玫烟色棒束孢scau-ifcf02菌株液体发酵环境条件优化工艺的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种玫烟色棒束孢SCAU-IFCF02菌株液体发酵环境条件优化工艺。本发明针对所述菌株的特点确定影响发酵效果的关键单因素，在单因素实验基础上，建立了产孢量与培养温度、培养液初始pH值以及摇床转速之间的特定二次回归数学模型。各因素对产孢量的作用大小依次为：培养液初始pH值＞摇床转速＞培养温度；经过分析总结出玫烟色棒束孢SCAU-IFCF02菌株液体发酵的最佳环境条件为：培养温度24℃、培养液初始pH值6、摇床转速170rpm，在此条件下该菌株产孢量可达3.1568×108个孢子/mL。本发明采用二次通用旋转回归设计，基于本发明可以保证所述菌株液体发酵中，优化试验次数少、周期短、精度高、综合性好、系统性强、信息量大，并有效消除了各回归系数之间的相关性。
【专利说明】玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵环境条件优化工
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【技术领域】
[0001]本发明属于无公害微生物农药液体发酵工艺领域。更具体地，涉及一种玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵环境条件优化工艺。
【背景技术】
[0002]玫烟色棒束孢Usaria fumosorosea)是一种重要的虫生真菌，属半知菌亚门{Deuteromycotina)、丝抱纲{Hyphomycetes、、丝抱目(Moniliales、、丛梗抱科(#o/?i7iaceai?)、棒束孢属(Jsaria)。其地理分布广泛，寄主多样，已记载的有25个不同科的昆虫，包括小菜蛾、麦双尾蚜和烟粉虱等一些重要农业害虫，是生物防治中极具开发应用潜力的种类。玫烟色棒束孢的致病力强，对人畜作物及环境安全，是研究和应用最广的一类微生物杀虫剂之一。
[0003]玫烟色棒束孢(Jsaria /i/fflosoriosea)在发酵生产过程中,环境条件是影响产孢量的重要因素之一。例如一定的温度、湿度、PH值和光照等。此前的研究表明，玫烟色棒束孢的菌丝生长适温为8~32°C，最适温为24~28°C，高温(30~40°C)比低温(6~11°C)对生长的影响大，孢子萌发所需温度一般比菌丝生长所需温度范围更窄。Hall等将玫烟色棒束孢在25 °C条件下，进行光照培养4 d后，再转入黑暗中再培养4 d，产孢量比未经光照处理的菌株高。陈宜涛等研究表明，玫烟色棒束孢在PH 3~10的范围内均能生长，但中性偏微酸(pH5~7)的环境比偏酸性(pH3~4)或碱性(pH8~10)环境更适于其生长，并确定其液相发酵生产的最适PH值为5~7。吴伟等研究表明，通气条件对玫烟色棒束孢培养形状和产孢影响很大。但是这些研`究成果仅仅是单一因素的研究，根据已有的发酵条件，玫烟色棒束孢的产孢量仍然很低，且获得的均是分生孢子。目前用于商品化的真菌制剂大部分是以分生孢子为原料制成，因为芽生孢子在干燥、贮存及在田间应用环境过程中均不稳定，容易受到外界不利条件的影响，严重影响了玫烟色棒束孢相关生物制剂的生产，大大制约了玫烟色棒束孢菌在防治农业害虫中的推广应用。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是克服现有玫烟色棒束孢菌液体发酵工艺的技术不足，提供一种能够快速、精确的玫烟色棒束孢菌液体发酵环境条件优化工艺及其确定方法。
[0005]本发明的目的是提供一种玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵环境条件优化工艺。
[0006]本发明另一目的是提供所述玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵环境条件优化工艺的确定方法。
[0007]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明提供了一种玫烟色棒束抱fumosorosea (Wize) Brown & Smith)菌株SCAU-1FCF02液体发酵环境条件优化工艺的筛选方法，所述玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株于2013年11月I日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013526，保藏地址为中国武汉市武汉大学；
所述确定方法为在针对所述菌株的特点确定影响发酵效果的关键单因素；根据所确定的关键单因素进行筛选分析，结合二次通用旋转回归组合设计方法，以培养温度、初始PH值和摇床转速为3个试验因子，以各单因素筛选的最佳值为中心点，以产孢量为测定指标，设计3因素5水平的二次通用旋转组合试验，建立所述菌株的产孢量与培养温度、培养液初始PH值以及摇床转速之间的二次回归数学模型；根据所得的二次回归数学模型总结出玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵的环境条件优化工艺。
[0008]本发明还提供了一种玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵环境条件优化工艺，发酵的各环境条件为培养温度24°C、培养液初始pH值6、摇床转速170 rpm。
[0009]根据此工艺进行发酵，玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的产孢量高达3.1568 X IO8个孢子/mL。
[0010]上述玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵环境条件优化工艺，具体的发酵步骤如下:
51.制备玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子悬浮液；
52.以上述孢子悬浮液为种子液，按照5%体积比的接种量，将玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子悬浮液接种到发酵培养液，在培养温度24°C、摇床转速170 rpm的条件下进行发酵培养。
[0011]其中，步骤SI所述孢子悬浮液的制备方法为:
511.取玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株，在无菌条件下，用接菌环取一环接种于PDA平板进行活化，于25°C、光照(14 L:10D)恒温培养箱中培养,最佳培养时间为15d ；
512.待菌丝长满培养皿后，加入20mL含有0.03%吐温-80的无菌水，用接种针轻刮真菌的菌丝及孢子，将菌液倒入烧杯中，用磁力搅拌器搅拌30 min ；
513.待孢子完全分散后，用双层医用纱布过滤菌液，弃去杂质和培养基残物，获得分生孢子悬浮液；
514.用血球计数器计数孢子悬浮液的孢子浓度，孢子浓度可用含有0.03%吐温-80的无菌水调整。
[0012]S2所述发酵培养为密闭发酵时，发酵液与发酵空间的体积比为3:10。
[0013]如250mL的三角瓶进行发酵时，装样量为75mL。
[0014]S2所述的发酵培养液配方为:葡萄糖39g/L、酵母浸膏19g/L，水定容，pH值为6，灭菌备用。
[0015]S3所述发酵培养的时间为5~8天。
[0016]更优选地，S3所述发酵培养的时间为6天。
[0017]本发明具有以下有益效果:
本专利发明人分离得到的玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株对小菜蛾具有非常好的防治效果，是国内外所报道的玫烟色棒束孢菌株中致死速度最快的菌株，也是开发防治小菜蛾真菌制剂的优良候选菌株。因此，以玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的常见侵染体分生孢子为活性成分，制备成各种生物制剂农药，能够为玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的产业化应用奠定基础，为该菌株的田间应用提供理论指导，具有良好的应用前景。但是同样地，目前玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的发酵存在产孢量低的问题，本领域技术人员公识，培养温度、初始PH值和摇床转速等等因素并不是单独影响真菌的产孢量，往往几个因素之间是相互影响、相互制衡的，对玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的发酵环境条件的优化仍然是一个复杂庞大的课题。另外，目前用于商品化的真菌制剂大部分是以分生孢子为原料制成，但是对靶标害虫有致病力的侵染体包括菌丝、分生孢子、气生分生孢子和芽生孢子等。其中，气生分生孢子能够较好地抵抗不利条件和环境的影响，更适合做害虫生物防治的的理想原料。本发明发酵优化工艺能够使菌株在较短时间内达产孢高峰，收获其气生分生孢子，进而缩短工艺时间，为制剂提供原料。
[0018]本发明人首次将二次通用旋转回归组合设计应用于玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的发酵环境条件优化工艺的确定，结合所述菌株的发酵特点和单因素实验，总结得到二次通用旋转回归方程，进一步发挥二次通用旋转回归组合设计方法在优化菌株发酵工艺方面的应用，既能分析各处理因子的影响，又能建立定量的数学模型，获得试验次数少、周期短、精度高、综合性好、系统性强、信息量大等优点，并消除了回归系数之间的相关性，取得了非常好的效果。
本发明建立了产孢量与培养温度、培养液初始PH值以及摇床转速之间的二次回归数学模型，总结了各环境因素对玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株产孢量的作用大小依次为:培养液初始卩!1值>摇床转速> 培养温度，且其中培养液初始pH值为正效应，培养温度和摇床转速为负效应，随着培养温度、初始PH值与摇床转速的不断增加，玫烟色棒束孢产孢量表现出先增后减的趋势，表明培养温度、初始PH值与摇床转速存在一个最适的提取范围。
[0019]根据本发明建立的产孢量与培养温度、培养液初始pH值以及摇床转速之间的二次回归数学模型，能够非常方便的分析出玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵的最佳环境条件为:培养温度24°C、培养液初始pH值6、摇床转速170 rpm，在此条件下该菌株产孢量最高可达3.1568 X IO8个孢子/mL。
另外，本发明采用二次通用旋转组合设计对本菌株液体发酵工艺条件进行优化，与目前传统的产用的单因素试验和正交试验相`比较，它既能分析各处理因子对发酵的影响和各处理因子之间的相互作用，又能建立定量的数学模型。显示出在一定的摇床转速(X3)下，产孢量随着温度的增加而增加，当达到最大值后，温度(X1)的增加会使产孢量下降，尤其是在较低或者较高摇床转速的条件下，过低或者过高的温度(X1)均对产孢表现不利影响，且高温条件下更明显；同理，在较低或较高的温度(X1)下，较低或者较高的摇床转速(X3)均对产孢表现不利影响，可能是因为摇床转速太低，溶氧量不足，摇床转速过高，容易造成菌丝的机械损伤，进而影响产孢。
[0020]本发明采用二次通用旋转组合设计对玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵工艺条件进行优化，与目前传统的常用的单因素试验和正交试验相比较，它既能分析各处理因子的影响，又能建立定量的数学模型，属于更高级的试验设计技术，具有试验次数少、周期短、精度高、综合性好、系统性强、信息量大等优点，并消除了回归系数之间的相关性。从所建立的回归方程的偏回归系数绝对值的大小可以判断各因子的重要程度，系数的正负表示各因子效应作用的方向，本试验得出的回归方程可以非常好地应用于玫烟色棒束孢液体发酵工艺的确定，具有很好的实践指导应用价值。
[0021]本发明获得的玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵的最佳环境条件工艺为培养温度24°C、培养液初始pH值6、摇床转速170 rpm,在此条件下该菌株产孢量最高可达
3.1568X IO8个孢子/mL，为该菌株的进一步开发利用和规模化生产提供了理论依据。
[0022]通过所述工艺发酵获得的玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的分生孢子悬浮液的对小菜蛾具有良好的控制能力，是一种理想的防治十字花科蔬菜小菜蛾的无公害农药，并且具有高效、低毒、低残留，与环境相容性好，效果更为稳定，是替代高残留农药的新型生物农药，可以很好的应用于该菌株商品制剂的生产。另外，通过本发明优化工艺获得的分生孢子和芽生孢子可作为进一步固体发酵扩大培养的种子，为液固双相发酵工艺的探索提供理论支撑，从而进一步缩短发酵工艺流程和扩大工艺生产量。对于我国开发无公害蔬菜，维护生态环境，实现可持续农业具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为培养温度对菌丝生物量和产孢量的影响曲线图。
[0024]图2为初始pH值对菌丝生物量和产孢量的影响曲线图。
[0025]图3为摇床转速对菌丝生物量和产孢量的影响曲线图。
[0026]图4为各单因子效应曲线，X1为培养温度，X2为培养液初始pH值，X3为摇床转速。
[0027]图5为培养温度(X1)与摇床转速(X3)交互作用图，图中，当温度和摇床转速均在1、2、3或4所示区域内，产孢量分别为70~100、100~200、200~300或300~400百万孢子/mL。
【具体实施方式】
[0028]以下结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，`本发明采用的试剂、方法和设备为本【技术领域】常规试剂、方法和设备。
[0029]以下实例中涉及的玫烟色棒束孢具体为玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株，于2013年11月I日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013526，保藏地址为中国武汉市武汉大学。
[0030]实施例中所用的含有0.03%吐温-80的无菌水，所述的0.03%指的是体积比。
[0031]实施例1玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株孢子悬浮液的制备 玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子悬浮液的制备方法如下:
51.取玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株，在无菌条件下，用接菌环取一环接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板进行活化，于25°C、光照(14L:10D)恒温培养箱中培养15 d ；
52.待菌丝长满培养皿后，加入20mL含有0.03%吐温-80的无菌水，用接种针轻刮真菌的菌丝及孢子，将菌液倒入烧杯中，用磁力搅拌器搅拌30 min ；
53.待孢子完全分散后，用双层医用纱布过滤菌液，弃去杂质和培养基残物，获得分生孢子悬浮液；
54.用血球计数器计数孢子悬浮液的孢子浓度，孢子浓度可用含有0.03%吐温-80的无菌水调整。
[0032]用含有0.03%吐温-80的无菌水配成浓度为I X IO6孢子/mL的孢子悬浮液，供以下实施例使用。[0033]实施例2培养温度对玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株菌丝生物量和产孢量的影响
1、试验设置
(O以实施例1制备的玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子悬浮液为种子液进行发酵。发酵培养液成分为葡萄糖39g/L、酵母浸膏19g/L。装样量75mL/250mL，玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02 菌株接种量 5% (V/V)。
[0034](2)摇床培养过程中，遵循单一因子变量原则。初始pH值为培养液的自然pH值，摇床转速为150 rpm ο温度条件设置为19°C、22°C、25°C、28°C和31°C，测定不同培养温度对菌丝生物量和产孢量的影响，摇床培养6 d。每隔24 h进行菌丝生物量及产孢量的测定，每个处理重复5次，根据结果获得最佳产孢培养温度。
[0035]2、结果显示，不同培养温度对玫烟色棒束孢液体发酵过程中菌丝生物量和产孢量的影响如附图1所示，在5种不同的培养温度条件下，本菌株菌丝生物量和产孢量均表现出显著的差异(P < 0.05)，随着培养温度的升高，菌丝生物量和产孢量均表现出先上升后下降的趋势，整体趋势大致相同。在25°C时产孢量达最大值2.9230 X IO8孢子/mL，适温范围大致为25~28°C ;而在28°C时菌丝生物量达到最大值23.17mg/mL，适温范围大致为25~31°C。由此可以看出，产孢量和菌丝生物量并非同一温度条件下达最大值，产孢量的最佳温度较菌丝生物量的最佳温度略低，最适温区也相对较窄。
[0036]实施例3初始pH值对玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株菌丝生物量和产孢量的影响
1、试验设置
(O以实施例1制备的玫烟色棒束孢SCAU-`1FCF02菌株的孢子悬浮液为种子液进行发酵。发酵培养液成分为葡萄糖39g/L、酵母浸膏19g/L。装样量75mL/250mL，玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02 菌株接种量 5% (V/V)。
[0037](2)在所筛选出的产孢量的最佳培养温度的基础上，控制摇床转速为150 rpm。培养液的初始pH值设置如下:4、5、6、7、8和9，初始pH值通过NaOH和HCl稀释液进行调配，测定不同初始PH值对菌丝生物量和产孢量的影响，其它条件和测定方法同前所述，获得最佳产孢初始pH值。
[0038]2、结果显示，不同初始pH值对玫烟色棒束孢液体发酵过程中菌丝生物量和产孢量的影响如附图2所示，在6种不同初始pH值的培养液中，本菌株菌丝生物量和产孢量均表现出显著的差异(P < 0.05)。两者的变化趋势整体上一致，菌丝生物量和产孢量在近中性偏微酸性环境下产量较高，碱性条件则表现出不利影响，下降趋势显著(P < 0.05)。在初始PH值为5~6时，菌丝生物量呈现出最大值约为22 mg/mL，两者之间差异不显著(P >
0.05);而在初始pH值为6时，产孢量达到最大值2.9480 X IO8孢子/mL。由此可见，产孢量对初始PH值的要求更加严格。
[0039]实施例4摇床转速对玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株菌丝生物量和产孢量的影响
1、试验设置
(O以实施例1制备的玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子悬浮液为种子液进行发酵。发酵培养液成分为葡萄糖39g/L、酵母浸膏19g/L。装样量75mL/250mL，玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02 菌株接种量 5% (V/V)。
[0040](2)在所筛选出的产孢量的最佳培养温度和最佳初始pH值的基础上，摇床转速设置如下:90、120、150、180、210、240和270 rpm，测定不同摇床转速对菌丝生物量和产孢量的影响，其它条件和测定方法同前所述，获得最佳产孢摇床转速。
[0041]2、结果显示，不同摇床转速对玫烟色棒束孢液体发酵过程中菌丝生物量和产孢量的影响如附图3所示，在7种不同的摇床转速条件下，本菌株菌丝生物量和产孢量均表现出较明显的差异。随着摇床转速的升高，菌丝生物量和产孢量均表现出先上升后下降的趋势，从整体上来看，两者的变化程度大致相同。在摇床转速为150 rpm时，菌丝生物量达到最大值21.43 mg/mL，显著高于其它转速条件(P < 0.05);在摇床转速为180 rpm条件下，产孢量达最大值为3.1140X 108孢子/mL，显著高于其它转速条件(P < 0.05)。
[0042]实施例5 二次通用旋转回归组合设计优化玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株发酵环境条件
由上述实施例2~4可知，在单因素试验确定的发酵条件下进行发酵，产孢量达最大值为3.1140X IO8孢子/mL，且几个因素的配比有成千上万种组合，因此，本发明人通过利用二次通用旋转回归组合设计，建立一种二次回归数学模型，能够准确快速的确定玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株发酵环境条件最优工艺。
[0043]1、根据单因素试验结果，以培养温度(X1X初始pH值(X2)和摇床转速(X3)为3个试验因子，以单因素试验确定的最佳值为中心点，以产孢量为测定指标，设计3因素5水平的二次通用旋转组合试验，用以优化本菌株液体发酵产孢的培养条件，每个处理重复5次。试验因子及水平如表1所示。
[0044]表1因素水平编码表
【权利要求】
1.一种玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵环境条件优化工艺的确定方法，其特征在于，所述玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株于2013年11月I日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013526 ； 所述确定方法为在针对所述菌株的特点确定影响发酵效果的关键单因素；根据所确定的关键单因素进行筛选分析，结合二次通用旋转回归组合设计方法，以培养温度、初始PH值和摇床转速为3个试验因子，以各单因素筛选的最佳值为中心点，以产孢量为测定指标，设计3因素5水平的二次通用旋转组合试验，建立所述菌株的产孢量与培养温度、培养液初始PH值以及摇床转速之间的二次回归数学模型；根据所得的二次回归数学模型总结出玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵的环境条件优化工艺。
2.一种玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵环境条件优化工艺，其特征在于，发酵的各环境条件为培养温度24°C、培养液初始pH值6、摇床转速170 rpm。
3.根据权利要求2所述玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵环境条件优化工艺，其特征在于，具体的发酵步骤如下: 51.制备玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子悬浮液； 52.以上述孢子悬浮液为种子液，按照5%体积比的接种量，将玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株的孢子悬浮液接种到发酵培养液，在培养温度24°C、摇床转速170 rpm的条件下进行发酵培养。
4.根据权利要求3所述玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵环境条件优化工艺，其特征在于，步骤SI所述孢子悬浮液的制备方法为: 511.取玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株，在无菌条件下，接种于PDA平板进行活化，光照周期为光照:黑暗=14:10，25°C恒温培养；` 512.待菌丝长满培养皿后，加入含有0.03%吐温-80的无菌水，洗出菌丝及孢子，对洗出的菌液进行搅拌； 513.待孢子完全分散后，过滤，获得分生孢子悬浮液。
5.根据权利要求3所述玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵环境条件优化工艺，其特征在于，S2所述的发酵培养液的配方为葡萄糖39g/L、酵母浸膏19g/L，水定容，pH值为6，灭菌备用。
6.根据权利要求3所述玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵环境条件优化工艺，其特征在于，S2所述发酵培养为密闭发酵时，发酵液与发酵空间的体积比为3:10。
7.根据权利要求3所述玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵环境条件优化工艺，其特征在于，S3所述发酵培养的时间为5~8天。
8.根据权利要求3所述玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株液体发酵环境条件优化工艺，其特征在于，S3所述发酵培养的时间为6天。
【文档编号】C12R1/645GK103756950SQ201310721114
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】何余容, 张伟, 吕利华, 谢梅琼, 念晓歌 申请人:华南农业大学