一种用于检测猪轮状病毒的试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明为一种用于检测猪轮状病毒的试剂盒，试剂盒包含RT反应液、2×Taq?PCR?Master?Mix、阳性对照、阴性对照、DEPC水、上游引物P1和下游引物P2的混合液。本发明与现有检测技术相比，具有特异性好、灵敏度较高、方法简单、耗时短等优点，适用于各种科研单位和养殖场大批量快速检测的需要。
【专利说明】一种用于检测猪轮状病毒的试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种用于检测猪轮状病毒的试剂盒及其检测方法，属于生物检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]轮状病毒(Rotavirus, RV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavims)，是引起人和各种幼龄动物发生非细菌性腹泻的主要病原之一，在世界范围内威胁人类健康和影响养殖业的发展。猪轮状病毒病是猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRV)引起的主要以仔猪厌食、呕吐、腹泻、脱水和酸碱平衡紊乱为特征性症状的疾病。本病呈地方流行性，常与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、大肠杆菌等混合感染，仅依靠流行病学、临床症状和病理变化难以鉴别诊断。在我国猪轮状病毒感染非常普遍，有些地区仔猪断奶后阳性率甚至超过70%，给畜牧业造成严重的经济损失。
[0003]猪轮状病毒的检测方法主要包括病毒分离鉴定、电镜观察、免疫荧光抗体、胶体金技术、RT-PCR和ELISA等抗原抗体检测技术，而猪轮状病毒的细胞分离培养非常困难，用电镜技术、免疫荧光抗体技术等检测病毒成本高而且需要特殊仪器，这些技术均不能满足快速检测猪轮状病毒抗原的需求。由于猪场的猪轮状病毒隐性感染较为普遍，而临诊对该病毒的确诊难度较大，因此，研发一种特异性好，灵敏度较高，方法简单，耗时短，能直接快速检测猪粪便中猪轮状病毒病原的试剂盒，将具大巨大的应用价值。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种用于检测猪轮状病毒的试剂盒及其检测方法。根据猪轮状病毒全基因序列保守的VP6蛋白区域，使用Primer5.0软件设计了特异性引物，通过使用RT-PCR的方法，对猪群中猪轮状病毒的感染情况进行监测。该试剂盒用时少，灵敏度较高，适用于猪轮状病毒病原的快速诊断，可为猪轮状病毒的流行病学调查及其相关研究提供一定的技术支持。
[0005]为了达到以上目的，本发明采取了以下技术方案:
[0006]一种用于检测猪轮状病毒的试剂盒，包含RT反应液、2XTaq PCR Master Mix、阳性对照、阴性对照、DEPC水、上游引物PI和下游引物P2的混合液。
[0007]所述的RT反应液包含RT缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶、IOmM的dNTP、下游引物P2，几种成份的比例为4:1:1:2: 2，所述RT反应液的使用浓度为2X。
[0008]所述的阳性对照为PRV S株细胞毒，阴性对照为DEPC水。
[0009]所述的上游引物Pl和下游引物P2的混合液分别是上游引物Pl:5’ -AAAGATGCTAGGGACAAAATTG-3’ ；以及下游引物 P2:5’ -TTCAGATTGTGGAGCTACTCCA-3’ 两种引物按1:1比例的混合液。
[0010]所述的P1、P2引物混合液，扩增出309bp的DNA片段，扩增序列为:
[0011 ] AAAGATGCTAGGGACAAAATTGTTGAAGGTACATTATATTCTAATGTCAGCGATCTCATTCAGCAATTTAATCAAATGATAGTAACTATGAATGGAAATGACTTTCAAACTGGAGGAATAGGTAATTTACCTGTTAGAAACTGG
ACTTTTGACTTTGGTCTATTAGGCACAACACTCTTAAATTTAGATGCCAATTATGTTGAGAATGCAAGAACAACG
ATTGAATATTTTATTGATTTTATTGACAATGTATGTATGGATGAAATGGCAAGAGAGTCACAAAGAAATGGAGTA
GCTCCACAATCTGAA
[0012]所述的PCR 反应条件为:94°C 7min，94°C 30s、56°C 30s,72°C 30s，反应 32 个循环，最后72°C延伸7min。
[0013]本发明与现有检测技术相比具有特异性好，灵敏度较高，方法简单，耗时短，不仅能够适用于各种科研单位研究的需要，也能够满足各种规模养殖场复杂养殖环境下大批量快速检测的需要。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1目的基因PCR扩增的结果。
[0015]其中M =Marker DL2000 ；1:PCR扩增产物；2:阴性对照。
[0016]图2本发明检测方法的特异性实验结果。
[0017]其中M =Marker DL2000 ；1:猪流行性腹泻病毒；2:猪传染性胃肠炎病毒；3:猪瘟病毒；4:猪繁殖与呼吸综合征病毒；5:猪伪狂犬病毒；6:猪细小病毒；7:猪轮状病毒；8:阴性对照。
[0018]图3本发明检测方法的敏感性实验结果。
[0019]其中M:MarkerDL2000 ;1~6:RT反应体系中加入的连续10倍稀释的制备样品；7:阴性对照。
【具体实施方式】
[0020]下面结合实施例对本发明进行进一步详细说明。
[0021]实施例1试剂盒的制备和使用方法
[0022]1、引物的设计与合成
[0023]参照GenBank，根据猪轮状病毒全基因序列中保守的VP6蛋白区域，用Primer5.0软件设计一对特异性引物，分别为上游引物Pl:5’-AAAGATGCTAGGGACAAAATTG-3’ ;下游引物P2:5’ -TTCAGATTGTGGAGCTACTCCA-3’，经过 PCR 反应后，能够扩增出 309bp 的 DNA 片段。
[0024]2、样品的制备
[0025](I)取疑似猪轮状病毒发病猪的肠道和粪便样品0.5g，剪碎并置于研磨器中，加入Iml PBS研磨，将研磨液置于1.5ml灭菌离心管中，3000r/min离心15min,取上清300 μ 1，置于1.5mL灭菌离心管中作为待检样品备用。
[0026](2)分别取阳性对照、待检样品、阴性对照300μ 1，置于1.5ml灭菌离心管中，加750 μ ITrizol，剧烈震荡摇匀，室温下放置5min。
[0027](3)加入200 μ I氯仿，剧烈震荡15s，然后在室温下静置IOmin后，4°C、12000r/min 离心 15min。
[0028](4)将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温下保持lOmin，然后在4°C、12000r/min条件下离心10min，RNA就会在离心管的侧壁和底部形成沉淀。[0029](5)小心弃尽上清,用冰冷的75%乙醇Iml洗漆沉淀,4°C、12000r/min离心5min。弃乙醇，沉淀置于超净台在室温下充分干燥后，用EDPC水30ul溶解，-20°C保存备用。
[0030]3、试剂盒的制备
[0031]本试剂盒由以下组分组成:
[0032]
【权利要求】
1.一种用于检测猪轮状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒内包含RT反应液、2XTaq PCR Master Mix、阳性对照、阴性对照、DEPC水、上游引物Pl和下游引物P2的混合液。
2.权利要求1所述的一种用于检测猪轮状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的RT反应液包含RT缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶、IOmM的dNTP、下游引物P2，几种成份的比例为4:1:1:2: 2，所述RT反应液的使用浓度为2X。
3.权利要求1所述的一种用于检测猪轮状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为PRV S株细胞毒。
4.权利要求1所述的一种用于检测猪轮状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照为DEPC水。
5.权利要求1所述的一种用于检测猪轮状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的上游引物Pl和下游引物P2的混合液分别是上游引物Pl:5’ -AAAGATGCTAGGGACAAAATTG-3，；下游引物P2:5’ -TTCAGATTGTGGAGCTACTCCA-3’两种引物按I: I比例的混合液。
6.权利要求1所述的一种用于检测猪轮状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的P1、P2引物混合液，经过PCR反应后，能够扩增出309bp的DNA片段，扩增出的序列为:AAAGATGCTAGGGACAAAATTGTTGAAGGTACATTATATTCTAATGTCAGCGATCTCATTCAGCAATTTAATCAAATGATAGTAACTATGAATGGAAATGACTTTCAAACTGGAGGAATAGGTAATTTACCTGTTAGAAACTGGACTTTTGACTTTGGTCTATTAGGCACAACACTCTTAAATTTAGATGCCAATTATGTTGAGAATGCAAGAACAACGATTGAATATTTTATTGATTTTATTGACAATGTATGTATGGATGAAATGGCAAGAGAGTCACAAAGAAATGGAGTAGCTCCACAATCTGAAo
7.权利要求1所述的一种用于检测猪轮状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应条件为:94°C 7min,94°C 30s,56°C 30s,72°C 30s，反应 32 个循环，最后 72°C延伸 7min。
【文档编号】C12Q1/68GK103740861SQ201310737875
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】董剑辉, 张志刚, 张文利, 张晓杰, 金忠辉 申请人:北京伟嘉人生物技术有限公司, 湖南农大动物药业有限公司