一种芳基硫酸酯酶的生产菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种芳基硫酸酯酶的生产菌株及其应用，具体提供了保藏编号为CCTCC?NO:M?2013613的菌株、所述菌株在生产芳基硫酸酯酶中的应用、利用所述菌株生产芳基硫酸酯酶的方法以及一种生产高凝胶强度、低电内渗琼胶的方法。本发明筛选获得的菌株可有效地生产芳基硫酸酯酶，所述芳基硫酸酯酶可用于酶解琼胶粉，特异性地脱出硫琼胶多糖上的硫酸根，大大提高了高凝胶强度、低电内渗琼胶的得率，在工业生产中具有重要的应用价值。
【专利说明】一种芳基硫酸酯酶的生产菌株及其应用
【【技术领域】】
[0001]本发明涉及微生物【技术领域】，具体地说，是一种芳基硫酸酯酶的生产菌株及其应用。
【【背景技术】】
[0002]琼胶(Agar)来源于石花菜、江蓠等红藻，是一种具有特殊凝固性和稳定性的多糖，被广泛应用于食品、化工等科学研究领域。其化学组成包括不含硫酸根的琼脂糖和含有硫酸根的硫琼胶两部分。琼脂糖是形成凝胶的组分，而硫琼胶是非凝胶部分，也是商业琼胶提取过程中力图除去的部分。琼胶的凝胶强度和电内渗大小与硫酸根的含量关系密切，硫酸根含量高者，凝胶强度低，电内渗值大；反之，凝胶强度大，电内渗值小。不同硫酸根含量的琼胶有不同的用途，含有2% -7%硫酸根的琼胶，基于其不同的凝胶强度，不但可以作为增稠剂和凝固剂应用于食品工业，还可以作为固化剂用于固体和半固体微生物培养；硫酸根含量低于2%的低电内渗琼胶在生化分离和分子生物学研究中应用于凝胶过滤、凝胶扩散和凝胶电泳。琼胶基于不同的电内渗值，又可细分为中等电内渗、低电内渗、超低电内渗琼胶。目前，普通琼胶的售价约为20，000美元/吨,而各种低电渗琼胶的价格为普通琼胶的1000~2000倍。随着食品工业、生化分离技术和分子生物学研究的不断发展，对不同电内渗琼胶的需求量将逐渐增加。
[0003]碱处理是目前常用的琼胶制备方法，但该方法不经济、不环保，同时会使琼胶的颜色加深及琼胶分子部分降解而导致其凝胶强度下降。高凝胶强度、低电内渗琼胶的制备则主要采用分离并脱除琼胶中硫琼胶的方法，如聚乙二醇法、异丙醇法、季铵盐法、DEAE纤维素法等。以上方法由于脱除了琼胶中的硫琼胶组分，均存在处理工艺复杂、回收率低(}30% )的缺陷。
[0004]芳基硫酸酯酶(Arylsulfatase)是一种催化裂解硫酸酯键，生成相应的醇和无机硫酸根的酶。利用酶法特异性地脱出硫琼胶多糖上的硫酸根，而非生化分离方法脱除硫琼胶，必将大大提高高凝胶强度、低电内渗琼胶的得率。目前国内尚无从海洋资源中筛选得到产芳基硫酸酯酶菌株的相关报道，也没有用自然界产生的芳基硫酸酯酶生产高凝胶强度、低电内渗琼胶的报道。
【
【发明内容】
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[0005]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种生产芳基硫酸酯酶的菌株。
[0006]本发明的再一的目的是提供上述菌株的用途。
[0007]本发明的另一的目的是提供一种芳基硫酸酯酶的制备方法。
[0008]本发明的第四个目的是提供一种生产高凝胶强度、低电内渗琼胶的方法。
[0009]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:一种生产芳基硫酸酯酶的菌株，所述的菌株保藏编号为CCTCC N0:M2013613，保藏日期:2013年11月27日，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址:中国.武汉.武汉大学，培养物名称:海单胞菌FW—lMarinomonas sp.FW—1。
[0010]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:如上所述的菌株在生产芳基硫酸酯酶中的用途。
[0011]为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:
[0012]一种芳基硫酸酯酶的制备方法，包括以下步骤:发酵培养如上所述的菌株，然后从菌体中分离纯化芳基硫酸酯酶。
[0013]优选地，所述的从菌体中分离纯化芳基硫酸酯酶具体是:收集菌体，用0.05M/L、PH = 7.2的Tris-HCl缓冲液复溶菌体，冰浴条件下进行功率为200w的超声细胞破碎，离心取上清，得到胞内酶液；取胞内酶液加入硫酸铵至其终浓度为20%，静置6h，4°C、1000Or/min离心lOmim，弃沉淀取上清，上清加入硫酸铵至其终浓度为60%，静置12h，4°C、1000Or/min离心lOmim，弃上清取沉淀；沉淀用0.05M/L、pH = 7.2的Tris-HCl溶解，4°C下用30KD的透析袋透析12h ;之后用50KD的超滤膜超滤浓缩即得酶液。
[0014]为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是:
[0015]一种生产高凝胶强度、低电内渗琼胶的方法，包括以下步骤:
[0016]a)培养如上所述的菌株并分离纯化得到芳基硫酸酯酶；
[0017]b)取琼胶粉，加入去离子水并调节pH至9，再加入步骤a)的芳基硫酸酯酶，在45 °C下进行酶解反应。
[0018]所述的琼胶粉是石花菜琼胶粉和/或江蓠琼胶粉和/或其它红藻琼胶粉。
[0019]本发明优点在于:本发明筛选获得一种芳基硫酸酯酶生产菌株，可通过发酵培养该菌获得芳基硫酸酯酶，将其用于酶`解琼胶粉能特异性地脱除硫琼胶多糖上的硫酸根，大大提高了高凝胶强度、低电内渗琼胶的得率，在工业生产中具有重要的应用价值。
【【具体实施方式】】
[0020]下面对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0021]实施例1
[0022]一:菌株 Marinomonas sp.FW-1 的筛选和鉴定
[0023]对青岛沿岸海域的海藻样品进行微生物富集、初筛、复筛，获得产酶稳定的目标菌，并根据其形态、生理生化特征及分子生物学进行菌种鉴定。
[0024](I)微生物富集培养:无菌条件下取适量采集的海藻样品于无菌烧杯中，加入适量无菌不含硫酸根的人工海水(NaC120.0Og, MgCl2.6Η201.61g，KC15.0Og, CaCl2L 06g，K2HPO4.3Η200.85g，FeCl2.4Η200.51g，蒸馏水 1L，pH = 8)。用八层医用纱布封口，在室温阴凉处自然发酵5天。
[0025](2)产酶微生物初筛:将富集发酵液经滤纸过滤后，进行梯度稀释，取0.5mL菌液涂布于表面涂有100 μ L母液浓度为5mM/L的对硝基苯酚硫酸酯钾盐(pNPS)的选择性培养基(蛋白胨2%。，酵母膏3%。，琼脂4%，不含硫酸根的人工海水lL，pH = 8)平板上，在28°C培养2d后定期观察平板上底部及周围呈现黄色的菌落，在2216E培养基(购自青岛高科园海博生物技术有限公司)中进行纯化培养，并接种于斜面培养基，置于4°C冰箱保存。
[0026](3)产酶微生物复筛:将上述纯化后的斜面菌种分别接种于上述选择性培养基中再次进行底物颜色验证，取底物及周围呈现明显黄色的菌落接种于液体培养基(蛋白胨2%。，酵母膏3%。，琼脂0.4%，不含硫酸根的人工海水1L，pH = 8)，在28°C，IOOrpm条件下摇床培养2d，定时取样，用pNPS进行酶活测定。酶活力测定的条件:取2ml胞内酶与
0.5ml5mM/LpNPS均匀混合，在45°C反应lh，加入2ml0.5M的NaOH终止反应，在410nm处测吸光值。以对硝基苯酚(PNP)做标准曲线，一个酶活力单位定义为45°C条件下，每毫升酶液每分钟产生I微克PNP所需的酶量。结果获得产酶性能最好(酶活为0.25U)的菌株Marinomonas sp.FW—1。
[0027](4)产酶菌Marinomonas sp.FW-1的形态、生理生化特征及分子生物学鉴定:将目标菌接种于2216E琼脂平板培养24h后，光学显微镜、电子显微镜和生理生化鉴定其为弯的杆菌，大小为0.7 μ m~1.5 μ mX 1.8 μ m~3.0 μ m,以一根极生鞭毛运动,革兰氏染色为阴性，呼吸代谢而不是发酵代谢，明胶酶和脂酶为阴性，无盐时不生长，在海水中可以良好生长。16S rDNA分子生物学鉴定属于海单胞菌属,通过构建系统发育树得知与Marinomonas_alcarazii_strain有98%的相似性,说明两者是同属不同种菌株。该菌株已于2013年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址:中国.武汉.武汉大学，培养物名称:海单胞菌 FW-1Marinomonas sp.FW-1，保藏编号为 CCTCC NO:M2013613。
[0028]二:Marinomonas sp.Fff-1 菌液的制备及应用
[0029](I)Marinomonas sp.FW-1 菌液的制备
[0030]将Marinomonas sp.FW-1经发酵培养基扩大培养48h后即得菌液。
[0031](2)芳基硫 酸酯酶的分离纯化
[0032]将200mLMarmomonas sp.Fff-1 的菌液 4°C离心取菌体,用 SOmT,0.05M/L、pH = 7.2的Tris-HCl缓冲液复溶菌体，在冰浴条件下，进行功率为200w的超声细胞破碎，破碎时间为45min，离心取上清，即为胞内酶液。取胞内酶液加入硫酸铵至硫酸铵为20%浓度，静置6h ;4°C、10000r/min离心lOmim,弃沉淀取上清；上清加入硫酸铵至硫酸铵为60%浓度，静置 12h, 4°C > 10000r/min 离心 lOmim,弃上清取沉淀;沉淀用 50mL0.05M/L、pH = 7.2 的Tris-HCl溶解，4°C下用30KD的透析袋透析12h。之后经50KD的超滤膜超滤浓缩5倍后即得一定纯度的酶液。
[0033](3)芳基硫酸酯酶的应用
[0034]设定空白组和酶处理组(即实验组)两组实验，分别对石花菜和江蓠琼胶进行酶解反应，并通过测定反应前后琼胶的硫酸根含量来反映酶解效果。
[0035]空白组:取5.0Og琼胶粉，加入50mL去离子水，调节pH = 9，45°C温度下反应12h。
[0036]酶处理组:取5.0Og琼胶粉，加入200U纯化后酶液用去离子水补足50mL，调节pH=9，45 °C温度下酶解反应12h。
[0037]取两组反应前后的琼胶分别进行消化，用明胶-BaCl2法进行硫酸根含量测定。测定结果见表1和表2。
[0038]表1石花菜琼胶
[0039]
【权利要求】
1.一种生产芳基硫酸酯酶的菌株，其特征在于，所述的菌株保藏编号为CCTCC NO:M2013613。
2.权利要求1所述的菌株在生产芳基硫酸酯酶中的用途。
3.一种芳基硫酸酯酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:发酵培养权利要求1所述的菌株，然后从菌体中分离纯化芳基硫酸酯酶。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的从菌体中分离纯化芳基硫酸酯酶具体是:收集菌体，用0.05M/L、pH = 7.2的Tris-HCl缓冲液复溶菌体，冰浴条件下进行功率为200w的超声细胞破碎，离心取上清，得到胞内酶液；取胞内酶液加入硫酸铵至其终浓度为20%，静置6h，4°C、10000r/min离心lOmim，弃沉淀取上清，上清加入硫酸铵至其终浓度为60%，静置12h，4°C、10000r/min离心lOmim，弃上清取沉淀；沉淀用0.05M/L、pH=7.2的Tris-HCl溶解，4°C下用30KD的透析袋透析12h ;之后用50KD的超滤膜超滤浓缩即得酶液。
5.一种生产高凝胶强度、低电内渗琼胶的方法，其特征在于，包括以下步骤: a)培养权利要求1所述的菌株并分离纯化得到芳基硫酸酯酶； b)取琼胶粉，加入去离子水并调节pH至9，再加入步骤a)的芳基硫酸酯酶，在45°C下进行酶解反应。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的琼胶粉是石花菜琼胶粉和/或江蓠琼胶粉 。
【文档编号】C12R1/01GK103710288SQ201310745723
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】付晓婷, 王志朋, 王雪艳, 林洪, 许加超, 高昕 申请人:中国海洋大学