一种耐高温脂肪酶及其编码产物的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种耐高温脂肪酶，所述耐高温脂肪酶核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述耐高温脂肪酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明还公开了所述耐高温脂肪酶的制备方法以及含有所述耐高温脂肪酶基因的重组质粒及耐高温重组脂肪酶及其制备方法。本发明基因表达的产物具有较高的催化活性，具有良好的耐高温及热稳定性特性，具有较大的工业化生产和应用潜力。
【专利说明】一种耐高温脂肪酶及其编码产物
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及一种利用宏基因组文库筛选的方法从红树林土壤微生物中获得一种耐高温脂肪酶及其编码产物。
【背景技术】
[0002]脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一类能催化长链脂肪酸酯水解、合成和酯交换的酶类，具有广泛的底物特异性、高度的位置选择性和异构体选择性等特点，应用前景广泛。在食品行业应用于食用油脂的转化、乳制品工业以及食品添加剂工业中；医药行业用于手性药物的合成和旋光异构体的拆分中；生物能源行业用其催化动物油脂、植物油等与甲醇或乙醇进行酯交换反应，进而得到脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯等生物燃料；洗涤业和纺织工业也广泛使用脂肪酶。深入开展脂肪酶的研究具有重要的理论意义和广阔的应用前景。
[0003]上述各种工业应用均要求脂肪酶在不同反应条件下与不同的底物作用，如制浆需要脂肪酶在高盐碱和高温的环境下作用，然而目前所研究的脂肪酶的酶学性质在应用方面仍然存在缺陷，限制了脂肪酶的广泛应用。因此，如何从环境中获得具有优良特性的脂肪酶，并研究其 结构与功能之间的关系，是当前在脂肪酶研究中面临的一项重要任务。
[0004]自然界中存在的微生物99%是不可培养的，因此从用传统的培养技术分离到的微生物中筛选新的生物催化剂的方法是非常有局限性的。利用免陪养技术-宏基因组技术(Metagenomics),直接从环境中提取DNA,将其克隆到不同的载体中，构建宏基因组文库，再从中进行筛选。该技术在挖掘和利用未培养微生物资源和筛选新颖生物活性物质方面表现出巨大的潜力，已成为当前国际上微生物学研究的前沿领域和热点。至今国内外学者已经通过该技术克隆到如淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、酯酶等新基因，这些酶具有新颖的酶学特性及工业应用潜力。因此该方法为发现脂肪酶新基因提供了新思路。
【发明内容】
[0005]本发明的第一个目的在于提供一种耐高温、高稳定性的耐高温脂肪酶。
[0006]本发明的第二个目的在于提供上述耐高温脂肪酶的宏基因组学克隆方法。
[0007]本发明的第三个目的在于提供一种耐高温重组脂肪酶基因的重组质粒pET32a-lip906o
[0008]本发明的第四个目的在于提供一含有上述耐高温脂肪酶DNA的表达载体。
[0009]发明的第五个目的在于提供一种耐高温重组脂肪酶及其制备方法。
[0010]本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的:一种耐高温脂肪酶基因，所述脂肪酶基因命名为lip906，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0011]本发明提供的上述新型脂肪酶，它的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的:一种耐高温脂肪酶，其核苷酸全长序列(命名为lip906)如下(SEQ ID N0.1)如下:
[0013]
【权利要求】
1.一种耐高温脂肪酶，其特征在于:其核苷酸序列如下:
2.一种根据权利要求1所述耐高温脂肪酶的宏基因组学克隆方法，其特征在于:其步骤包括:提取红树林植物根泥土壤样品的总DNA，并将得到的总DNA纯化；将纯化后的总DNA经Bam HI内切酶酶切，连接至载体pUCl 18/Bam HI，电击转化至大肠杆菌DH5 α超级感受态建立宏基因组文库，通过点在以三丁酸甘油酯为筛选底物的LB固体平板，筛选有水解圈的单菌落得到阳性克隆子。
3.一种根据权利要求1所述耐高温脂肪酶DNA的重组质粒，其特征在于:是根据脂肪酶基因lip906的序列设计引物，以提取的质粒pUC118-lip906为模板，进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳并回第一收产物，凝胶回收的第一产物经限制性内切酶EcoR1、HindIII双酶切并第二回收产物，质粒pET32a经EcoR1、HindIII双酶切后与第二回收产物连接，获得连接产物，为重组质粒pET32a-lip906 ;其中，所述序列设计引物序列如下: Iip906~F:5 ? CCGGAATTC ATGACAACAC CAGCAGCTAC CATCGAA GG3’；Iip906-R:5’ CCCAAGCTT TCAGGGGCAAACACCGGTGGG3’。
4.一种含有权利要求1所述耐高温脂肪酶DNA的表达载体，其特征在于:构建方法包括:采用电转法，将上述耐高温脂肪酶基因的重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，将细菌悬浮液恢复培养并稀释涂布于氨苄青霉素抗性培养板上培养，挑取阳性转化子。
5.一种重组脂肪酶，其特征在于:是用权利要求4所述含有耐高温脂肪酶DNA的表达载体转化宿主菌细胞，培养转化体，从培养物中获得的。
6.根据权利要求5所述一种重组脂肪酶，其特征在于:所述宿主菌是大肠杆菌BL21。
7.根据权利要求5或者6所述一种重组脂肪酶的制备方法，其特征在于:其包括的步骤如下:用所述耐高温脂肪酶DNA的重组质粒转化的大肠杆菌涂布于含氨苄青霉素抗性的平板上，培养过夜，挑取单克隆接种于LB液体培养基，振荡培养过夜，转接至新鲜的含氨苄青霉素抗性LB培养基，培养至OD6tltl=0.8，加入IPTG诱导培养；培养后经镍柱亲和层析纯化。
8.根据权利要求7所述一种重组脂肪酶的制备方法，其特征在于:其包括的步骤如下:用所述耐高温脂肪酶DNA的重组质粒转化的大肠杆菌涂布于含氨苄青霉素抗性的平板上，37°C倒置培养过夜，挑取单克隆接种于LB液体培养基，37°C、以转速为180rpm振荡培养过夜，按体积比1:100的比例转接至新鲜的含氨苄青霉素抗性LB培养基，于37°C、转速为180rpm培养至0D_=0.8，加入IPTG诱导培养培养后经镍柱亲和层析纯化。
9.根据权利要求8所述一种重组脂肪酶的制备方法，其特征在于:所述IPTG终浓度为ImM，诱导温度为30°C。
10.根据权利要求8所述一种重组脂肪酶的制备方法，其特征在于:所述IPTG终浓度为0.08~0.1mM,诱导温度为25~37°C。
【文档编号】C12N15/55GK103834626SQ201310753995
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】李荷, 刘悦 申请人:广东药学院