用于分析物的检测和测量的方法和装置制造方法
【专利摘要】描述了用于具有在其上功能化的、对于靶标实体特异的至少一种适体的感应器，制备和使用该感应器的方法，用于糖基化的蛋白质监测和/或生物标志物。
【专利说明】用于分析物的检测和测量的方法和装置
[0001] 相关应用的交叉引用
[0002] 本发明要求2012年1月31日提交的美国临时申请号61，593, 054的权益，其全部 公开通过引用并入本文。
[0003] 关于联邦政府赞助研究的声明
[0004] 本发明不是在任何政府的支持下完成，并且政府对本发明没有权利。
[0005] 序列表
[0006] 本发明包含已通过EFS-web提交的序列表，并通过引用将其整体并入本文。ASCII 拷贝创建于 2013 年 1 月 31 日，名为 420_53354_SEQ_LIST_D2012-15. txt，大小为 3, 888 字 节。
【技术领域】 [0007] 和工业实用性
[0008] 本发明涉及适体功能化的表面等离子共振（SPR)感应器、制造和使用所述感应器 的方法。
[0009] 背景
[0010] 下面的描述提供了本公开相关信息的概述，而并不是承认本文所提供信息或引用 的出版物是对于本发明的现有技术。
[0011] 血液蛋白的直接检测可有益于多种科学和临床应用，如用于监测糖尿病中特定蛋 白质糖基化比例、药物研究和环境监测的生物标记物、癌症诊断和治疗等等。当前对血液蛋 白的临床和实验室测量技术为硼酸盐亲和免疫测定、高性能液相色谱法（HPLC)、基于质谱 和毛细管的系统，其耗时且成本高昂。
[0012] 更有效和快速响应的测量方法可以大大有益于并提高相关的应用领域，特别是用 于开发下一代能实时分析的便携式手持诊断装置。最近对几种基于光学的诊断技术，如近 红外光谱法、偏振测量法、光学相干断层成像术、表面等离子共振（SPR)、拉曼和荧光光谱法 进行研究来监测血液成分。然而由于所研究样本中存在混杂物质的影响而限制许多这些光 学方法的有效性。
[0013] 一种用于体外筛选能高特异性结合靶标分子的核苷酸分子的方法通常被称 为SELEX(通过指数扩增的配体系统进化），其描述于题为"核苷酸配体"的美国专利号 5, 475, 096和题为"核苷酸配体"的美国专利号5, 270, 163中，所述每个专利特通过引用并 入本文。
[0014] 尽管目前使用的SELEX处理过程是有用的，但一直都需要改进的处理过程，其允 许筛选更有选择性的适体由体外筛选技术产生。
[0015] 发明简述
[0016] 在一个广泛的方面，本文提供了用于检测靶标实体存在的感应器，其包括具有连 接到基质的氨基末端或类似的适体探针，其中当感应器被能量源激发：i)在缺乏靶标实体 与适体探针之间的特异相互作用时，发出基准信号；或者ii)在存在靶标实体与适体探针 之间的特异相互作用时，发出检测信号，其中的基准信号与检测信号不同，由此检测到靶标 实体的选择性存在。
[0017] 在特定实施方案中，适体探针包括与靶标实体特异性相互作用的核苷酸序列。
[0018] 在特定实施方案中，靶标实体是如下的一种或多种：大生物分子、小生物分子、有 机分子、小分子、核酸、金属离子、蛋白质、酶、肽、药物、染料、癌细胞、病毒、激素或微生物。 在特定实施方案中，所述蛋白质是血液蛋白。
[0019] 在特定实施方案中，所述适体探针包括适体和附着的氨基部分。
[0020] 在特定实施方案中，所述适体探针包括在基质和氨基部分之间的SAM连接子。
[0021] 在特定实施方案中，所述带氨基末端的适体探针通过3-巯基丙酸（MPA)连接到基 质。
[0022] 在特定实施方案中，所述感应器具有基于连接子特性的能检测pM-nM的可调检测 范围。
[0023] 在广泛的方面，本文提供一种用于检测靶标实体是否存在于样品中的方法，其包 括：i)样品与本文描述的感应器接触；ii)用能量源激发感应器；和iii)确定发出信号的 强度，由此确定靶标实体是否存在于样品中。
[0024] 在特定实施方案中，用表面等离子共振（SPR)来测量能力源。
[0025] 在特定实施方案中，所述方法具有小于1分钟的反应时间。在特定实施方案中，所 述方法在大约室温下具有小于1分钟的反应时间。
[0026] 在另一个广泛的方面，本文提供用于检测靶标实体的试剂盒，其包括：本文所描述 的感应器；和包含感应器的至少一个容器，其中样品可以添加到所述容器中。
[0027] 在另一个广泛的方面，本文提供用于制备感应器的方法，其包括：i)将自组装单 层（SAM)连接子固定化到基质上；和ii)将氨基末端适体固定化到SAM连接子上。
[0028] 在另一个广泛的方面，本文提供用于制备感应器的方法；其包括：i)用自组装单 层（SAM)连接子来功能化基质；ii)将步骤i)中的功能化的基质暴露于具有氨基部分的组 合物，其具有足以使氨基部分固定化到SAM连接子上；iii)将步骤ii)中的氨基功能化的 基质暴露于至少一种适体，其足以使适体固定化到氨基部分上；iv)可选地，去除非特异性 固定化的适体；和V)将步骤iii)或iv)中带氨基末端的适体功能化的基质暴露于封闭剂， 其足以封闭被氨基部分活化的未占用的SAM位点。
[0029] 在特定实施方案中，具有氨基部分的所述组合物缀合到如下的一个或多个：N_羟 基琥珀酰亚胺（NHS)和N-(3-二甲基氨基丙基）-N-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC) (N-(3-d imethylamnopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC))〇
[0030] 在另一个方面，本文提供使用本文所描述的感应器检测血液蛋白的方法。
[0031] 在另一个方面，本文提供了用于在糖尿病治疗指导的应用中，用于糖基化蛋白的 超灵敏和选择性的检测和测量的方法。在一个特定的实施方案中，所述方法包括使用表面 等离子共振。
[0032] 在另一个实施方案中，这种功能化方法可应用于其他感应形式，其包括拉曼和荧 光光谱法，并可用来进一步提高现有监测技术的性能。
[0033] 在另一方面，本文提供用于优化靶向血液蛋白的特异性糖基化形式的适体的体外 筛选的方法。在一个实施方案中，表面功能化方法用于基于祀标特征来优化灵敏度和选择 性。
[0034] 在另一方面，本文提供用于进一步减少所研究样本中可能存在的混杂物质的影响 的方法。
[0035] 在另一方面，本文提供一种稳健的、低成本并便携的感应平台，其能够实现与现有 大型临床仪器相似的性能。另外，整合的平台在能够评估对胰岛素依赖性糖尿病治疗的依 顺性的诊断装置中有用。整合的平台考虑到低成本的手持装置可用于医师办公室或家庭环 境中。整合的平台也提供对所收集数据的即时分析，因此允许护理者和/或患者评估患者 的长期葡萄糖调节的依顺性。
[0036] 在另一个广泛的方面，本文提供用于鉴定靶向明确位点（例如，糖基化蛋白位点） 的适体的方法，其包括在至少一轮通过指数扩增的配体系统进化（SELEX)富集实验方案中 引入非靶标的候选物（例如非糖基化的候选物），以及在至少第二轮SELEX实验方案中引入 非靶标候选来去除对糖基化和非糖基化蛋白形式都有亲和力的适体候选物。
[0037] 在另一个广泛的方面，本文提供基于靶标和/或适体特征来优化灵敏度和选择性 的表面功能化方法，包括：使用二元自组装单层（SAM)形成过程，使用具有所需连接间距和 /或长度的连接，其中至少一个连接间距和/或长度的选取是为了基于靶标和/或适体特性 来优化表面等离子共振（SPR)灵敏度和选择性。
[0038] 在另一个方面，本文提供用于优化针对一种或多种分析物的感应器的灵敏度和/ 或选择性的方法，包括将一种或多种类型的适体连接到具有自组装单层（SAM)连接的基质 上，所述SAM连接具有所需的连接间距和/或长度以在基质上形成功能化的表面。为了基 于分析物和/或适体特性来优化表面等离子共振（SPR)、拉曼光谱法、或荧光光谱法中至少 一种的灵敏度和选择性来选择所需的连接间距和/或长度。
[0039] 在特定实施方案中，所述SAM连接的至少一种堆积密度和/或长度影响表面等离 子共振（SPR)信号。
[0040] 在特定实施方案中，连接是通过二元SAM和还原解吸附过程。
[0041] 在特定实施方案中，所述解吸附过程包括将基质的功能化的表面暴露于抗蛋白质 吸附的物质来防止蛋白质在功能化的基质上的非特异性吸附。
[0042] 在特定实施方案中，抗蛋白质吸附的物质包括1-巯基-11-i^一烷基）三（乙二 醇）（PEG3)。
[0043] 在特定实施方案中，所述SAM连接包括使用巯基SAM固定化方法，其中巯基化合物 具有能够与适体形成稳定键的羧基部分。
[0044] 在特定实施方案中，巯基化合物包括二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)。
[0045] 在特定实施方案中，使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)和（1-巯 基-11-i^一烷基）三（乙二醇）（PEG3)形成所述SAM连接，其中PEG3防止蛋白质的非特 异性吸附，而且其中在DTSP上的羧基部分与适体形成稳定键合。
[0046] 在特定实施方案中，二元的SAM巯基溶液用于所述SAM连接中。
[0047] 在特定实施方案中，通过将3-巯基丙酸（MPA)与（1-巯基-11-i^一烷基）三（乙 二醇）（PEG3)的ImM乙醇溶液相混合，同时保持二元SAM的总浓度为约ImM来制备所述二 元的SAM巯基溶液。
[0048] 在特定实施方案中，MPA和PEG3以约20:80、约50:50或约80:20的比例存在。
[0049] 在特定实施方案中，所述方法进一步包括通过还原解吸附来清除MPA，完整保留 PEG3 ;和允许二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)与适体上的氨基基团共价键合，其中 所述适体仅附着到DTSP，并且其中PEG3不形成任何键。
[0050] 在特定实施方案中，所述适体包括能被固定化到MPA上的胺修饰的适体。
[0051] 在特定实施方案中，所述表面具有在约5nM-约IOOOnM范围的最佳动力学。
[0052] 在特定实施方案中，所述感应器包括混合长度的间隔层。
[0053] 在特定实施方案中，所述混合长度层包括11-巯基十一烷酸（MUA)与3-巯基丙酸 (MPA)相组合。
[0054] 在特定实施方案中，使用水溶的包含巯基的氨基酸，其能直接结合到表面，以形成 自组装单层（SAM)。在特定实施方案中，所述氨基酸包括半胱氨酸。
[0055] 在另一个方面，本文提供用于形成针对一种或多种分析物的感应器的方法，包括： 在基质上吸附由3-巯基丙酸（MPA)和（1-巯基-11-i^一烷基）三（乙二醇）（PEG3)构成 的二元组件；从步骤a)基质上还原解吸附MPA ;将步骤b)的基质浸入DTSP溶液中以在基 质上形成DTSP层；在步骤c)的基质上固定化至少一种类型的适体；并且，将未结合的适体 从步骤d)的基质上的PEG3中去除，由此留下附着在基质的DTSP层上的适体。
[0056] 在另一方面，本文提供用于形成针对一种或多种分析物的感应器方法，包括在乙 醇溶液中在金表面基质上吸附由3-巯基丙酸（MPA)和（1-巯基-11-i^一烷基）三（乙二 醇）（PEG3)构成的二元组件；在0. 5M KOH溶液中从基质上还原解吸附MPA，其中通过对溶液 施加30分钟-I. 2V的电势而选择性地还原在相分离的MPA和PEG3的二元自组装单层（SAM) 中所吸附的MPA ;将其上具有PEG3层的基质浸入ImM DTSP溶液中以在其上形成DTSP层； 在基质上固定化至少一种类型的适体；并且将适体从基质的PEG3中去除，由此留下附着在 基质的DTSP层上的适体。
[0057] 在特定实施方案中，所述基质具有金表面。
[0058] 在特定实施方案中，所述分析物包括血液或血清中蛋白质的糖基化形式。
[0059] 在特定实施方案中，所述方法包括确定总血清蛋白水平中的一部分特定糖基化蛋 白。
[0060] 在特定实施方案中，所述分析物包括人血红蛋白、白蛋白（包括人血清白蛋白 (HSA))、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、纤维蛋白原和/或其片段的一个或多个的 非糖基化和/或糖基化形式。
[0061] 在特定实施方案中，分析物包括至少第一种分析物，其具有与至少第二种分析物 不同的半衰期，并且所述方法进一步包括量化第一种和第二种分析物来提供关于在一个或 多个时间段中第一种和第二种分析物的水平的回顾性判断。
[0062] 在特定实施方案中，第一种分析物包括血红蛋白并且第二种分析物包括IgM。
[0063] 在特定实施方案中，所述分析物包括至少第一种分析物，至少第二种分析物和至 少第三种分析物，第一种、第二种和第三种分析物的每一种具有不同的半衰期，所述方法进 一步包括：量化第一种、第二种和第三种分析物以提供关于在一个或多个时间段中第一种、 第二种和第三种分析物的水平的回顾性判断。
[0064] 在特定实施方案中，第一种分析物包括血红蛋白，第二种分析物包括IgM并且第 三种分析物包括白蛋白。
[0065] 在特定实施方案中，所述方法对监测过去的平均葡萄糖水平是有用的，所述方法 包括：将通过本文描述的方法形成的感应器与血液样品相接触；确定血液中糖基化形式的 蛋白质的量；和将血液样品中以糖基化形式存在的蛋白质的量与给定时间范围的对照葡萄 糖水平相关联。
[0066] 在特定实施方案中，糖基化形式的蛋白质的量是用表面等离子共振（SPR)来确 定。
[0067] 在另一方面，本文提供用于检测一种或多种分析物的存在的感应器，其中所述感 应器是通过本文所述的任一种方法形成的。
[0068] 在特定实施方案中，所述适体包括能够与一种特定的分析物相互作用的核苷酸序 列。
[0069] 在特定实施方案中，所述感应器能够与选自如下的一种或多种分析物相互作用： 大生物分子、小生物分子、有机分子、小分子、核酸、金属离子、蛋白质、酶、肽、药物、染料、癌 细胞、病毒、激素或微生物。
[0070] 在特定实施方案中，所述分析物是如下的一种或多种：生物样品、环境样品、化学 样品、药物样品、食品样品、农业样品和兽医样品。
[0071] 在特定实施方案中，所述蛋白质为血液蛋白。
[0072] 在特定实施方案中，所述感应器具有基于连接子特性的能检测pM至nM的可调检 测范围。
[0073] 在特定实施方案中，所述感应器具有小于1分钟的反应时间。
[0074] 在特定实施方案中，所述感应器在大约室温下具有小于1分钟的反应时间。
[0075] 在另一方面，本文提供用于检测一种或多种分析物的试剂盒，其包括：本文描述的 感应器；和包含感应器的至少一个容器，其中样品可以添加到所述容器中。
[0076] 在另一方面，本文提供用于减少样本中可能存在的至少一种混杂物质的影响的方 法，其包括：将一个或多个亲水基团并入到基质上的非结合位置，其足以基本上减少/防止 混杂物质的非特异性吸附，将适体连接到具有自组装单层（SAM)连接的基质上，所述SAM连 接具有所需的连接间距和/或长度以形成在基质上的功能化的表面，以及通过SPR感应器 在超过普通SPR检测限度的分隔距离上检测适体结合反应。
[0077] 本文还描述了一种方法，其使用表面等离子共振（SPR)光谱法以及为用户开发的 基于适体的功能化的感应器表面，以在测试环境中检测和/或量化一种或多种靶标分子或 其片段。所述方法允许检测和/或测量具有大范围半衰期的分子，包括但不限于具有半衰 期比血红蛋白短的靶标分子。而且，所述方法可在不使用标签或标记（例如荧光染料或光 交联）的情况下来进行。所述方法也具有低的样品消耗，并提供快速响应时间（一般为数 秒），使其在评估血糖依顺性的应用上是有用的。
[0078] 在另一方面，本文提供感应器，其包括：连接到具有自组装单层（SAM)连接的基质 上的一种或多种类型的适体，所述SAM连接具有所需的连接间距和/或长度以形成在基质 上的功能化的表面，为了基于分析物和/或适体特性来优化表面等离子共振（SPR)、拉曼光 谱法、或荧光光谱法中至少一种的灵敏度和选择性来选择所需的连接间距和/或长度。
[0079] 在特定实施方案中，所述SAM连接的至少一种堆积密度和/或长度影响表面等离 子共振（SPR)信号。
[0080] 在特定实施方案中，所述连接是通过二元SAM和还原解吸附过程。
[0081] 在特定实施方案中，所述基质的功能化的表面已暴露于抗蛋白吸附的物质，其足 以抑制蛋白质在功能化的表面上的非特异性吸附。
[0082] 在特定实施方案中，抗蛋白质吸附的物质包括1-巯基-11-i^一烷基）三（乙二 醇）（PEG3)。
[0083] 所述SAM连接包括具有能够与适体形成稳定键的羧基部分的巯基化合物。
[0084] 在特定实施方案中，巯基化合物包括二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)。
[0085] 在特定实施方案中，使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)和（1-巯 基-11-i^一烷基）三（乙二醇）（PEG3)形成所述SAM连接，其中PEG3防止蛋白质的非特 异性吸附，而且其中在DTSP上的羧基部分与适体形成稳定键合。
[0086] 在特定实施方案中，二元的SAM巯基溶液用于所述SAM连接中。
[0087] 在特定实施方案中，通过将3-巯基丙酸（MPA)与（1-巯基-11-i^一烷基）三（乙 二醇）（PEG3)的ImM乙醇溶液相混合，同时保持二元SAM的总浓度为约ImM来制备所述二 元的SAM巯基溶液。
[0088] 在特定实施方案中，MPA和PEG3以约20:80、约50:50或约80:20的比例存在。
[0089] 在特定实施方案中，通过还原解吸附清除MPA，完整保留PEG3 ;和二硫代二-N-琥 珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)与适体上的氨基基团共价结合，并且PEG3不形成任何键。
[0090] 在特定实施方案中，所述适体包括能被固定化到3-巯基丙酸（MPA)上的胺修饰的 适体。
[0091] 在特定实施方案中，所述表面具有在约5nM-约IOOOnM范围的最佳动力学。
[0092] 在特定实施方案中，所述感应器包括混合长度的间隔层。
[0093] 在特定实施方案中，所述混合长度层包括11-巯基十一烷酸（MUA)与3-巯基丙酸 (MPA)相组合。
[0094] 在特定实施方案中，所述SAM连接包括水溶的包含巯基的氨基酸，其能直接结合 到基质的表面。
[0095] 在特定实施方案中，所述氨基酸包括半胱氨酸。
[0096] 在另一方面，本文提供了感应器，其中基质的至少表面是金的。
[0097] 在特定实施方案中，感应器配置为感应包括血液中蛋白质的糖基化形式的分析 物。
[0098] 在特定实施方案中，感应器配置为从总血清蛋白水平中确定一部分特定的糖基化 蛋白。
[0099] 在特定实施方案中，所述分析物包括如下的一种或多种：人血红蛋白、白蛋白（包 括人血清白蛋白（HSA))、免疫球蛋白G (IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、纤维蛋白原和/或其片 段，所述分析物为糖基化或非糖基化形式。
[0100] 在特定实施方案中，分析物包括至少第一种分析物，其具有与至少第二种分析物 不同的半衰期。
[0101] 在特定实施方案中，第一种分析物包括血红蛋白并且第二种分析物包括免疫球蛋 白M(IgM);并且其中第一种分析物或第二种分析物以糖基化形式或非糖基化形式存在。
[0102] 在特定实施方案中，所述分析物包括至少第一种分析物，至少第二种分析物和至 少第三种分析物，第一种、第二种和第三种分析物的每一种具有不同的半衰期。
[0103] 在特定实施方案中，第一种分析物包括血红蛋白，第二种分析物包括IgM并且第 三种分析物包括白蛋白；其中第一种分析物、第二种分析物或第三种分析物的一种或多种 是以糖基化形式或非糖基化形式存在。
[0104] 在另一方面，本文提供了使用本文所描述的感应器的任一种来监测过去的平均血 液分析物水平，其通过：将用本文所描述的方法形成的感应器与血液样品相接触；确定血 液中分析物的糖基化形式的量；并将血液样品分析物中以糖基化形式存在的分析物的量与 给定时间范围的对照水平相关联。
[0105] 在特定实施方案中，所述蛋白质的糖基化形式的量使用表面等离子共振（SPR)来 确定。
[0106] 在特定实施方案中，所述适体包括能够与特定的分析物相互作用的核苷酸序列。
[0107] 在特定实施方案中，所述感应器能够与选自如下的一种或多种分析物相互作用： 大生物分子、小生物分子、有机分子、小分子、核酸、金属离子、蛋白质、酶、肽、药物、染料、癌 细胞、病毒、激素或微生物。
[0108] 在特定实施方案中，所述分析物是如下的一种或多种：生物样品、环境样品、化学 样品、药物样品、食品样品、农业样品和兽医样品。
[0109] 在特定实施方案中，所述蛋白质为血液蛋白。
[0110] 在特定实施方案中，所述感应器具有基于连接子特性的能检测pM-nM的可调检测 范围。
[0111] 在特定实施方案中，所述感应器具有小于1分钟的反应时间。
[0112] 在特定实施方案中，所述感应器在约室温下具有小于1分钟的反应时间。
[0113] 在特定实施方案中，所述感应器包括适体，其中所述适体包括与SEQ ID N0:4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14和15中任一的完整序列有至少70%同一性的0嫩序列。
[0114] 在另一方面，本文提供用于检测一种或多种分析物的试剂盒，其包括：本文所描述 的任意一种或多种感应器；和包含感应器的至少一个容器，其中样品可以添加到所述容器 中。
[0115] 在特定实施方案中，所述试剂盒还包括一种或多种固体支持物、用于从洗脱物中 分离感应器的一种或多种分离剂，以及用于从感应器中分离适体的一种或多种试剂。
[0116] 在另一方面，本文提供从其中具有单个靶标位点结合适体和非靶标蛋白结合适体 的核酸库中鉴定出单个靶标位点结合适体的方法，其包括：
[0117] a)向到核酸库中加入单个位点靶标蛋白复合物，其中库中存在的单个靶标位点结 合适体和非靶标蛋白结合适体结合到单个位点靶标蛋白复合物上，并形成单个靶标位点结 合适体+非靶标蛋白结合适体+单个位点靶标蛋白复合物；
[0118] b)从库中分离单个靶标位点结合适体+非靶标蛋白结合适体+单个位点靶标蛋白 复合物；
[0119] c)将所述单个靶标位点结合适体和非靶标蛋白结合适体从单个位点靶标蛋白复 合物上洗脱；
[0120] d)向上面步骤中的洗脱物中加入非靶标蛋白复合物，其中存在于步骤c)中的所 述非靶标蛋白结合适体结合到非靶标蛋白复合物，并形成非靶标蛋白结合适体+非靶标蛋 白复合物；
[0121] e)将非靶标蛋白结合适体+非靶标蛋白复合物从上面步骤的洗脱物中分离出来， 在洗脱物中留下单个靶标位点结合适体；并且，
[0122] f)从洗脱物中分离单个靶标位点结合适体；任选地，进一步扩增单个靶标位点结 合适体。
[0123] 在特定实施方案中，所述单个靶标位点结合适体用来选择如下的一种：血红蛋白、 免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)和白蛋白。
[0124] 在特定实施方案中，所述单个靶标位点结合适体选自：SEQ ID N0:3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14 和 15。
[0125] 在特定实施方案中，所述单个位点靶标蛋白固定化到固体支持物上。
[0126] 在特定实施方案中，所述非靶标蛋白复合物固定化到固体支持物上。
[0127] 在特定实施方案中，所述固体支持物包括磁珠、层析基质、微量滴定盘或阵列。
[0128] 在另一方面，本文提供结合到糖基化的血红蛋白的适体，其中所述适体包括选自 SEQ ID N0:4和5的核酸序列。
[0129] 在特定实施方案中，所述糖基化的血红蛋白为人血红蛋白。
[0130] 在特定实施方案中，所述适体对于人血红蛋白具有IOOnM或更小的解离常数。
[0131] 在另一方面，本文提供结合到糖基化的血红蛋白的适体，其中所述适体包括选自 SEQ ID N0:4和5的核酸序列，以及5' -连接子和3' -连接子中的一个或多个。
[0132] 在特定实施方案中，所述连接子为自组装单层（SAM)。
[0133] 在另一方面，本文提供适体，其与SEQ ID N0:4和5中任一的完整序列有至少70% 同一性并结合到糖基化的人血红蛋白。
[0134] 在另一方面，本文提供了物质的组合物，其包括缀合到核酸适体分子的自组装单 层（SAM)，所述核酸适体分子含有能特异地结合糖基化的血红蛋白的区域的多核苷酸序列， 其中多核苷酸序列选自SEQ ID N0:4和5。
[0135] 在另一方面，本文提供结合到非糖基化的血红蛋白的适体，其中所述适体包括选 自SEQ ID N0:6和7的核酸序列。
[0136] 在特定实施方案中，所述非糖基化的血红蛋白为人血红蛋白。
[0137] 在特定实施方案中，所述适体对于人血红蛋白具有IOOnM或更小的解离常数。
[0138] 在另一方面，本文提供了结合到非糖基化的血红蛋白的适体，其中所述适体包括 选自SEQ ID N0:6和7的核酸序列，以及5' -连接子和3'-连接子中的一个或多个。
[0139] 在特定实施方案中，所述连接子为自组装单层（SAM)。
[0140] 在另一方面，本文提供了适体，其与SEQ ID N0:6和7中任一的完整序列有至少 70%同一性并结合到非糖基化的人血红蛋白。
[0141] 在另一方面，本文提供了物质的组合物，其包括缀合到核酸适体分子的自组装单 层（SAM)，所述核酸适体分子含有能特异地结合非糖基化的血红蛋白的区域的多核苷酸序 列，其中多核苷酸序列选自SEQ ID N0:6和7。
[0142] 在另一方面，本文提供了结合糖基化的血清白蛋白的适体，其中适体包含选自SEQ ID NO:3、8和9的核酸序列。
[0143] 在特定实施方案中，所述糖基化的血清白蛋白为糖基化的人血清白蛋白。
[0144] 在特定实施方案中，所述适体对于糖基化的人血清白蛋白具有IOOnM或更小的解 离常数。
[0145] 在另一方面，本文提供了结合到糖基化的血清白蛋白的适体，其中所述适体包括 选自SEQ ID NO: 3、8和9的核酸序列，以及5' -连接子和3'-连接子中的一个或多个。
[0146] 在特定实施方案中，所述连接子为自组装单层（SAM)。
[0147] 在另一方面，本文提供了适体，其与SEQ ID N0:3、8和9中任一完整序列有至少 70 %同一性并结合到糖基化的人血清白蛋白。
[0148] 在另一方面，本文提供了物质的组合物，其包括缀合到核酸适体分子的自组装单 层（SAM)，所述核酸适体分子含有能特异地结合糖基化的血清白蛋白的区域的多核苷酸序 列，其中多核苷酸序列选自SEQ ID NO:3、8和9。
[0149] 在另一方面，本文提供了结合到非糖基化的血清白蛋白的适体，其中所述适体包 括选自SEQ ID N0:10、ll、12、13、14和15的核酸序列。
[0150] 在特定实施方案中，所述非糖基化的血清白蛋白为糖基化的人血清白蛋白。
[0151] 在特定实施方案中，所述适体对于非糖基化的人血清白蛋白具有IOOnM或更小的 解离常数。
[0152] 在另一方面，本文提供了结合到非糖基化的血清白蛋白的适体，其中所述适体包 括选自SEQ ID N0:10、ll、12、13、14和15的核酸序列，以及5'-连接子和3'-连接子中的 一个或多个。
[0153] 在特定实施方案中，所述连接子为自组装单层（SAM)。
[0154] 在另一方面，本文提供了适体，其与SEQ ID勵：10、11、12、13、14和15中任一的完 整序列有至少70%同一性并结合到非糖基化的人血清白蛋白。
[0155] 在另一方面，本文提供了物质的组合物，其包括缀合到核酸适体分子的自组装单 层（SAM)，所述核酸适体分子含有能特异地结合非糖基化的血清白蛋白的区域的多核苷酸 序列的，其中多核苷酸序列选自SEQ ID NO: 10、11、12、13、14和15。
[0156] 在特定实施方案中，所述适体包括至少一种化学修饰。
[0157] 在特定实施方案中，所述修饰选自：在糖位点的化学替换、在核苷酸之间连接的化 学替换和在碱基位点的化学替换。
[0158] 在另一方面，本文提供了试验试剂，其包含有效量的本文所描述的适体或其盐，以 及其支持物。
[0159] 在另一方面，本文提供了试剂盒，其包含至少一种本文所描述的适体。
[0160] 在特定实施方案中，所述适体为聚乙二醇化的。
[0161] 在特定实施方案中，所述聚乙二醇化的适体分子包括1-巯基-11-十一烷基）三 (乙二醇）（PEG3)。
[0162] 在特定实施方案中，使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)和（1-巯 基-11- i^一烷基）三（乙二醇）（PEG3)形成所述SAM连接。
[0163] 在特定实施方案中，所述适体包含至少一种化学修饰。
[0164] 在特定实施方案中，所述修饰选自：在特定实施方案中的在糖位点上的化学替换， 在核苷酸之间连接的化学替换和在碱基位点的化学替换。
[0165] 试验试剂，其包含有效量的一种或多种本文所描述的适体或其盐，以及其支持物。
[0166] 试剂盒，其包含一种或多种本文所描述的适体。
[0167] 在另一方面，本文提供了纯化和分离的非天然发生的DNA序列，其选自SEQ ID 勵：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
[0168] 在另一方面，本文提供了用于减少样本中可能存在的至少一种混杂物质的影响的 方法，其包括：a)将一个或多个亲水基团并入基质上的非结合位置，其足以基本上减少/防 止混杂物质的非特异性吸附，b)将适体连接到具有自组装单层（SAM)连接的基质上，所述 SAM连接具有所需的连接间距和/或长度以形成在基质上的功能化的表面，和c)通过SPR 感应器在超过普通SPR检测限度的分隔距离上检测适体结合反应。
[0169] 本发明的其他系统、方法、特征和优势对于本领域技术人员在查阅下面的附图和 细节描述后是显而易见的。所有这些附加的系统、方法、特征和优势都包括在本描述中，是 在本发明的范畴内，并被附带的权利要求所保护。
[0170] 附图简述
[0171] 专利或应用程序的文件可能包含一个或多个彩色绘制的图和/或一个或多个照 片。当提出请求并支付必要费用，专利局将提供带彩色的图和/或照片的本专利或专利申 请出版物的副本。
[0172] 图1 :感应表面功能化方法的示意图。
[0173] 图2 :阻抗谱的奈奎斯特图，其来自含有5mM Fe (CN) 63_/Fe (CN) 64_的IOOmM PB溶液 (pH7. 2)(柱 A)裸 Au(金）；（柱 B)Au/MPA/EDC-NHS/EA/PPA ;(柱 C)Au/MPA/EDC-NHS/EA/ PPA/APT1。右图显示每一层的（RJ。在0. IHz-IOOkHz的频率范围潜在振幅为5mV均方根 (rms)以10倍频率内点数为10来收集阻抗谱。
[0174] 图3 :图形显示了通过磁珠耦合法得到的适体/凝血酶结合比，以mol表示。
[0175] 图4 :图形显示了裸Au与适体修饰感应器的SPR反应。所有的数据点为三次实验 读数的平均。样品为单独的凝血酶（上面的图）和带有400nM BSA的凝血酶（下面的图）。 嵌入图是相同数据以对数刻度绘制以允许更低浓度下更好的可视化。
[0176] 图5 :图形显示不同感应表面的SPR反应，即对于400nM BSA(BSA组）、500nM凝血 酶（凝血酶组）和带有400nM BSA的500nM凝血酶（凝血酶+BSA组）。误差线代表从三个 新鲜制备样品确定的数值的标准偏差。
[0177] 图6 :图形显示不同感应表面的SPR反应，即对于带有和不带有400nMBA的50nM、 250nM、500nM凝血酶，上坐标轴（APT1)，下坐标轴（APT2);下坐标轴的零点已被故意地移位 以更好的区分会重叠的点。
[0178] 图7 :被激活的表面等离子体的示意图。
[0179] 图8a :具有Kretschmann配置的SPR的示意图。
[0180] 图8b :因折射率改变而产生的共振角移位的示意图。
[0181] 图9 :在附着到SPR感应表面的SAM表面上固定化的适体结合HbAlc的示意图（上 面）；和因折射率改变而产生的共振角移位的示意图（下面）。
[0182] 图10 :图形显示对于不同糖基化水平的HSA(%百分比；糖化/总蛋白）的SPR反 应。注意：每个样品的总蛋白浓度恒定为I U g/mL总蛋白的水平。（绿色）适体功能化的 表面，（红色）裸Au表面。
[0183] 图Ila-Ile :对于DTSP-PEG3二元SAM形成的还原解吸附的示意图：（图Ila)在Au 上的MPA和PEG3的共吸附；（图llb)MPA的还原解吸附；（图11c)DTSP的吸附；（图lid) 适体固定化；和（图lie)从PEG3去除适体。
[0184] 图12 :对于SELEX过程的MB反选择的示意图。
[0185] 发明详述
[0186] 贯穿本公开，各种出版物、专利和出版的专利说明书通过标识引用来作为参考。这 些出版物、专利和出版的专利说明书所公开的内容通过引用并入本公开以更充分的描述本 发明所属的目前工艺水平。
[0187] 定义
[0188] 本说明书引用的所有出版物、出版的专利文献和专利申请表明了本发明涉及的本 领域技术水平。本文所引述的所有出版物、出版的专利文献和专利申请特此以引用方式都 并入，程度上相同与每个人出版、出版的专利文献或专利申请被具体地和单独地表明了通 过引用方式而并入。
[0189] 除非内容明显另外指示，如本说明书包括权利要求中所用到的单数形式"一"，"一 个"和"一种"包括复数个指示物，并且可与"至少一个"和"一个或多个"互换使用。那就 是说，提到"一个适体"包括适体的混合物，提到核苷酸包括核苷酸的混合物，依此类推。
[0190] 本文所用术语"大约"代表数值的无关紧要的修饰或变化，如此以致数值所相关的 项目的基本功能是不变的。
[0191] 本文所用术语"包括（comprises) "，"包括（comprising) "，"包括（includes) "， "包括（including) "，"包含（contains) "，"包含（containing)"及其变体，旨在涵盖非排他 的包括，如此以致包括（comprises)、包括（includes)或包含（contains) -种元素或一系 列元素的过程、方法、方法限定产物（product-by-process)或物质的组合物不仅包括那些 元素而且可包括对于这些过程、方法、方法限定产物（product-by-process)或物质的组合 物的没有明文列出的或不是固有的其他元素。
[0192] 本文所用术语"适体"表示能够结合特定的靶标实体的寡核苷酸或肽分子。通 常，适体为人造的寡核苷酸，因为其对各种靶标化合物的高亲和力和选择性而可充当抗体 模拟物，所述靶标化合物的范围从小分子例如药物和染料到复合生物分子如酶、肽和蛋白 质。通过称为通过指数扩增的配体系统进化（SELEX)的体外迭代过程，从随机寡核苷酸库 中可鉴定出针对特定的靶标化合物的订制的适体。SELEX过程的实例参见美国专利申请号 5, 270, 163 ;5, 475, 096 ;和5, 567, 588,其通过引用整体并入本文。
[0193] 类似于抗体，适体可形成3D结构充当对其靶标化合物特异的受体。适体也具有多 个超越抗体的优势，例如对范围广泛的PH和盐浓度耐受、热稳定性、容易合成以及成本效 益。适体的特异性和亲和力如果不高于抗体，也是与抗体可比的。适体也能可逆地变性来 释放靶标化合物，其使适体成为对于生物感应应用来说特别有用的受体。
[0194] 例如，适体可由的单链（ss)寡核苷酸和/或化学合成的肽构成，其通过反复多回 合的体外筛选或本领域技术人员可辨识的相当的技术来构建，以结合各种靶标。
[0195] "适体"或"核酸配体"是一类或各种具有特定核苷酸序列的核酸分子的一套拷贝。 适体可包括任何合适数量的核苷酸。"适体"是指一套以上这样分子。不同的适体可具有相 同数量或不同数量的核苷酸。适体可是DNA或RNA并可以是单链、双链或包含双链区域。
[0196] 应该理解适体和分析物或靶标之间的亲和相互作用是程度的问题。也就是说，适 体的对于其靶标的"特异性结合亲和力"意为所述适体与其适体结合的亲和力远远高于这 种适体可与混合物或样品中的其他非靶标成份结合的亲和力。
[0197] 本文所有术语"扩增（amplification) "或"扩增（amplifying) "意为增加分子或 一类分子的量或拷贝数量的任何过程或过程步骤的组合。
[0198] 本文所用"库（pool)"是从中筛选所需配体的不同序列的核酸的混合。库的来源 可从天然产生的核酸或其片段、化学合成的核酸、酶促合成的核酸或上述技术的组合产生 的核酸。修饰过的核苷酸例如具有可检测的标签、反应基团或其他修饰的核苷酸，可并入到 库里。在特定实施方案中，本文所描述的SELEX过程和/或改进的SELEX方法可用来制备 库。库也可以包括具有一个或多个共同的结构部分的核酸，如此以致所述核酸可通过结构 来分离，并不通过化学、大小或其他的分离方法。本文所用的库也有时指"文库（library)" 或"候选或核酸混合物"。例如，RNA库指由RNA组成的候选混合物。
[0199] 本文所用"核酸"，"寡核苷酸"和"多核苷酸"可互换使用来指任何长度的核苷酸 的聚合物，并且这些核苷酸可包括脱氧核苷酸、核糖核苷酸和/或类似物，或者化学修饰的 脱氧核苷酸或核糖核苷酸。术语"多核苷酸"、"寡核苷酸"和"核酸"包括双链或单链分子 以及三倍螺旋分子。
[0200] 本文所用术语"感应器"表示测量物理量并将其转换成可被观测者或仪器读出的 信号的装置。能理解感应器根据已知的标准校准。因此，通过利用适体对靶标实体的亲和 力，感应器可用来捕获靶标实体，并可使用技术人员在阅读本公开后可辨识的技术来检测。
[0201] 本文所用术语"检测（detect) "或"检测（detection) "表示确定在有限空间内的 革巴标或信号的存在（existence)、出现（presence)或客观事实（fact),其包括但不限于样 品、反应混合物、分子复合物以及包括平台和阵列在内的基质。当其指代、关于、涉及对靶标 或信号的量或数量的测量（也指代量化），检测是"量化的"，其包括但不限于设计来确定所 述靶标或信号的量或比例的任何分析。当其指代、关于、涉及依据对其它靶标或信号的相对 丰度来识别所述靶标或信号的品质或种类（其未被量化）时，检测是"定性的"。"光学检测" 表示通过视觉上可检测的信号来进行的检测：来自目的靶标或附着至靶标的探针的光谱或 图像。
[0202] 术语"标记试剂"，"标记"，或"可检测的部分"，或"可检测的元素"，或"可检测的组 分"是指可用来检测靶标分子/适体复合物的一个或多个试剂。可检测的部分或标记是能 被直接或间接检测的。
[0203] 术语"靶标"，"靶标实体"或"分析物"可在本文互换，并一般是指一种物质、化合物 或组分，其在样品中的存在或不存在必须被检测到。分析物包括但不限于生物分子并且特 别是生物标记物。本文所用术语"生物分子"表示与生物环境相关的物质、化合物或组分，包 括但不限于蔗糖、氨基酸、肽、蛋白质、核苷酸、多聚核酸、多肽、有机分子、半抗原、表位、生 物细胞、生物细胞的部分、维生素、激素等等。术语"生物标记物"表示与生物环境的特定状 态（包括但不限于细胞周期的阶段、健康和疾病状态）相关的生物分子。生物标记物的存 在、不存在、减少、上调与特定状态相关或指示特定状态。术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"旨 在包含任意长度的氨基酸的聚合物，线性或分支的，其可能被或未被天然地或介入地修饰， 例如通过糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、二硫键形成、接合或其他操作或修饰。
[0204] 术语"固体支持物"意指具有分子可直接或间接地通过共价或非共价键附着的表 面的任何基质。基质材料可以是天然发生的、合成的或天然发生材料的修饰。固体支持物 材料可包括磁珠或能具有一个或多个功能基团的其他任何材料，所述功能基团例如任意氨 基、羧基、巯基或羟基功能基团，比如并入到其表面。固体支持物可采用各种配置中任一种， 范围从样品到复合物，并具有若干形状中任一，包括珠、盘、粒子、平板、棒、条、管、孔等等。 所述表面可以是相对平面（例如，薄片），球形（例如，珠），圆柱体（例如，柱子），或凹槽 状。
[0205] 术语"分离"意指借以将混合物中的一个或多个组分从混合物其他组分中分离出 来的任何过程。例如，结合到靶标分子的适体可从其他没有结合到靶标分子的核酸和从非 靶标分子中分离出来。也就是，分离过程或步骤允许将候选混合物中的全部核酸基于其针 对靶标分子的相对亲和力和/或解离速率分离成至少两个库。分离过程可通过各种方法完 成。例如，其上缀合有靶标分子的磁珠可用于分离混合物中的适体。作为另一个实例，表面 等离子共振（SPR)技术可用于分离混合物中的核酸，通过将靶标固定化到感应器芯片上并 将混合物流过芯片，其中具有针对靶标的亲和力的那些核酸可结合到靶标上，而且他核酸 可被洗掉。
[0206] 本文所用术语"样品"是指混合物、气体、或者可能包含或不包含靶标或分析物的 物质。样品包括但不限于生物样品，例如血液、痰、呼气、尿、精液、唾液、羊水、脑膜液、腺体 液、乳头抽出物、淋巴液、支气管抽出物、关节抽出物、滑液、细胞提取物、脑脊液、来自粪便 或组织样品的匀浆的固体材料、细菌培养物、病毒培养物或其实验分离片段。
[0207] 术语"非靶标"是指与适体形成非特异性复合物的样品中的分子。需领会对于第 一个适体是非靶标的分子可能是第二个适体的靶标。类似地，对于第一个适体是靶标的分 子可能对第二个分子是非靶标。
[0208] 一般说明
[0209] 所述方法和装置提供了系统，其具有所需的高亲和力和特异性从而能够在所需测 试环境中和灵敏的浓度下检测糖基化的蛋白。
[0210] 在一个特定的方面，所述方法包括从总血清蛋白水平中确定特定的糖基化的蛋白 的比率（fraction)。这种蛋白质的非限制性的实例包括：人血红蛋白、白蛋白（例如人血 清白蛋白（HSA))和IgM蛋白。
[0211] 体内两个常见的糖基化的蛋白是血红蛋白Alc(HbAlc)和免疫球蛋白M(IgM)(其 为存在于B细胞的一种基本抗体）。HbAlc和IgM在体内具有不同的半衰期，例如HbAlc 为?6-8周，而IgM为?1周。因此，血清中这些糖基化的蛋白的量化提供关于在较短和较 长时期的血糖控制的回顾性判断。所述方法克服了其他测试的首要不足，在其他测试中只 有一种类型的糖基化的血清蛋白可被检测；并且因此关于葡萄糖控制的任何依顺性评估限 于仅一个固定时期。也要注意本方法克服了限制测定结果的其他不足，例如来自血红蛋白 病、溶血、贫血的干扰。
[0212] 应理解，在本文所描述的方法/装置的其他特定的实施方案中，一个或多个其他 分子或其片段，例如其他糖基化的蛋白可被精确地测试。因为所述方法促进除血红蛋白或 位点特异性ffiAlc之外的糖基化的血液蛋白的检测和测量，所述方法也对其他用来评价血 糖控制的技术是有用的。
[0213] 在特定实施方案中，可以完成糖基化的蛋白的目标历史时间记录从约数天到约6 周的时期，取决于所评估的特定的糖基化的蛋白，因为糖基化的蛋白在血中具有不同半衰 期。相比之下，先前的测试局限于评估仅一个固定时期。
[0214] 这种方法和使用这种方法的平台是高度的小型化的并在提供实时检测和分析的 手持装置中是有用的。
[0215] 所述方法具有在分析物的医学测试中有用所必需的灵敏度。
[0216] 所述方法进一步允许不同种类蛋白质的评估，例如糖基化的血红蛋白和其他糖基 化形式的血液蛋白。
[0217] 本文所描述的一个方法中，表面等离子共振与高度功能化的适体感应表面一起使 用以提供一种精确、快速和相对低廉的方法，通过测量血清中特定血糖蛋白的水平来评估 血糖依顺性。
[0218] 话体的测定
[0219] 本文所描述的方法对检测不同类型的适体有用。在一个实施方案中，为了分离和 鉴定对血红蛋白、白蛋白和IgM的糖基化/非糖基化的蛋白特异性的寡核苷酸（适体），可 使用通过指数扩增的配体系统进化（SELEX)富集流程。
[0220] 虽然标准的SELEX流程允许对给定目的蛋白的特有配体的筛选，本文所描述了改 进SELEX方法，其鉴定出能检测并捕获两种蛋白版本（比如糖基化和非糖基化形式）的第 二适体，如本文进一步解释的那样。
[0221] 本文所描述的一个实施方案中，第二适体的鉴定用来确定糖化百分比，其与给定 时间框架内的平均葡萄糖水平相关联。
[0222] 检测平台：蛋白感应和表面等离子共振（SPR)光谱法
[0223] 对于蛋白质检测，自组装单层（SAM)用来将特异性受体附着到金SPR感应表面。 SPR光谱法本身与导体和电解质之间界面上发生的现象有关。在此界面，可存在表面等离子 体，其为电子结构中的电荷密度振荡。这些表面等离子体最常见地被在可见光到近红外光 谱内的光所激发。这种激发可作为在连续金属表面的自由传导表面等离子体或通过使用基 于纳米颗粒结构的金属作为局部效果而发生。在本文所描述的一个实施方案中，使用了自 由传导表面等离子体。
[0224] 简而言之，价电子从原子核解离，并实质上作为在外电场存在下的一种电子气；可 表明，表面等离子体是具有相应波矢量等于如下的合成波：
【权利要求】
1. 用于优化针对一种或多种分析物的感应器的灵敏度和/或选择性的方法，包括 将一种或多种类型的适体连接到具有自组装单层（SAM)连接的基质上，所述SAM连接 具有所需的连接间距和/或长度以在基质上形成功能化的表面， 为了基于分析物和/或适体特性来优化表面等离子共振（SPR)、拉曼光谱法、或荧光光 谱法中至少一种的灵敏度和选择性来选择所需的连接间距和/或长度。
2. 权利要求1的方法，其中所述SAM连接的至少一种堆积密度和/或长度影响表面等 离子共振（SPR)信号。
3. 权利要求1的方法，其中连接是通过二元SAM和还原解吸附过程。
4. 权利要求3的方法，其中所述解吸附过程包括：将基质的功能化的表面暴露于抗蛋 白质吸附的物质来抑制蛋白质在功能化的基质上的非特异性吸附。
5. 权利要求4的方法，其中抗蛋白质吸附的物质包括1-巯基-11-^^一烷基）三（乙 二醇）（PEG3)。
6. 权利要求1的方法，其中所述SAM连接包括巯基化合物，所述巯基化合物具有能够与 适体形成稳定键的羧基部分。
7. 权利要求6的方法，其中巯基化合物包括二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)。
8. 权利要求1的方法，其中使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)和（1-巯 基-11-i^一烷基）三（乙二醇）（PEG3)形成所述SAM连接， 其中PEG3防止蛋白质的非特异性吸附，而且 其中在DTSP上的羧基部分与适体形成稳定键合。
9. 权利要求1的方法，其中二元的SAM巯基溶液用于所述SAM连接中。
10. 权利要求9的方法，其中通过将3-巯基丙酸（MPA)与（1-巯基-11-i^一烷基）三 (乙二醇）（PEG3)的ImM乙醇溶液相混合，同时保持二元SAM的总浓度为约ImM来制备所述 二元的SAM巯基溶液。
11. 权利要求10的方法，其中MPA和PEG3以约20:80、约50:50或约80:20的比例存 在。
12. 权利要求10的方法，其进一步包括 通过还原解吸附来清除MPA，完整保留PEG3 ;和 允许二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)与适体上的氨基基团键合，而PEG3不形 成任何键。
13. 权利要求中任一项的方法，其中所述适体包括能被固定化到3-巯基丙酸（MPA)上 的胺修饰的适体。
14. 权利要求中任一项的方法，其中所述表面具有在约5nM-约1000nM范围的最佳动力 学。
15. 权利要求中任一项的方法，其中所述感应器包括混合长度的间隔层。
16. 权利要求15的方法，其中所述混合长度层包括11-巯基i^一烷酸（MUA)与3-巯基 丙酸（MPA)相组合。
17. 权利要求中任一项的方法，其中使用水溶的包含巯基的氨基酸形成SAM连接，所述 氨基酸能直接结合到基质的表面。
18. 权利要求17的方法，其中所述氨基酸包括半胱氨酸。
19. 用于形成针对一种或多种分析物的感应器的方法，包括： a) 在基质上吸附由3-巯基丙酸（MPA)和（1-巯基-11-i^一烷基）三（乙二醇）（PEG3) 构成的二元组件； b) 从步骤a)的基质上还原解吸附MPA; c) 在步骤b)的基质上形成二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)层； d) 在步骤c)的基质上固定化至少一种类型的适体；并且， e) 将未结合的适体从步骤d)的基质上的PEG3中去除，由此留下附着在基质的DTSP层 上的适体。
20. 用于形成针对一种或多种分析物的感应器方法，包括： a) 在乙醇溶液中在金表面基质上吸附由3-巯基丙酸（MPA)和（1-巯基-11-i^一烷 基）三（乙二醇）（PEG3)构成的二元组件； b) 在0. 5MKOH溶液中从步骤a)的基质上还原解吸附MPA，其中通过对溶液施加30分 钟-1. 2V的电势而选择性地还原在MPA和PEG3的相分离的二元自组装单层（SAM)中所吸 附的MPA; c) 将其上具有PEG3层的步骤b)的基质浸入ImMDTSP溶液中，以在其上形成DTSP层； d) 在步骤c)的基质上固定化至少一种类型的适体；并且 e) 将适体从步骤d)的基质上的PEG3中去除，由此留下附着在基质的DTSP层上的适 体。
21. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述基质具有金表面。
22. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述分析物包括血液中蛋白质的糖基化形式。
23. 权利要求22的方法，其包括确定总血清蛋白水平中的一部分特定糖基化蛋白。
24. 权利要求中任一项的方法，其中所述分析物包括如下的一种或多种：人血红蛋白、 白蛋白包括人血清白蛋白（HSA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、纤维蛋白原和/ 或其片段，所述分析物是非糖基化或糖基化形式。
25. 权利要求中任一项的方法，其中所述分析物包括至少第一种分析物，其具有与至少 第二种分析物不同的半衰期，并且所述方法进一步包括量化第一种和第二种分析物来提供 关于在一个或多个时间段中第一种和第二种分析物的水平的回顾性判断。
26. 权利要求25的方法，其中第一种分析物包括血红蛋白并且第二种分析物包括免疫 球蛋白M(IgM);并且，其中第一种分析物或第二种分析物以糖基化形式或非糖基化形式存 在。
27. 权利要求中任一项的方法，其中所述分析物包括至少第一种分析物，至少第二种分 析物和至少第三种分析物，第一种、第二种和第三种分析物的每一种具有不同的半衰期，所 述方法进一步包括：量化第一种、第二种和第三种分析物以提供关于在一个或多个时间段 中第一种、第二种和第三种分析物的水平的回顾性判断。
28. 权利要求27的方法，其中第一种分析物包括血红蛋白，第二种分析物包括IgM并且 第三种分析物包括白蛋白；其中第一种分析物、第二种分析物或第三种分析物中的一种或 多种以糖基化形式或非糖基化形式存在。
29. 权利要求中任一项的方法，用于监测过去的平均血液分析物水平，所述方法包括： 将通过前述权利要求中任一项的方法形成的感应器与血液样品相接触；确定血液中糖基化 形式的分析物的量；和将血液样品分析物中以糖基化形式存在的分析物的量与给定时间范 围的对照水平相关联。
30. 权利要求29的方法，其中所述糖基化形式的蛋白的量是用表面等离子共振（SPR) 来确定。
31. 感应器，其包括：连接到具有自组装单层（SAM)连接的基质上的一种或多种类型的 适体，所述SAM连接具有所需的连接间距和/或长度以形成在基质上的功能化的表面， 为了基于分析物和/或适体特性来优化表面等离子共振（SPR)、拉曼光谱法、或荧光光 谱法中至少一种的灵敏度和选择性来选择所需的连接间距和/或长度。
32. 权利要求中任一项的感应器，其中所述SAM连接的至少一种堆积密度和/或长度影 响表面等离子共振（SPR)信号。
33. 权利要求中任一项的感应器，其中所述连接是通过二元SAM和还原解吸附过程。
34. 前述权利要求的感应器，其中所述基质的功能化的表面已暴露于抗蛋白吸附的物 质，其足以抑制蛋白质在功能化的表面上的非特异性吸附。
35. 前述权利要求的感应器，其中抗蛋白质吸附的物质包括1-巯基-11-十一烷基）三 (乙二醇）（PEG3)。
36. 权利要求中任一项的感应器，其中所述SAM连接包括具有能够与适体形成稳定键 的羧基部分的巯基化合物。
37. 前述权利要求的感应器，其中所述巯基化合物包括二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸 盐（DTSP)。
38. 权利要求中任一项的感应器，其中使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)和 (1-巯基-11-i^一烷基）三（乙二醇）（PEG3)形成所述SAM连接， 其中PEG3防止蛋白质的非特异性吸附，而且 其中在DTSP上的羧基部分与适体形成稳定键合。
39. 权利要求中任一项的感应器，其中二元的SAM巯基溶液用于所述SAM连接中。
40. 前述权利要求的感应器，其中通过将3-巯基丙酸（MPA)与（1-巯基-11-i^一烷 基）三（乙二醇）（PEG3)的ImM乙醇溶液相混合，同时保持二元SAM的总浓度为约ImM来 制备所述二元的SAM巯基溶液。
41. 前述权利要求的感应器，其中MPA和PEG3以约20:80、约50:50或约80:20的比例 存在。
42. 权利要求中任一项的感应器，其中通过还原解吸附清除MPA，完整保留PEG3 ;和二 硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)与适体上的氨基基团共价结合，并且PEG3不形成任 何键。
43. 权利要求中任一项的感应器，其中所述适体包括能被固定化到3-巯基丙酸（MPA) 上的胺修饰的适体。
44. 权利要求中任一项的感应器，其中所述表面具有在约5nM-约1000nM范围的最佳动 力学。
45. 权利要求中任一项的感应器，其中所述感应器包括混合长度的间隔层。
46. 前述权利要求的感应器，其中所述混合长度层包括11-巯基十一烷酸（MUA)与 3_巯基丙酸（MPA)相组合。
47. 权利要求中任一项的感应器，其中所述SAM连接包括水溶的包含巯基的氨基酸，其 能直接结合到基质的表面。
48. 前述权利要求的感应器，其中所述氨基酸包括半胱氨酸。
49. 权利要求中任一项的感应器，其中基质的至少表面是金的。
50. 权利要求中任一项的感应器，其配置为感应包括血液中蛋白质的糖基化形式的分 析物。
51. 前述权利要求的感应器，其配置为从总血清蛋白水平中确定一部分特定的糖基化 蛋白。
52. 权利要求中任一项的感应器，其中所述分析物包括如下的一种或多种：人血红蛋 白、白蛋白包括人血清白蛋白（HSA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、纤维蛋白原 和/或其片段，所述分析物为糖基化或非糖基化形式。
53. 权利要求中任一项的感应器，其中分析物包括至少第一种分析物，其具有与至少第 二种分析物不同的半衰期。
54. 前述权利要求的感应器，其中第一种分析物包括血红蛋白并且第二种分析物包括 免疫球蛋白M(IgM);并且，其中第一种分析物或第二种分析物以糖基化形式或非糖基化形 式存在。
55. 权利要求中任一项的感应器，其中所述分析物包括至少第一种分析物，至少第二种 分析物和至少第三种分析物，第一种、第二种和第三种分析物的每一种具有不同的半衰期。
56. 前述权利要求的感应器，其中第一种分析物包括血红蛋白，第二种分析物包括IgM 并且第三种分析物包括白蛋白；其中第一种分析物、第二种分析物或第三种分析物的一种 或多种是以糖基化形式或非糖基化形式存在。
57. 权利要求中任一项的感应器用于监测过去的平均血液分析物水平的用途，其通过： 将用前述权利要求中任一项的方法形成的感应器与血液样品相接触；确定血液中分析物的 糖基化形式的量；并将血液样品分析物中以糖基化形式存在的分析物的量与给定时间范围 的对照水平相关联。
58. 前述权利要求的用途，其中所述蛋白质的糖基化形式的量使用表面等离子共振 (SPR)来确定。
59. 权利要求中任一项的感应器，其中所述适体包括能够与特定的分析物相互作用的 核苷酸序列。
60. 权利要求中任一项的感应器，其中所述感应器能够与选自如下的一种或多种分析 物相互作用：大生物分子、小生物分子、有机分子、小分子、核酸、金属离子、蛋白质、酶、肽、 药物、染料、癌细胞、病毒、激素或微生物。
61. 权利要求中任一项的感应器，其中所述分析物是如下的一种或多种：生物样品、环 境样品、化学样品、药物样品、食品样品、农业样品和兽医样品。
62. 权利要求中任一项的感应器，其中所述分析物为血液蛋白。
63. 权利要求中任一项的感应器，其中所述感应器具有基于连接子特性的能检测 pM-nM的可调检测范围。
64. 权利要求中任一项的感应器，其具有小于1分钟的反应时间。
65. 权利要求中任一项的感应器，其在约室温下具有小于1分钟的反应时间。
66. 权利要求中任一项的感应器，其中所述适体包括与SEQIDN0:4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14和15中任一的完整序列有至少70%同一性的DNA序列。
67. 权利要求中任一项的感应器，其中所述适体包括本文所要求保护的适体中的任意 一种。
68. 用于检测一种或多种分析物的试剂盒，其包括：权利要求中任一项的感应器；和包 含感应器的至少一个容器，其中样品可以添加到所述容器中。
69. 权利要求中任一项的试剂盒，其还包括一种或多种固体支持物；用于从洗脱物中 分离感应器的一种或多种分离剂，以及用于从感应器中分离适体的一种或多种试剂。
70. 用于从其中具有单个靶标位点结合适体和非靶标蛋白结合适体的核酸库中鉴定出 单个靶标位点结合适体的方法，其包括： a) 向到核酸库中加入单个位点靶标蛋白复合物，其中库中存在的单个靶标位点结合适 体和非靶标蛋白结合适体结合到单个位点靶标蛋白复合物上，并形成单个靶标位点结合适 体+非靶标蛋白结合适体+单个位点靶标蛋白复合物； b) 从库中分离单个靶标位点结合适体+非靶标蛋白结合适体+单个位点靶标蛋白复合 物； c) 将所述单个靶标位点结合适体和非靶标蛋白结合适体从单个位点靶标蛋白复合物 上洗脱； d) 向上面步骤中的洗脱物中加入非靶标蛋白复合物，其中存在于步骤c)中的所述非 靶标蛋白结合适体结合到非靶标蛋白复合物，并形成非靶标蛋白结合适体+非靶标蛋白复 合物； e) 将非靶标蛋白结合适体+非靶标蛋白复合物从上面步骤的洗脱物中分离出来，在洗 脱物中留下单个靶标位点结合适体；并且， f) 从洗脱物中分离单个靶标位点结合适体；任选地，进一步扩增单个靶标位点结合适 体。
71. 权利要求70的方法，其中所述单个靶标位点结合适体用来选择如下的一种：血红 蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)和白蛋白。
72. 权利要求70的方法，其中所述单个靶标位点结合适体选自：SEQIDNO:3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14 和 15。
73. 权利要求70的方法，其中所述单个位点靶标蛋白固定化到固体支持物上。
74. 权利要求70的方法，其中所述非靶标蛋白复合物固定化到固体支持物上。
75. 权利要求70的方法，其中固体支持物包括磁珠、层析基质、微量滴定盘或阵列。
76. 结合到糖基化的血红蛋白的适体，其中所述适体包括选自SEQIDN0:4和5的核酸 序列。
77. 权利要求76的适体，其中所述糖基化的血红蛋白为人血红蛋白。
78. 权利要求76的适体，其中所述适体对于人血红蛋白具有100nM或更小的解离常数。
79. 权利要求76的适体，其中所述适体包括至少一种化学修饰。
80. 权利要求79的适体，其中所述修饰选自：在糖位点的化学替换、在核苷酸之间连接 的化学替换和在碱基位点的化学替换。
81. 试验试剂，其包含有效量的权利要求76的适体或其盐，以及其支持物。
82. 包括权利要求76的适体的试剂盒。
83. 权利要求中任一项的适体，其结合到糖基化的血红蛋白，其中所述适体包括选自 SEQIDN0:4和5的核酸序列，以及5' -连接子和3'-连接子中一个或多个。
84. 权利要求83的适体，其中所述连接子为自组装单层（SAM)。
85. 适体，其与SEQIDN0:4和5中任一的完整序列有至少70%同一性并结合到糖基 化的人血红蛋白。
86. 物质的组合物，其包括缀合到核酸适体分子的自组装单层（SAM)，所述核酸适体 分子含有能特异地结合糖基化的血红蛋白的区域的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列选自 SEQIDN0:4 和 5。
87. 权利要求86的组合物，其中所述适体分子为聚乙二醇化的。
88. 前述权利要求的组合物，其中所述聚乙二醇化的适体分子包括1-巯基-11-十一烷 基）三（乙二醇）（PEG3)。
89. 权利要求86的组合物，其中使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)和（1-巯 基-11-i^一烷基）三（乙二醇）（PEG3)形成所述SAM连接。
90. 结合到非糖基化的血红蛋白的适体，其中所述适体包括选自SEQIDNO:6和7的核 酸序列。
91. 权利要求90的适体，其中所述非糖基化的血红蛋白为人血红蛋白。
92. 权利要求90的适体，其中所述适体对于人血红蛋白具有100nM或更小的解离常数。
93. 权利要求90的适体，其中所述适体包括至少一种化学修饰。
94. 前述权利要求的适体，其中所述修饰选自：在糖位点的化学替换、在核苷酸之间连 接的化学替换和在碱基位点的化学替换。
95. 试验试剂，其包含有效量的权利要求90的适体或其盐，以及其支持物。
96. 包括权利要求90的适体的试剂盒。
97. 权利要求90的适体，其结合到糖基化的血红蛋白，其中所述适体包括选自SEQID N0:6和7的核酸序列，以及5' -连接子和3' -连接子中一个或多个。
98. 前述权利要求的适体，其中所述连接子为自组装单层（SAM)。
99. 适体，其与SEQIDN0:6和7中任一的完整序列有至少70%同一性并结合到糖基 化的人血红蛋白。
100. 物质的组合物，其包括缀合到核酸适体分子的自组装单层（SAM)，所述核酸适体 分子含有能特异地结合非糖基化的血红蛋白的区域的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列选 自SEQIDN0:6 和 7。
101. 权利要求100的组合物，其中所述适体分子为聚乙二醇化的。
102. 前述权利要求的组合物，其中所述聚乙二醇化的适体分子包括1-巯基-11-十一 烷基）三（乙二醇）（PEG3)。
103. 权利要求100的组合物，其中使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)和 (1-巯基-11-i^一烷基）三（乙二醇）（PEG3)形成所述SAM连接。
104. 结合到糖基化的血清白蛋白的适体，其中所述适体包括选自SEQIDN0:3、8和9 的核酸序列。
105. 权利要求104的适体，其中所述糖基化的血清白蛋白为糖基化的人血清白蛋白。
106. 权利要求104的适体，其中所述适体对于糖基化的人血清白蛋白具有lOOnM或更 小的解离常数。
107. 权利要求104的适体，其中所述适体包括至少一种化学修饰。
108. 前述权利要求的适体，其中所述修饰选自：在糖位点的化学替换、在核苷酸之间 连接的化学替换和在碱基位点的化学替换。
109. 试验试剂，其包含有效量的权利要求104的适体或其盐，以及其支持物。
110. 包括权利要求104的适体的试剂盒。
111. 权利要求104的适体，其结合到糖基化的血清白蛋白，其中所述适体包括选自SEQ IDNO: 3、8和9的核酸序列，以及5' -连接子和3' -连接子中一个或多个。
112. 前述权利要求的适体，其中所述连接子为自组装单层（SAM)。
113. 适体，其与SEQIDNO: 3、8和9中任一的完整序列有至少70%同一性并结合到糖 基化的人血清白蛋白。
114. 物质的组合物，其包括缀合到核酸适体分子的自组装单层（SAM)，所述核酸适体 分子含有能特异地结合糖基化的血清白蛋白的区域的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列选 自SEQIDN0:3、8 和 9。
115. 前述权利要求的组合物，其中所述适体分子为聚乙二醇化的。
116. 前述权利要求的组合物，其中所述聚乙二醇化的适体分子包括1-巯基-11-十一 烷基）三（乙二醇）（PEG3)。
117. 权利要求114的组合物，其中使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)和 (1-巯基-11-i^一烷基）三（乙二醇）（PEG3)形成所述SAM连接。
118. 结合到非糖基化的血清白蛋白的适体，其中所述适体包括选自SEQIDNO: 10、11、 12、13、14和15的核酸序列。
119. 权利要求118的适体，其中所述非糖基化的血清白蛋白为糖基化的人血清白蛋 白。
120. 权利要求118的适体，其中所述适体对于非糖基化的人血清白蛋白具有100nM或 更小的解离常数。
121. 权利要求118的适体，其中所述适体包括至少一种化学修饰。
122. 前述权利要求的适体，其中所述修饰选自：在糖位点的化学替换、在核苷酸之间 连接的化学替换和在碱基位点的化学替换。
123. 试验试剂，其包含有效量的权利要求118的适体或其盐，以及其支持物。
124. 包括权利要求118的适体的试剂盒。
125. 权利要求118的适体，其结合到非糖基化的血清白蛋白，其中所述适体包括选自 SEQIDNO: 10、11、12、13、14和15的核酸序列，以及5'-连接子和3' -连接子中一个或多 个。
126. 前述权利要求的适体，其中所述连接子为自组装单层（SAM)。
127. 适体，其与SEQIDNO: 10、11、12、13、14和15中任一的完整序列有至少70%同一 性并结合到非糖基化的人血清白蛋白。
128. 物质的组合物，其包括缀合到核酸适体分子的自组装单层（SAM)，所述核酸适体 分子含有能特异地结合非糖基化的血清白蛋白的区域的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列 选自SEQIDNO: 10、11、12、13、14 和 15。
129. 前述权利要求的组合物，其中所述适体分子为聚乙二醇化的。
130. 前述权利要求的组合物，其中所述聚乙二醇化的适体分子包括1-巯基-11-十一 烷基）三（乙二醇）（PEG3)。
131. 前述权利要求的组合物，其中使用二硫代二-N-琥珀酰亚胺丙酸盐（DTSP)和 (1-巯基-11-i^一烷基）三（乙二醇）（PEG3)形成所述SAM连接。
132. 纯化和分离的非天然发生的DNA序列，其选自SEQIDN0:3、4、5、6、7、8、9、10、ll、 12、13、14 和 15。
133. 用于减少样本中可能存在的至少一种混杂物质的影响的方法，其包括： a) 将一个或多个亲水基团并入基质上的非结合位置，其足以基本上减少/防止混杂物 质的非特异性吸附， b) 将适体连接到具有自组装单层（SAM)连接的基质上，所述SAM连接具有所需的连接 间距和/或长度以形成在基质上的功能化的表面，和 c) 通过SPR感应器在超过普通SPR检测限度的分隔距离上检测适体结合反应。
【文档编号】C12M1/34GK104379724SQ201380013386
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年1月31日 优先权日:2012年1月31日
【发明者】B·D·卡梅伦, D-S·吉姆 申请人:托莱多大学