一种促胰岛细胞增殖培养液及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种促胰岛细胞增殖培养液，它以常用细胞培养基为基础培养基，添加本发明化合物1～8中任意一种或者多种化合物。本发明还公开了前述培养液的制备方法，以及化合物1～8在制备促胰岛细胞增殖的培养液中的用途。本发明培养液可以有效促进胰岛细胞增殖，实现了胰岛细胞的体外快速培养，为糖尿病患者的胰岛细胞移植提供了可靠的来源。
【专利说明】一种促胰岛细胞增殖培养液及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物领域，特别涉及一种促胰岛细胞增殖的培养液及其制备方法。
【背景技术】
[0002]糖尿病是一种由胰岛素分泌不足导致的慢性代谢疾病，尤其是血糖水平的异常，晚期可导致肾脏、眼底、周围神经系统和血管等组织器官的病变，并伴有失明、肾衰等严重症状的罹患风险。据估计目前全球有超过1.5亿人患有糖尿病，而预计在2025年糖尿病患者将达到3亿。
[0003]目前糖尿病主要可分为两种类型:一型糖尿病和二型糖尿病。前者主要是由胰岛素的绝对不足引起的，而胰岛素绝对量的不足则是由于人体中唯一可以分泌胰岛素的细胞一胰岛β细胞的严重不足。目前研究表明，胰岛β细胞缺失的主要原因是T细胞对β细胞的自体免疫攻击。二型糖尿病则的主要病因则是胰岛素的靶器官(肝脏、肌肉等)对胰岛不敏感，而更深层的病因较一型糖尿病更为复杂。二型糖尿病在初期只表现为胰岛素的相对缺乏，并伴随有应激性的胰岛增殖和高胰岛素表现，而在晚期由于长期高血糖导致的胰岛β细胞的大量凋亡，胰岛素水平也大量下降。因此，针对一型和二型糖尿病，胰腺或胰岛移植都是最理想的治疗方案之一。[0004]胰腺器官移植较胰岛移植开展得早，相对而言能提供更长时间的正常胰岛素供给，但是胰腺器官移植手术难度高，风险大，作为糖尿病的治疗手段并不十分理想。目前，供体胰岛的移植是治疗糖尿病的最有效手段，胰岛细胞按其染色和形态学特点，主要分为α细胞、β细胞、Y细胞及PP细胞，α细胞约占胰岛细胞的20%，分泌胰高血糖素(glucagon);β细胞占胰岛细胞的60%-70%，分泌胰岛素(insulin) ； Y细胞占胰岛细胞的10%，分泌“生长抑素”;PP细胞数量很少，分泌胰多肽(pancreatic polyeptide),其中，胰岛β细胞分泌胰岛素，起调节血糖含量的作用。
[0005]目前，临床获得的胰岛来源非常有限，需要在体外将供体来源的少量胰岛充分扩展和增殖。然而，目前采用常用细胞培养基培养胰岛细胞的方式，难以快速、有效的扩增得到大量胰岛细胞。
【发明内容】
[0006]为了解决上述问题，本发明提供了一种促胰岛细胞增殖的培养液以及8种化合物在制备促胰岛细胞增殖的培养液中的用途。
[0007]本发明促胰岛细胞增殖培养液，它以常用细胞培养基为基础培养基，添加有如下任意一种或者多种化合物:
[0008]化合物1:1- (3- (3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基)吡啶_4_哌啶_4_羧酸；
[0009]化合物2:1- (3- (3-氨基-6-甲酰氨基_2_苯基)吡啶_4_哌啶_3_羧酸；
[0010]化合物3:6- ((2- ((4- (2，4- 二氯苯基)-5- (4-甲基-1H-咪唑 _2_ 基)嘧唳~2~基)氨基)乙基)氨基)尼古丁腈；[0011]化合物4:N-(5-甲基-1氢-吡唑-3-基)-2-苯基喹唑啉_4_胺；
[0012]化合物5:3_氨基-N-(4-(4-氨基哌啶-1-基)吡啶_3_基)_6_苯基吡嗪_2_甲酰胺；
[0013]化合物6:3-氨基4-(4-((二甲)甲基)吡啶-3-基)-6_苯基-2-甲酰胺基；
[0014]化合物7:1-(4-甲氧基苄基)-3_ (5-硝基噻唑_2_基)尿素；
[0015]化合物8:N-(3-异丙氧基丙基)-4-(4-甲基苯甲酰胺)_1氢-吡唑_3_甲酰胺。
[0016]常用细胞培养基，是指包含供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质的培养基，如，RPM1-1640培养基(B卩1640培养基)，最低必须培养基(Minimum Essential Medium,MEM)、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、DMEM/F12培养基、M-199培养基等等。
[0017]所述的培养液添加的化合物的终浓度不低于ΙΟηΜ。优选地，所述化合物的终浓度不低于ΙΟΟηΜ。进一步优选地，所述化合物的终浓度为IOOnM~100 μ M。
[0018]所述常用细胞培养基是1640培养基、最低必须培养基、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、DMEM/F12培养基或Μ-199培养基。
[0019]所述培养液中还添加有胰岛素样生长因子、上皮生长因子、青霉素、链霉素、巯基乙醇、葡萄糖或胎牛血清。优选地，所述培养液中含有胰岛素样生长因子和上皮生长因子，其中，胰岛素样生长因子的终浓度为10ng/ml，上皮生长因子的终浓度为10ng/ml。
[0020]所述胰岛细胞为胰岛β细胞。胰岛β细胞又叫胰岛B细胞。
[0021]本发明前述培养液的制备方法，步骤如下:按照前述配比取原料，混匀，即可。
[0022]如下化合物I~8中任意一种或者多种在制备促进胰岛细胞增殖的培养液中的用途:
[0023]化合物1:1- (3- (3-氨基-6-甲酰氨基_2_苯基)吡啶_4_哌啶_4_羧酸；
[0024] 化合物2:1- (3- (3-氨基-6-甲酰氨基_2_苯基)吡啶_4_哌啶_3_羧酸；
[0025]化合物3:6_ ((2- ((4- (2，4_ 二氯苯基)_5_ (4-甲基-1H-咪唑 _2_ 基)嘧唳~2~基)氨基)乙基)氨基)尼古丁腈；
[0026]化合物4:N- (5-甲基-1氢-吡唑-3-基)_2_苯基喹唑啉_4_胺；
[0027]化合物5:3-氨基-N- (4- (4-氨基哌啶_1_基)吡啶_3_基)_6_苯基吡嗪_2_甲酰胺；
[0028]化合物6:3_氨基-N- (4- (( 二甲)甲基)吡啶_3_基)_6_苯基_2_甲酰胺基；
[0029]化合物7: 1-(4-甲氧基苄基)-3- (5-硝基噻唑_2_基)尿素；
[0030]化合物8:N-(3-异丙氧基丙基)-4-(4-甲基苯甲酰胺)_1氢-吡唑_3_甲酰胺。
[0031]所述胰岛细胞为胰岛β细胞。
[0032]本发明化合物I~8可以有效促进胰岛β细胞增殖，采用本发明培养液体外培养胰岛细胞，可以快速培养得到大量胰岛β细胞，用于体内移植治疗糖尿病，临床应用前景良好。
[0033]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0034]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1胰岛分离体系示意图；
[0036]图2DTZ染色图片，红棕色为胰岛细胞；
[0037]图3Annexin-V/PI染色评价原代培养的胰岛的存活率，绿色的Annexin-V荧光(染存活细胞)和红色的PI荧光(染死亡细胞)；
[0038]图4免疫荧光染色结果(ΙΟηΜ)，胰岛素C-肽绿色荧光染色提示阳性胰岛beta细胞染色，DAPI的蓝色染色提示细胞核染色。红色、黄色、橙色和紫色荧光染色均提示为k1-67阳性染色(k1-67阳性染色本身为红色荧光，红色与胰岛素C-肽的绿色荧光重合显示为黄色和橙色，而红色与DAPI的蓝色荧光重合显示为紫色)。A1,A2:DMS00.1%;BI, B2:K5010nM ；C1, C2:K5210nM ；
[0039]图5免疫荧光染色结果(ΙΟΟηΜ)，胰岛素C-肽绿色荧光染色提示阳性胰岛beta细胞染色，DAPI的蓝色染色提示细胞核染色。红色、黄色、橙色和紫色荧光染色均提示为k1-67阳性染色(k1-67阳性染色本身为红色荧光，红色与胰岛素C-肽的绿色荧光重合显示为黄色和橙色，而红色与DAPI的蓝色荧光重合显示为紫色)。Al, A2:DMSO0.1%;BI,B2:K50100nM ；C1,C2:K52100nM ；
[0040]图6免疫荧光染色结果(100 μ M)，胰岛素C-肽绿色荧光染色提示阳性胰岛beta细胞染色，DAPI的蓝色染色提示细胞核染色。红色、黄色、橙色和紫色荧光染色均提示为k1-67阳性染色(k1-67阳性染色本身为红色荧光，红色与胰岛素C-肽的绿色荧光重合显示为黄色和橙色，而红色与DAPI的蓝色荧光重合显示为紫色)。A1,A2:DMS00.1%;Β1,Β2:Κ50100μΜ ；Cl,C2:K52100yM ；
[0041 ] 图7IOnM和IOOnM的K50和K52对原代培养的大鼠β _胰岛细胞增殖的作用(用k1-67增殖指数表示胰岛细胞增值率，即胰岛beta-细胞增殖分数，k1-67增殖指数为K1-67阳性染色细胞数占总的C-肽绿色荧光染色细胞的百分率)。数据表示为means土SEM，n=4/组，多样本均数间的比较采用One-wayANOVA检验，组间的两两比较采用Studen_tNewman-Keuls 检验，*P〈0.05vs.DMSO (1/1000)处理的对照组；
[0042]图8100 μ M的Κ50和Κ52对原代培养的大鼠β _胰岛细胞增殖的作用(用k1-67增殖指数表示胰岛细胞增值率，即胰岛beta-细胞增殖分数，k1-67增殖指数为Ki_67阳性染色细胞数占总的C-肽绿 色荧光染色细胞的百分率)。数据表示为means 土 SEM，n=3/组，多样本均数间的比较采用One-way ANOVA检验,组间的两两比较采用Studen-t Newman-Keuls检验，*P〈0.05vs.DMSO (1/1000)处理的对照组；
[0043]图910nM和IOOnM的K50和K52对大鼠胰岛细胞瘤来源的INS-1细胞系增殖的作用，采用BrdU-ELISA法检测INS-1细胞增殖活性，用酶标仪检测490nm处的ELISA反应产物的吸光度值。数据表示为means土SEM, n=3/组,多样本均数间的比较采用One-way ANOVA检验，组间的两两比较米用Studen-t Newman-Keuls检验，*Ρ〈0.05vs.DMSO (1/1000)处理的对照组；
[0044]图10IOOnM的K51，K53，K54，K55，K56，K57对大鼠胰岛细胞瘤来源的INS-1细胞系增殖的作用，采用BrdU-ELISA法检测INS-1细胞增殖活性，用酶标仪检测490nm处的ELISA反应产物的吸光度值，数据表示为“mean (SD) ”，n=3/组。【具体实施方式】
[0045]实施例1本发明促胰岛细胞增殖培养液的制备
[0046]取RPM1-1640培养基，加入1_ (3- (3_氨基_6_甲酰氨基_2_苯基)吡啶_4_哌啶-4-羧酸至浓度为ΙΟΟηΜ，混匀，即可。
[0047]实施例2本发明促胰岛细胞增殖培养液的制备
[0048]取RPM1-1640培养基，加入1_ (3- (3_氨基_6_甲酰氨基_2_苯基)吡啶_4_哌啶-3-羧酸至浓度为100 μ M，混匀，即可。
[0049]实施例3本发明促胰岛细胞增殖培养液的制备
[0050]取最低必须培养基，加入6-((2-((4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)尼古丁腈至浓度为100 μ M，混匀，即可。
[0051]实施例4本发明促胰岛细胞增殖培养液的制备
[0052]取最低必须培养基中，加入N-(5-甲基-1氢-吡唑-3-基)-2_苯基喹唑啉-4-胺至浓度为IOnM,混，即可。
[0053]实施例5本发明促胰岛细胞增殖培养液的制备
[0054]取M-199培养基，加入3-氨基-N- (4- (4-氨基哌啶_1_基)吡啶_3_基)_6_苯基吡嗪-2-甲酰胺至浓度为ΙΟηΜ，混匀，即可。
[0055]实施例6本发明促胰岛细胞增殖培养液的制备
[0056]取DMEM-高糖培养基，加入3-氨基-N-(4_(( 二甲)甲基)吡啶_3_基)_6_苯基-2-甲酰胺基至浓度为ΙΟηΜ，混匀，即可。
[0057]实施例7本发明促胰岛细胞增殖培养液的制备
[0058]取DMEM-低糖培养基，加入1-(4-甲氧基苄基)_3_ (5_硝基噻唑_2_基)尿素至浓度为ΙΟηΜ，混匀，即可。
[0059]实施例8本发明促胰岛细胞增殖培养液的制备
[0060]取DMEM/F12培养基，加入N- (3_异丙氧基丙基)_4_ (4_甲基苯甲酰胺)_1氢-吡唑-3-甲酰胺至浓度为ΙΟΟηΜ，混匀，即可。
[0061]以下用实验例的方式说明本发明的有益效果:
[0062]实验材料:
[0063] SD雄性大鼠，300~500克，购于四川大学实验动物中心；胶原酶XI，购于美国Sigma公司；Ficoll400购于天津市聚合科贸有限公司；双硫腙(dithizone, DTZ)购于上海试剂三厂；INS-1细胞来源于华西医院再生医学研究所细胞库；Brdu ELISA试剂盒，购于罗氏公司。其余试剂为市售分析纯产品。
[0064]所用化合物，均为市售品:
[0065]化合物1:k50
[0066]l-(3-(3-amino-6-phenylpyrazine-2-carboxamido)pyridin-4-yl)piperidine-4-carbox ylic acid
[0067]1- (3- (3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基)吡啶_4_哌啶_4_羧酸
[0068]化合物2:k52
[0069]l-(3-(3-amino-6-phenylpyrazine-2-carboxamido)pyridin-4-yl)piperidine-3-ca rboxylic acid
[0070]1- (3- (3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基)吡啶_4_哌啶_3_羧酸
[0071]化合物3:K51
[0072]6-((2-((4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-lH-1midazol-2-yl)pyrimidin-2-yl)ami no)ethyl)amino)nicotinonitrile ；
[0073]6-((2-((4-(2，4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶 _2_ 基)氨基)乙基)氣基)尼古丁臆；
[0074]化合物4:K53
[0075]N-(5-methyl-lH-pyrazol-3-yl)-2-phenylquinazolin-4_amine
[0076]N-(5-甲基-1氢-吡唑-3-基)-2_苯基喹唑啉_4_胺
[0077]化合物5:K54[0078]3-amino-N- (4_(4-aminopiperidin-1-yl)pyridin-3-yl)-6-phenylpyrazine-2-carb oxamide
[0079]3-氨基-N- (4- (4-氨基哌啶_1_基)吡啶_3_基)_6_苯基吡嗪_2_甲酰胺
[0080]化合物6:K55
[0081]3-amino-N-(4_((dimethylamino)methyl)pyridin-3-yl)-6-phenylpyrazine-2-car boxamide
[0082]3-氨基-N- (4- (( 二甲)甲基)吡啶-3-基)_6_苯基_2_甲酰胺基
[0083]化合物7:K56
[0084]1-(4-methoxybenzyl)_3_ (5-nitrothiazol-2-yl)urea
[0085]1-(4-甲氧基苄基)-3- (5-硝基噻唑-2-基)尿素
[0086]化合物8:K57
[0087]N-(3-1sopropoxypropyl)~4~(4-methylbenzamido)-lH-pyrazole-3-carboxamide
[0088]N-(3-异丙氧基丙基)-4-(4-甲基苯甲酰胺)_1氢-吡唑_3_甲酰胺
[0089]实施例1本发明培养液诱导体外原代培养的大鼠胰岛细胞
[0090]1、实验方法
[0091]1.1胰岛细胞的获得
[0092]a)取2只大鼠麻醉后，腹部常规消毒去毛，作腹正中切口及双侧肋缘下切口，显露肝门，切除剑状软骨。用棉签将大鼠小肠推至腹腔左侧，暴露胆管远端。
[0093]b)在胆总管汇入十二指肠的入口处结扎，缝合时避免接触胰腺。于胆管近心端使用穿刺针原位插管，并结扎胆总管近心端。
[0094]c)动物处死，经胆总管缓慢注入0.5mg/mL胶原酶XI溶液10mL，使胰腺原位缓慢膨胀。沿肠壁分离胰腺，切取后立即置入37°C水浴静止消化约15min ;取出剧烈振摇Imin分散胰腺，使呈细沙状，立即加入10倍体积的4°C预冷Hank’ s液(含0.1%牛血清白蛋白)终止消化。
[0095]d)60目网筛过滤，用50mL注射器15G针头从筛上喷过，冲洗网上组织。于4°C离心(以离心半径15cm, 1000r/min离心lmin);弃上清；同法离心3min ;Hank’ s液重悬组织，80目网筛过滤，同法离心后收集沉淀。以上步骤均在超净台中进行。[0096]e)胰岛的纯化:首先配制Euro-Ficoll分离液，即Euro-collin保存液:含1 Smmol /T, KC1.1 Smmol /T, KH2P04、43mmol/L K2HP04、10mmol/LNaHC03、200mmol/L 葡萄糖，pH7.2 ;Euro_Ficoll液:将不同比例的Ficoll400溶解于Euro-collin中，得到不同比重(D)的分离液，如图1 所示，(Fl:D=1.132，F2:D=1.108，F3:D=1.096，F4:D=1.069，F5:D=L 023)，4°C避光保存。在50mL离心管中加入12mL Fl铺底，IOmL F2重悬沉淀组织并小心加至Fl上，注意防止气泡混入影响细胞重悬效果。依次小心加入F4和F5各6mL。以离心半径15cm，2000r/min于4°C缓慢升降离心20min，收集位于Fl和F2界面的胰岛，Hank’s液离心洗涤3次，备用。
[0097]f)胰岛特异性计数:将DTZ工作液50 μ L与纯化后的胰岛约100 μ L混合5min，显微镜下计数DTZ染为猩红色的细胞团数量。
[0098]g)胰岛活性鉴定:Annexin_V/PI溶液10 μ L与100 μ L胰岛制备物混合IOmin,在荧光显微镜下分别用490nm和510nm激发光可分别见到绿色的Annexin-V荧光(存活细胞)和红色的PI荧光(死亡细胞)。用CXD成像系统采集图像。
[0099]1.2胰岛细胞的体外扩增
[0100]原代培养的胰岛均匀接种于6孔板中，在培养基中稳定24h，略为贴壁后，分别取K50和K52加入1640培养基(含IGF10ng/ml，EGF10ng/ml),使化合物的终浓度分别达ΙΟηΜ、IOOnM和100 μ M0以含0.1%DMS0的1640培养基作为对照组培养基。
[0101]药物刺激72h后，收取细胞涂片进行普通步骤的免疫荧光染色。分别使用抗大鼠胰岛素，抗大鼠k1-67抗体进行双染，最后细胞核复染DAPI。在激光共聚焦显微镜下成像，根据胰岛素阳性(绿色)的细胞中，出现k1-67阳性(红色)占总β -细胞(绿色)的百分率测定细胞增殖率。
[0102]Κ?67是一种增殖细胞相关的核抗原，可以标记细胞增殖状态其中，具有Ki67多肽的细胞为新增殖细胞，因此，通过检测细胞是否表达Ki67多肽即可确定其是否为新增殖细胞。
[0103]2、实验结果
[0104]如图1~3所示，本发明分离得到了胰岛细胞，纯度在80%以上，成活率达90%以上。
[0105]如图4~8所示:
[0106]与对照组(1640培养基中加DMS0)相比，在1640培养基中加入IOnM的K50或K52(图4和图7)后，细胞增殖速度加快，说明终浓度为IOnM的K50或K52可以促进大鼠胰岛β细胞的增殖；
[0107]与对照组(1640培养基中加DMSO^g比，在1640培养基中加入IOOnM的Κ50或Κ52(图5和图7)后，细胞增殖速度明显加快(Ρ〈0.05，η=4)，说明终浓度为IOOnM的Κ50和Κ52可以促进大鼠胰岛β细胞的增殖；
[0108]与对照组(1640培养基中加DMS0)相比，在1640培养基中加入100 μ M的Κ50或Κ52 (图6和图8)后，细胞增殖速度明显加快(Ρ〈0.05，η=3)，说明终浓度为100 μ M的Κ50或Κ52可以促进大鼠胰岛β细胞的增殖；
[0109]如图7和 图8所示，随着Κ50或Κ52浓度的增加，它们的促胰岛细胞增殖作用增强。
[0110]实验结果说明，本发明Κ50或者Κ52可以促进大鼠胰岛β细胞增殖，浓度大于等于IOOnM时，效果明显。
[0111]实施例2本发明培养液诱导INS-1细胞
[0112]1、实验方法
[0113]取购买的胰岛β细胞株INS-1，快速解冻后分装入60mm培养皿中，加入含IOOmL/L胎牛血清RPMI1640完全培养基(含青霉素100kU/L、链霉素100mg/L、50 μ mol/L巯基乙醇、lOmmol/L葡萄糖)，单层培养和孵化于50mL/L CO2培养箱中、37°C、950mL/L湿度条件下培养。细胞融合率90%左右以消化液(含0.25%Trypsin、0.53mM EDTA)消化，接种于96孔板，细胞密度为7000个/孔，培养至融合率为70%~80%，使用无血清培养基饥饿24h。
[0114]然后换为分别含IOnM和IOOnM的K50和K52的RPMI1640培养基继续培养22h，以含0.1%DMS0的1640培养基作为对照组培养基，加入Brdu继续培养2h，然后按照BrdUELISA试剂盒说明书进行实验，即细胞加核酸酶溶液于37°C孵育30min，以PBS冲洗细胞3次，用过氧化物酶标记BrdU抗体，37°C孵育30min。PBS冲洗细胞3次，以过氧化物酶底物室温染色15min。用酶标仪检测样本在490nm处的吸光度值。
[0115]用同样的方法对IOOnM的K51，K53，K54，K55，K56，K57进行试验，观察药物对INS-1细胞增殖的影响。
[0116]2、实验结果
[0117]如图9所示，与对照组(1640培养基中加DMS0)相比，在1640培养基中加入IOnM的K50或K52后，INS-1胰岛β细胞增殖速度加快，加入IOOnM的Κ50或Κ52时，细胞增殖速度明显更快(Ρ〈0.05，η=3)；
[0118]如图10所示，与对照组(1640培养基中加DMSO^比，在1640培养基中加入IOOnM的Κ51,Κ53, Κ54，Κ55，Κ56或Κ57后，INS-1胰岛β细胞增殖速度明显加快(Ρ〈0.05，η=3)。
[0119]实验结果说明，本发明Κ50、Κ51、Κ52、Κ53，Κ54，Κ55，Κ56，Κ57均可以促进胰岛β
细胞的增殖。
[0120] 综上，本发明化合物I~8可以有效促进胰岛细胞增殖，采用本发明培养液培养胰岛细胞，细胞增殖速度快，可快速得到大量胰岛细胞，为糖尿病患者的胰岛移植打下了良好的基础。
【权利要求】
1.一种促胰岛细胞增殖培养液，其特征在于:它以常用细胞培养基为基础培养基，添加有如下任意一种或者多种化合物: 化合物1:1- (3- (3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基)吡啶-4-哌啶-4-羧酸； 化合物2:1- (3- (3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基)吡啶-4-哌啶-3-羧酸； 化合物3:6-((2-((4-(2，4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶_2_基)氣基)乙基)氣基)尼古丁臆； 化合物4:N- (5-甲基-1氢-吡唑-3-基)-2-苯基喹唑啉-4-胺； 化合物5:3_氨基-N-(4-(4-氨基哌啶-1-基)吡啶-3-基)-6-苯基吡嗪-2-甲酰胺； 化合物6:3_氨基-N- (4- (( 二甲)甲基)吡啶-3-基)-6-苯基-2-甲酰胺基； 化合物7: 1-(4-甲氧基苄基)-3- (5-硝基噻唑-2-基)尿素； 化合物8:N-(3-异丙氧基丙基)-4-(4-甲基苯甲酰胺)-1氢-吡唑-3-甲酰胺。
2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于:添加的化合物的终浓度不低于ΙΟηΜ。
3.根据权利要求2所述的培养液，其特征在于:所述化合物的终浓度不低于ΙΟΟηΜ。
4.根据权利要求3所述的培养液，其特征在于:所述化合物的终浓度为IOOnM~100 μ Μ。
5.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于:所述常用细胞培养基是1640培养基、最低必须培养基、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、DMEM/F12培养基或Μ-199培养基。
6.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于:所述培养液中还添加有胰岛素样生长因子、上皮生长因子、青霉素、链霉素、巯基乙醇、葡萄糖或胎牛血清。
7.根据权利要求6所述的培养液，其特征在于:所述培养液中含有胰岛素样生长因子和上皮生长因子，其中，胰岛素样生长因子的终浓度为10ng/ml，上皮生长因子的终浓度为10ng/ml.
8.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于:所述胰岛细胞为胰岛β细胞。
9.权利要求1~8任意一项所述培养液的制备方法，其特征在于:步骤如下:按照权利要求I~8任意一项所述配比取原料，混匀，即可。
10.如下化合物I~8中任意一种或者多种在制备促进胰岛细胞增殖的培养液中的用途: 化合物1:1- (3- (3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基)吡啶-4-哌啶-4-羧酸； 化合物2:1- (3- (3-氨基-6-甲酰氨基-2-苯基)吡啶-4-哌啶-3-羧酸； 化合物3:6-((2-((4-(2，4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶_2_基)氣基)乙基)氣基)尼古丁臆； 化合物4:N- (5-甲基-1氢-吡唑-3-基)-2-苯基喹唑啉-4-胺； 化合物5:3_氨基-N-(4-(4-氨基哌啶-1-基)吡啶-3-基)-6-苯基吡嗪-2-甲酰胺； 化合物6:3_氨基-N- (4- (( 二甲)甲基)吡啶-3-基)-6-苯基-2-甲酰胺基； 化合物7: 1-(4-甲氧基苄基)-3- (5-硝基噻唑-2-基)尿素； 化合物8:N-(3-异丙氧基丙基)-4-(4-甲基苯甲酰胺)-1氢-吡唑-3-甲酰胺； 优选地，所述胰岛细胞为胰岛β细胞。
【文档编号】C12N5/071GK103911340SQ201310747077
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年1月4日
【发明者】侯睿 申请人:广州康睿生物医药科技有限公司