肺孢子菌lamp特异性检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种肺孢子菌LAMP特异性检测试剂盒。检测试剂盒包括甜菜碱试剂瓶、dNTPs试剂瓶、缓冲液试剂瓶、氯化镁试剂瓶、引物试剂瓶、聚合酶试剂瓶、超纯水试剂瓶、荧光指示剂、荧光显色液、阳性对照品、阴性对照品、试剂盒壳体和试剂瓶固定块。甜菜碱试剂瓶、dNTPs试剂瓶、缓冲液试剂瓶、氯化镁试剂瓶、引物试剂瓶、聚合酶试剂瓶、超纯水试剂瓶、荧光指示剂、荧光显色液、阳性对照品、阴性对照品固定在试剂瓶固定块上，试剂瓶固定块固定于试剂盒壳体内。本实用新型是一种特异性强、敏感性高、快速、廉价并且操作简单的肺孢子菌检测试剂盒，为检测肺孢子菌肺炎提供技术保证，有望成为临床检测肺孢子菌肺炎的主要方式。
【专利说明】肺孢子菌LAMP特异性检测试剂盒 【技术领域】
[〇〇〇1] 本实用新型涉及生物应用领域，特别涉及一种肺孢子菌LAMP特异性检测试剂盒， 适用于肺孢子菌肺炎临床检测。 【背景技术】
[0002] 肺孢子菌肺炎（Pneumocystis pneumonm，PCP)是一种严重的致死性肺炎。不仅 常见于艾滋病及其他各类先天或后天免疫机能受损者，而且与慢性阻塞性肺病、肺囊性纤 维变以及间质性肺炎等危害严重的呼吸系统疾病的发生密切相关。随着艾滋病蔓延、免疫 抑制剂的广泛应用、慢性阻塞性肺病等呼吸系统疾病的日趋增多，PCP在临床上逐步成为 "常见病"，已经引起医学界广泛重视。PCP -旦发生，病情进展迅速，不经治疗几乎100% 死亡。而早期及时的治疗，治愈率可达80%。因此，早期诊断和治疗对患者的预后极为重 要。由于PCP的临床表现和体征不具特异性，必须依赖实验室的病原学检查进行诊断。然 而，因孢子菌寄生部位的特殊性，使其病原学检测方法受到取材及阳性率低等方面的限制， 缺乏临床适用性。聚合酶链反应（PCR)等基因检测技术被认为是诊断肺孢子菌感染的最有 希望的方法之一。但是，经典的及一些改良的PCR方法因其对设备要求高，操作过程复杂 等缺点，难以在临床诊断中广泛推广应用。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术，是近年来开发的一种新的核酸扩增方法，其原理是针对祀基因 的6个区域设计3对特异性引物，在一种特殊的链置换DNA聚合酶（BstDNA polymerase)的 作用下发生DNA链的置换和环化，恒温水浴（65°C左右）30-60分钟即可完成109-1010拷 贝的扩增。其最低敏感检测极限是10个拷贝，比PCR高几个数量级。而且，LAMP技术不像 PCR和实时定量PCR那样需要昂贵的仪器，只需要普通水浴箱即可。因此，与其他检测方法 相比，LAMP方法有扩增快速、结果易于观察、设备简单、敏感性和特异性高等优点，适于基层 临床应用。目前，LAMP技术正在被广泛应用于某些疾病的流行病学调查以及某些热带病的 检测、诊断中。在日本被卫生组织认可并开发利用LAMP的检测试剂盒有八种：检测SARS冠 状病毒，结核分枝杆菌，肺炎支原体，军团菌，A型流感病毒，Hl，H5流感病毒，人类乳头状瘤 病毒等。但是，目前尚缺乏LAMP技术检测肺孢子菌感染的可靠技术和可供临床应用的检测 试剂盒。
【发明内容】
[0003] 本实用新型是克服现有技术不足，提供一种特异性强、敏感性高、快速、廉价并且 操作简单的肺孢子菌LAMP特异性检测试剂盒，为检测肺孢子菌肺炎提供了技术保证，也有 望成为临床检测肺孢子菌肺炎的主要方式。
[0004] 一种用于肺孢子菌LAMP特异性检测试剂盒，其特征在于：包括甜菜碱试剂瓶、 dNTPs试剂瓶、缓冲液试剂瓶、氯化镁试剂瓶、引物试剂瓶、聚合酶试剂瓶、超纯水试剂瓶、荧 光指示剂、荧光显色液、阳性对照品、阴性对照品、试剂盒壳体和试剂瓶固定块，甜菜碱试剂 瓶、dNTPs试剂瓶、缓冲液试剂瓶、氯化镁试剂瓶、引物试剂瓶、聚合酶试剂瓶、超纯水试剂 瓶、荧光指示剂、荧光显色液、阳性对照品、阴性对照品固定在试剂瓶固定块上，试剂瓶固定 块固定于试剂盒壳体内。
[0005] 所述的试剂盒壳体形状为长方体或其他形状，所使用的材料为纸板或其他材料， 其打开方式为绕转轴打开，或其它打开形式，其闭合后固定方式为搭扣形式，或其它固定形 式。
[〇〇〇6] 所述的试剂瓶固定块所能固定试剂瓶数量等于或者大于1，形状为长方体，或是其 它形状，所使用的材料为海绵，或使用其它材料，固定试剂瓶的方式为依靠摩擦力固定，或 其它固定方式。
[0007] 肺孢子菌LAMP特异性检测试剂盒的使用方法包括如下使用步骤：
[0008] 1)配置反应体系。从试剂盒中取出甜菜碱试剂瓶、dNTPs试剂瓶、缓冲液试剂瓶、 氯化镁试剂瓶、引物试剂瓶、聚合酶试剂瓶、超纯水试剂瓶，将溶液加入反应容器内，在反应 容器内加入荧光指示剂、荧光显色液，将被检测模板加入反应容器；
[0009] 2) LAMP扩增反应。将反应容器置于一定温度环境内反应一段时间；
[〇〇1〇] 3)结果检测。使用仪器检测反应扩增曲线（步骤1中使用荧光指示剂)，或观察容 器内颜色变化(步骤1中使用荧光显色液）判断检测结果；
[0011] 4)阳性对照品、阴性对照品使用时，替代步骤1中的被检测模板。
[0012] 本实用新型通过比较人源肺孢子菌（P. jirovecii)和大鼠源肺孢子菌 (P. carinii、P. wakefieldiae)的核酸序列，选取核糖体小亚基一段保守序列，根据此序列设 计特异性引物：
[0013] F35，-ATCAGATACCGTCGTAGTCTTA-3，
[0014] B35, -GCTCTCAATCTGTCAATCCTTA-3,
[0015] FIP5, -TTCAGCCTTGCGACCATACTCCTCGCTCGGCATCTTATG-3,
[0016] BIP5, -AAGGGCACCACCAGGAGTTATGTCTGGACCTGGTGAG-3,
[0017] LoopF 5，-GGAACCCGAAGACTTTGATTTC-3，
[0018] LoopB 5，-TGCGGCTTAATTTGACTCAAC-3
[0019] 本实用新型根据上述的引物组开发肺孢子菌LAMP特异性检测试剂盒。
[0020] 本实用新型的试剂盒还包括SYBR GREEN I荧光指示剂和显色液的应用。上述试剂 盒在检测肺孢子菌中的应用所使用的反应体系如下：
[0021]
【权利要求】
1. 一种肺孢子菌LAMP特异性检测试剂盒，包括装有特异性引物 F35' -ATCAGATACCGTCGTAGTCTTA-3' B35' -GCTCTCAATCTGTCAATCCTTA-3' FIP5'-TTCAGCCTTGCGACCATACTCCTCGCTCGGCATCTTATG-3' BIP 5' -AAGGGCACCACCAGGAGTTATGTCTGGACCTGGTGAG-3' LoopF5 '-GGAACCCGAAGACTTTGATTTC-3 ' LoopB5，-TGCGGCTTAATTTGACTCAAC-3， 的引物试剂瓶（5)，其特征在于还包括甜菜碱试剂瓶（1)、dNTPs试剂瓶（2)、缓冲液试 剂瓶（3)、氯化镁试剂瓶（4)、聚合酶试剂瓶（6)、超纯水试剂瓶（7)、荧光指示剂（8)、荧光 显色液（9)、阳性对照品（10)、阴性对照品（11)、试剂盒壳体（12)和试剂瓶固定块（13)，其 中：甜菜碱试剂瓶（1 )、dNTPs试剂瓶（2)、缓冲液试剂瓶（3)、氯化镁试剂瓶（4)、引物试剂 瓶（5)、聚合酶试剂瓶（6)、超纯水试剂瓶（7)、荧光指示剂（8)、荧光显色液（9)、阳性对照品 (10 )、阴性对照品（11)固定在试剂瓶固定块（13 )上，试剂瓶固定块（13 )固定于试剂盒壳体 (12)内。
2. 根据权利要求1所述的肺孢子菌LAMP特异性检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂 盒壳体（12)形状为长方体，所使用的材料为纸板，其打开方式为绕转轴打开，其闭合后固定 方式为搭扣形式。
3. 根据权利要求1所述的肺孢子菌LAMP特异性检测试剂盒，其特征在于所述的试剂 瓶固定块（13)能固定试剂瓶数量等于或者大于1，形状为长方体，所使用的材料为海绵材 料，固定试剂瓶的方式为依靠摩擦力固定。
【文档编号】C12Q1/04GK203833934SQ201320561332
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】张楠, 安春丽, 王晓黎, 秦铮, 国九英, 马素丽, 樊华, 赵亚滨 申请人:中国医科大学