η20，0.Ig Na2B4O7.IOH2O, 50mg (NH4) 6Μο7024.4Η20，0.2mL 浓 HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0052]实施例4:葡萄糖淀粉酶活测定
[0053]1、酶活测定的方法
[0054]甲、乙两支50mL比色管，分别加入25mL的2%可溶性淀粉溶液和5mL的0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH4.6);于40±0.2°C的恒温水浴中预热5~lOmin。在甲管中加入酶制备液2.0mL摇匀并立即记时；反应Ih后，立即在甲、乙两管各加0.2mL的20%氢氧化钠溶液，立即摇匀并将两管取出迅速用水冷却；然后于乙管中补加酶制备液2.0mL(作为对照)。取两管中上述反应液各5mL放入碘量瓶中，准确加入0.lmol/L碘液10mL，再加
0.lmol/L氢氧化钠溶液15mL (边加边摇晃)，放置暗处15min,加入2mol/L硫酸2mL ;最后用0.05mol/L硫代硫酸钠溶液滴定至无色为终点。
[0055]酶活X = (A-B) XNX90.05Xn
[0056]其中:X-酶活力单位，μ /g (mL);
[0057]A—空白试验消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数；
[0058]B—样品消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数；
[0059]N—硫代硫酸钠溶液的当量浓度；
[0060]η-稀释倍数；
[0061]90.05—lmLlmol/L硫代硫酸钠相当葡萄糖毫克数；
[0062]2、酶活测定[0063]依照上述方法，最终测得这种新型葡萄糖淀粉酶活高达292U/ml。
[0064]3、葡萄糖淀粉酶学特性测定
[0065]运用3，5_二硝基水杨酸(0吧)分光光度法在301:、401:、501:、601:、701:、801:条件下并以乙酸-乙酸钠缓冲液在pH4.6条件下测得葡萄糖淀粉酶的活性。结果显示这种新型葡萄糖淀粉酶最适温 度在50°C左右(图3)。
[0066]用同样的方法在50°C条件下以磷酸氢二钠-柠檬酸为缓冲溶液在pH为3.0,4.0、
5.0,6.0,7.0,8.0条件下测得酶活。测量结果显示这种新型葡萄糖淀粉酶的最适pH值为5左右(图4)。
[0067]实施例5:葡萄糖淀粉酶转糖实验
[0068]取IOml液化淀粉，加入2ml上述摇瓶发酵的上清液，即葡萄糖淀粉酶，50°C，pH5条件下作用30分钟后，测定反应液的DE值(还原性糖值)，达到85% ;作用I小时后，其DE值超过了 88%;作用2个小时后在进行测量发现DE值高达94%。实验结果表明，本发明的葡萄糖淀粉酶能从糖链的非还原端高效分解α-1，4-糖苷键来水解出葡萄糖。因此，本发明筛选的葡萄糖淀粉酶，以及构建的重组表达工程菌可广泛应用于淀粉糖工业。
【权利要求】
1.一种葡萄糖淀粉酶，其特征在于，所述的葡萄糖淀粉酶包含有: 1)氨基酸序列为SEQID NO:1的葡萄糖淀粉酶； 2)在I)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有I)中葡萄糖淀粉酶活性的酶。
2.一种基因，其特征在于，所述的基因用于编码权利要求1所述的葡萄糖淀粉酶。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQID N0:2。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体用于表达权利要求1所述的葡萄糖淀粉酶。
5.一种重组工程菌，其特征在于，所述的重组工程菌携带有权利要求4所述的重组表达载体。
6.如权利要求5的重组工程菌，其特征在于，所述的重组工程菌为黑曲霉。
7.权利要求1所述的葡萄糖淀粉酶在制备葡萄糖中的应用。
8.权利要求5所述的重组`工程菌在制备葡萄糖中的应用。
【文档编号】C12R1/685GK103695389SQ201310718737
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】王华明, 张亮 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所