一种将microRNA转染到血小板中的方法
【专利摘要】本发明公开了一种将microRNA转染到血小板中的方法，包括如下步骤：a）将待转染microRNA与脂质体制混匀，得混合溶液；b）在温度为22℃，振荡频率为60Hz的条件下，将步骤a的混合溶液与血小板共培养，培养时间为12～36h，离心，收集血小板，即可。本发明方法可以有效地将microRNA转染至血小板中，克服了现有技术的缺陷。
【专利说明】—种将microRNA转染到血小板中的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种将microRNA转染到血小板中的方法。
【背景技术】
[0002]血小板是体内血栓形成的关键成分之一，在心血管疾病(增殖、血栓形成和血栓栓塞)、炎症和部分肿瘤等多种病理生理进程中扮演重要角色。microRNAOiiiRNA)是一类由内源基因编码的长度为20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。
[0003]研究表明，血小板内包含大量miRNAs，部分与体内纤溶、凝血过程相关的血小板miRNAs可能是体内血栓形成潜在的分子标志物。
[0004]然而，由于血小板内部缺乏细胞核和基因组DNA，使得血小板内直接转染miRNA技术异常困难，使得血小板miRNA标志物的研究一直停滞不前，急需寻找一种能够将miRNA直接导入血小板中的方法。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明提供了一种将HiiCT0RNA转染到血小板中的方法。
[0006]本发明将microRNA转染到血小板中的方法，包括如下步骤:`[0007]a)将待转染microRNA与脂质体制混匀，得混合溶液；
[0008]b)在温度为22°C，振荡频率为60Hz的条件下，将步骤a的混合溶液与血小板共培养，培养时间为12~36h,离心,收集血小板,即可。
[0009]microRNA (miRNA)是一类长度约为20-24个核苷酸的小RNA。
[0010]步骤a)中，所述脂质体为阳离子脂质体。优选地，所述阳离子脂质体是siPORTTMNeoFXTM 或 Lipofectamine2000。
[0011]步骤a)所述混合溶液中，microRNA的浓度为0.7~0.8mol/L，脂质体的浓度为5~7%(v/v)。优选地，所述microRNA的浓度为0.74mol/L，脂质体的浓度为5.9%(v/v)0
[0012]步骤a)中，混匀的方法如下:将脂质体和待转染HiiCT0RNA混合，在温度为15~250C，震荡频率为50~70Hz的条件下，放置10~30min，即得混合溶液。优选地，所述温度为22°C，震荡频率为60Hz，放置时间为20min。
[0013]步骤b)中，所述培养时间为24h。
[0014]本发明还提供了前述任意一项所述方法制备的血小板。
[0015]发明人在前期试验中，采用常规的脂质体转基因方法转染miRNA至血小板中，SP将miRNA与脂质体混合，形成混合物，再在37°C与血小板共培养，然而，经检测发现，该种方法难以有效地将microRNA转入血小板中。
[0016]发明人也是偶然发现，在温度为22°C，振荡频率为60Hz条件下，将microRNA与脂质体混合物，与血小板共培养，可以将microRNA转入血小板中。
[0017]另外，发明人通过筛选实验发现，只有在温度为22°C，振荡频率为60Hz条件下才能有效转染，培养温度和震荡频率有微小变动，则难以达到目的。
[0018]本发明方法可以将microRNA导入血小板中，使得血小板miRNA的功能鉴定成为可能，同时为筛选血小板的miRNA治疗药物提供了体外筛选体系，临床应用前景良好。
[0019]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0020]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1血小板中miR-30c含量检测结果图，其中，NC表示空白组，miRNA-30c表示转染miRNA-30c后血小板的含量，Ant1-miRNA-30c表示转染Ant1-miRNA_30c后血小板的含量。
[0022]图2血小板内PA1-1含量检测结果图，其中，NC表示空白组，miRNA_30c表示转染miRNA-30c后血小板的含量，Ant1-miRNA_30c表示转染Ant1-miRNA_30c后血小板的含量。
【具体实施方式】
[0023]实施例1本发明在血小板内转染microRNA的方法
[0024]取脂质体siPORTTMNeoFXTM和待转染microRNA，分别制成溶液，混合，在温度为15°C，震荡频率为50Hz的条件下，放置lOmin，得混合液，混合液中microRNA的浓度为0.7mol/L，脂质体的浓度为5% (v/v)；
[0025]在温度为22°C，振荡频率`为60Hz的条件下，将前述混合液与血小板共培养，培养时间为12h，离心，收集血小板，即可。
[0026]实施例2本发明在血小板内转染microRNA的方法
[0027]取脂质体Lipofectamine2000和待转染microRNA,分别制成溶液，混合,在温度为25°C，震荡频率为70Hz的条件下，放置30min，得混合液，混合液中microRNA的浓度为0.8mol/L，脂质体的浓度为7% (v/v)；
[0028]在温度为22°C，振荡频率为60Hz的条件下，将前述混合液与血小板共培养，培养时间为36h，离心，收集血小板，即可。
[0029]实施例3本发明在血小板内转染microRNA的方法
[0030]取脂质体Lipofectamine2000和待转染microRNA,分别制成溶液，混合,在温度为22°C，震荡频率为60Hz的条件下，放置20min，得混合液，混合液中microRNA的浓度为0.74mol/L，脂质体的浓度为5.9% (v/v)；
[0031]在温度为22°C，振荡频率为60Hz的条件下，将前述混合液与血小板共培养，培养时间为36h，离心，收集血小板，即可。
[0032]以下采用实验例的方式验证本发明方法可以将HiiCT0RNA有效转入血小板中:
[0033]实验例I
[0034]血小板中存在miR-30c，其可以下调PA1-1 (纤溶酶原激活物抑制物I)的表达。若在血小板中导入miR-30c，血小板中miR-30c的含量应当增加，PA1-1表达应当下调；若在血小板中导入ant1-miR-30c (反义miR_30c),血小板中miR_30c的表达应当被抑制,PA1-1的表达应当上调。
[0035]因此，如下实验采用本发明方法转染miR_30c和antiniR-30c(反义miR_30c)的，通过检测miR-30c的表达量和PA1-1的表达量，验证转染是否成功。
[0036]miR-30c 的序列:uguaaacauccuacacucucagc ；
[0037]ant1-miR-30c 的序列:cugggagaaggcuguuuacucu。
[0038]一、实验材料:
[0039]健康人外周血加入加入枸橼酸葡萄糖(85mM柠檬酸三钠；78mM柠檬酸，IllmM葡萄糖)抗凝;乙二胺四乙酸(EDTA) ；3ml Tyrode’ s 缓冲液(containingl38mM NaCl, 5.5mMdextrose, 12mM NaHCO3, 0.8mMCaCl2, 0.4mM MgCl2, 2.9mM KCl, 0.36mM Na2HP04and20mMHepes, pH7.4) ； I μ M prostaglandin 12 ;高速冷冻离心机(Eppendorf Centrifuge5804R),自动凝胶成像系统Gel DocXR+ (美国BIO-RAD公司)，ND-1000微量紫外可见分光光度计(美国 NanoDrop 公司)，超净工作台(SW-CJ),超低温冰箱(Thermo_80°C ) ,mirVanaTM miRNAIsolation Kit、siP0RTTMNeoFXTM、miR-30c、ant1-miR-30c 及其阴性 Negative Control(美国 Ambion 公司)，DEPC (美国 Invitrogen 公司)，E.coli poly (A) Polymerase、rATP (NEB公司)，逆转录试剂盒(TaKaRa 公司)，20bp DNA Ladder Marker>2 X Taq PCR Master Mix 等(北京天根生化科技公司)，荧光素酶检测试剂盒(Promega)，HEK293细胞系(ATCC);酶标仪(赛默飞世尔(上海)仪器有限公司)、寡核苷酸序列、PCR引物合成和序列测序(InvitiOgen公司)；lipofectamine2000 (Invitrogen 公司)
[0040]二、实验方法
[0041](一)、血小板准各:
[0042]采用梯度离心法，取健康志愿者外周血按1:9比例加入枸橼酸葡萄糖溶液(85mM柠檬酸三钠；78禮柠檬酸，111禮葡萄糖)后20(^条件下离心lOmin，吸取上清富含血小板血清(PRP)。
[0043]将PRP进一步1000g离心IOmin使血小板沉淀后，加入3ml Tyrode’ s缓冲液(138mM NaCl, 5.5mM dextrose, 12mM NaHCO3, 0.8mM CaCl2, 0.4mM MgCl2, 2.9mM KC12，0.36mMNa2HPO4 和 20mM Hepes, pH7.4),再加入 I μ M 前列腺素 12 (prostaglandin 12),重悬于Tyrode’ s缓冲液中清洗3次后沉淀血小板，血小板(2X IO8个/ml)混悬于培养液DMEM中待用。
[0044](二)、血小板内转染
[0045]miR-30c组:采用如下方法转染miR_30c后的血小板；anti_miR-30c组(反义miR-30c):采用如下方法转染ant1-miR-30c后的血小板；以未处理血小板作为空白对照。
[0046]转染程序如下:
[0047]a)取血小板；
[0048]b)将siP0RTTMNeoFX?转染试剂60 μ I，与690 μ I的DMEM培养基混匀，室温22 V孵育5min ；
[0049]c) 245 μ I的DMEM培养基中加入15 μ I的50 μ M浓度的miR_30c使终浓度为50nM(或15 μ I的50 μ M浓度的anti_miR-30c，使终浓度50nM)，轻柔混匀后室温22°C下放置 5min。[0050]d)将上述b和c混合，并22°C轻摇(震荡频率为60Hz) 20min后，按每孔500 μ I/加入6孔板待用；
[0051]e)取a步血小板悬液按每孔1500 μ I/孔覆盖在上述混液上，前后轻轻晃动培养板以充分混匀，继续室温22°C振荡培养，振荡频率60Hz ；
[0052]f)转染振荡培养24h后，离心收集血小板。
[0053](三)、检测丨
[0054]利用莖环real-time RCR检测转染后miR_30c表达变化状况；突光定量real-timeRCR检测靶基因(PA1-1) mRNA表达变化。
[0055]小分子RNA提取方法:
[0056]首先在转染后收集的血小板中加入2ml Lysis/Binding Buffer,并充分混匀后，加入0.2ml miRNA匀衆添加剂(Homogenate Additive),充分混匀，冰上静置IOmin ;然后加等体积的酸-苯酹氯仿(Acid-phenol chloroform),在润流振荡器(Vortex)上振荡30-60s ;室温下10，OOOg离心5min，以分离水相和有机相，此时移取上层液体到另一离心管，并确定移取的上层液体体积。准确加入1/3体积的常温保存的无水乙醇，并混匀后加入到滤芯(Filter Cartridge)中在10，OOOg条件下离心15s并收集滤液,此步滤芯(FilterCartridge)中可吸附mRNA。然后收集滤液,再准确加入2/3体积的常温保存的无水乙醇，并混匀后加入到滤芯(Filter Cartridge)中在10，OOOg条件下离心15s,弃滤液,此步滤芯(Filter Cartridge)中可吸附< 200nt小分子RNA。分别取吸附mRNA的滤芯(FilterCartridge)和吸附< 200nt小分子RNA的滤芯(Filter Cartridge),加入700 μ I洗漆液(Wash solution)l后在10，OOOg条件下离心5-lOs,并弃滤液；再加入500 μ I洗漆液(Washsolution) 2/3后10，000g5-10s离心并弃滤液后，10, OOOg空转Imin,去处残留的洗漆液(Wash solution);将滤柱移至另一收集管(Collection Tube)中，加入100 μ 195°C预热的洗脱液(Elution Solution)并以10，000g20-30s离心收集滤液，即为血小板mRNA。
[0057]1、血小板中miR_30c含量检测
[0058]1. 引物的设计与合成:根据miR-30c的序列信息，设计、合成RT引物和PCR扩增引物。
[0059]反转录引物设计:在固定茎环结构:
[0060]GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 序列后面加上候选 miRNAs 最后6个碱基的互补序列，形成颈环结构RT引物。
[0061]PCR引物设计:miR_30c经颈环RT逆转录之后，Reverse prime引物为茎环结构上固定序列，引物序列为:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。Forward primer(GCTGCGCTGTAAACATCCTACACT)为候选miRNAs除去茎环逆转录所加碱基的剩余序列，并在5’端增加若干GC碱基以调适TM值。
[0062]2.miR-30c的莖环RT逆转录:利用上述逆转录引物,通过逆转录试剂盒(Takara)进行逆转录反应，获得候选miRNAs特异性Stem-loop-cDNAs模板。
[0063]3.miR-30c的实时荧光定量PCR检测:以人U6为内参标准，分别以miR_30c的茎环RT逆转录产物为模板，利用SYBR green荧光定量方法检测miR-30c特异性表达情况。
[0064]利用BIO-RAD IQ5荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR，各样品均设置3个平行反应。反应体系:样品 cDNA/U6/miRNA 的标准品 2μ I, SYBR Premix Ex Taq (2Xconc)10 μ I, IOuM的引物各I μ I (Tablel)，补RNase-Free水至20 μ L.反应程序:95°C预变性2min，95°C变性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 30s，循环 30 次，72°C延伸 3min 后，60°C到 95°C绘制融解曲线，71Cycle (每个循环降0.5°C ),2_Δ Δ Ct方法计算相对表达量。
[0065]I1、荧光实时定量PCR检测血小板中PA1-1RNA含量
[0066]1、逆转录
[0067]I)在RNase free的PCR管中配置下列溶液.[0068]
【权利要求】
1.一种将microRNA转染到血小板中的方法,其特征在于:包括如下步骤: a)将待转染microRNA与脂质体制混匀，得混合溶液； b)在温度为22°C，振荡频率为60Hz的条件下，将步骤a的混合溶液与血小板共培养12~36h,离心，收集血小板，即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤a)中，所述脂质体为阳离子脂质体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述阳离子脂质体是SiPORTTMNeoFXTM或 Lipofectamine2000。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤a)所述混合溶液中，microRNA的浓度为0.7~0.8mol/L，脂质体的浓度为5~7% (v/v)。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述混合溶液中，microRNA的浓度为0.74mol/L，脂质体的浓度为5.9% (v/v)。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤a)所述混匀的方法如下:将脂质体和待转染microRNA混合，在温度为15~25°C，震荡频率为50~70Hz的条件下，放置10~30min,即得混合溶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述温度为22°C，震荡频率为60Hz，放置时间为20min。`
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤b)中，所述共培养的时间是24h。
9.权利要求1~8任意一项所述方法制备的血小板。
【文档编号】C12N5/078GK103695471SQ201310731807
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】罗茂, 吴剑波, 李蓉 申请人:泸州医学院