预调节纤维素材料的方法

预调节纤维素材料的方法
【专利摘要】本发明涉及使用苯酚氧化酶和半纤维素酶的组合预调节未洗涤的预处理的纤维素材料的方法。本发明还涉及生产糖和发酵产物的工艺，该工艺包括本发明的一种预调节方法。
【专利说明】预调节纤维素材料的方法
[0001 ] 对序列表的引用
[0002] 本申请含有一个计算机可读形式的序列表，将该序列表通过引用结合在此。 发明领域
[0003] 本发明涉及预调节未洗涤的预处理的纤维素材料的方法以及从未洗涤的预处理 的纤维素材料生产糖和发酵产物的工艺。
[0004] 背景
[0005] 纤维素材料提供了用于产生化石燃料的可替代能源的一个有吸引力的平台。将纤 维素材料（例如来自木质纤维素原料）转化成生物燃料具有如下优点，即易于获得大量原 料、避免燃烧或填埋材料的合意性、以及该生物燃料（例如乙醇）的清洁性。一旦将纤维素 材料转化成可发酵的糖，例如葡萄糖，那么这些可发酵的糖就可以被酵母发酵成生物燃料 (例如乙醇）。
[0006]为了使植物细胞壁成分破裂并允许纤维素分解酶的改善的进入，该纤维素材料被 化学和/或物理预处理。这是增加糖化产率的一个常见方法。然而，预处理还可在木质素结 构内产生官能团，这导致木质素和纤维素酶之间不希望的相互作用，致使次优的糖化产率。 因此，改善生产预处理的纤维素材料的方法和工艺在本领域中会是一个优势。
[0007] 概述
[0008] 此处说明了预调节未洗涤的预处理的纤维素材料以改善酶促糖化（水解）的方 法。还说明了使用本发明的一种预调节方法用于生产糖（即糖浆）和发酵产物（例如乙 醇）的过程。
[0009] 在第一方面中，本发明涉及一种预调节未洗涤的预处理的纤维素材料的方法，包 括用苯酚氧化酶和半纤维素酶孵育未洗涤的预处理的纤维素材料。
[0010] 在一个优选实施例中，该苯酚氧化酶是一种虫漆酶（例如来自嗜热毁丝霉）。在一 个优选实施例中，该半纤维素酶是一种木聚糖酶（例如源自于棘孢曲霉或烟曲霉）和/或 一种β-木糖苷酶（例如源自于烟曲霉）。该一种或多种半纤维素酶还可以是包括一种或 多种半纤维素酶（例如木聚糖酶和/或β-木糖苷酶）的一种纤维素分解酶制剂的部分。 [0011] 在第二方面中，本发明涉及从未洗涤的预处理的纤维素材料生产一种发酵产物 (例如乙醇）的工艺，包括：
[0012] (i)根据本发明的预调节方法，预调节该未洗涤的预处理的纤维素材料；
[0013] (ii)用一种纤维素分解酶制剂使该预调节的材料糖化；
[0014] (iii)使用一种发酵生物体进行发酵。
[0015] 根据本发明，步骤（ii)中的糖化和步骤（iii)中的发酵可以按分开水解和发酵 (SHF)、同时糖化和发酵（SSF)、同时糖化和共发酵（SSCF)、杂合的水解和发酵（HHF)、分开 水解和共发酵（SHCF)、杂合的水解和共发酵（HHCF)，以及直接微生物转化（DMC)进行。
[0016] 在一个优选实施例中，该纤维素分解酶制剂源自于木霉属（例如里氏木霉）。该 纤维素分解酶制剂通常包括内切葡聚糖酶（EG)、纤维二糖水解酶（CBH)、以及β -葡糖苷酶 (BG)。该纤维素分解酶制剂可进一步包括一种具有纤维素分解增强活性的多肽（例如橙色 嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus)或埃默森青霉菌（Penicillium emersonii)纤维 素分解增强多肽）、β_葡糖苷酶（例如烟曲霉或米曲霉β_葡糖苷酶）和/或半纤维素 酶。
[0017] 在第三方面中，本发明涉及从未洗涤的预处理的纤维素材料生产一种糖的工艺， 包括：
[0018] (a)根据本发明的预调节方法，预调节该未洗涤的预处理的纤维素材料；
[0019] (b)用一种纤维素分解酶制剂使该调节的材料糖化。
[0020] 可将这些糖用在用于生产糖浆（例如高果糖玉米糖浆（HFCS))和/或木质纤维素 衍生的塑料（例如聚乙烯、聚苯乙烯以及聚丙烯）、聚乳酸（例如用于生产PET)的过程中。
[0021] 半纤维素：如此处使用的，术语"半纤维素"是指生物质材料除了纤维素之外的一 种寡糖或多糖。半纤维素在化学上是异质的并包括通过氢键结合到该植物细胞壁中的纤维 素微纤维的呈复杂的异质的枝状和线性多糖或寡糖的多种聚合的糖，主要是D-戊糖，例如 木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、以及甘露聚糖，并且其中木糖通常呈最大量。半纤维素可 共价地附接到木质素，并通常氢键合到纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基 质，形成高度复杂结构。半纤维素材料包括任何形式的半纤维素，例如降解或水解为寡糖的 多糖。在此应理解的是，半纤维素可以是呈以下形式：木质纤维素的一个组分、包括木质素 的植物细胞壁材料、纤维素、以及混合基质中的半纤维素。
[0022] 成熟多肽：术语"成熟多肽"意指在翻译和任何翻译后修饰（如N末端加工、C末 端截短、糖基化、磷酸化等）之后呈其最终形式的一种多肽。在本领域中已知的是，宿主细 胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽（即，具有不同的C末端 和/或N末端氨基酸）的混合物。该成熟多肽可使用信号P(SignalP)程序（Nielsen等人， 1997,蛋白质工程（Protein Engineering) 10:1-6)预测。
[0023] 成熟多肽编码序列：术语"成熟多肽编码序列"在此处被定义为编码具有生物活性 的成熟多肽的核苷酸序列。该成熟多肽编码序列可使用信号P(SignalP)程序（Nielsen等 人，1997,上文）预测。
[0024] 预处理的玉米秸杆：术语"PCS"或"预处理的玉米秸杆"意指源自于玉米秸杆的已 被预处理（例如通过用热和稀硫酸处理）的一种纤维素材料。
[0025] 序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数"序列 一致性"描述。
[0026] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套件 (The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯（Rice)等人，2000,遗传 学趋势（Trends Genet.) 16:276-277)(优选5. 0. 0版或更新版本）的Needle程序中所实 施的尼德尔曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德尔曼和翁施，1970,分子生物学杂志 (J. Mol. Biol. )48:443-453)来测定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数 是空位开放罚分10、空位延伸罚分0. 5,以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩 阵。标记为"最长一致性"的尼德尔的输出（使用-nobrief选项获得）被用作百分比一 致性并且被计算如下：
[0027] (一致的残基X 100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0028] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套 件，赖斯等人，2000,同上）（优选5. 0. 0版或更新版本）的Needle程序中所实施的尼德尔 曼-翁施算法（尼德尔曼和翁施，1970,同上）来测定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序 列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0. 5以及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩阵。标记为"最长一致性"的尼德尔的输出（使用-nobrief 选项获得）被用作百分比一致性并且被计算如下：
[0029] (一致的脱氧核糖核苷酸X 100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0030] 变体：术语"变体"是指包括一个变更（即在一个或多个位置处取代、插入、和/或 删除一个或多个（例如若干个）氨基酸残基）的一个多肽（例如酶）。取代是指用不同的 氨基酸替换占据一个位置的氨基酸；删除是指除去占据一个位置的氨基酸；并且插入是指 添加与占据一个位置的氨基酸相邻的氨基酸。
[0031] 在此提及"约"一个数值或参数包括指向那个数值或参数本身的方面。例如，提及 "约X"的描述包括方面"X"。
[0032] 如在此和所附权利要求书中所使用，单数形式"一种/个"、"或"以及"该"包括复 数指示物，除非上下文以另外的方式清楚表明。应该理解的是在此描述的本发明的这些方 面包括"由方面组成"和/或"基本由方面组成"。
[0033] 除非另外定义或由背景清楚指示，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如 本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0034] 详细说明
[0035] 本发明尤其涉及预调节未洗涤的预处理的纤维素材料的方法以及从未洗涤的预 处理的纤维素材料生产一种发酵产物（例如乙醇）的工艺，该工艺包括本发明的一种预调 节方法。
[0036] 诸位发明人已经发现，当用虫漆酶和半纤维素酶的组合预调节未洗涤的预处理的 玉米秸杆（其包括约37% -42%纤维素和21% -27%半纤维素）时，该酶水解速率增加并 且总糖含量提高。这种有益效果被认为归因于对木糖低聚物和木质素衍生物抑制的降低。
[0037] 本发明的预调节方法可以在其中产生糖的糖化步骤（即水解步骤）之前进行。这 些糖可被转化为多个产物，包括发酵产物（例如乙醇或丁醇），或被转化为糖浆（例如高果 糖玉米糖浆）以及木质纤维素衍生的塑料，包括聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯）。其他考虑到的 终产物包括乳酸，其可充当用于生产聚乳酸（PLA)以替代石油化学的包装材料（例如PET) 的一种原料。
[0038] 预调节未洗涤的预处理的纤维素材料的方法
[0039] 在第一方面中，本发明涉及一种预调节未洗涤的预处理的纤维素材料的方法，包 括用苯酚氧化酶和半纤维素酶孵育未洗涤的预处理的纤维素材料。
[0040] 该苯酚氧化酶可以是任何苯酚氧化酶。在一个优选实施例中，该苯酚氧化酶是虫 漆酶。特别考虑到的是嗜热毁丝霉虫漆酶（W0 95/33836中的SEQ ID N0:2)或此处的SEQ ID N0:12。其他适合的虫漆酶在以下的"虫漆酶"部分中提出。
[0041] 还可以使用其他苯酚氧化酶。在以下的"苯酚氧化酶"部分中给出实例。
[0042] 该半纤维素酶可以是任何半纤维素酶（例如真菌或细菌起源的）。在一个优选实 施例中，该半纤维素酶是木聚糖酶和/或木糖苷酶。具体地，半纤维素酶可以是一种木聚糖 酶（例如GH10木聚糖酶）（源自于棘孢曲霉（例如披露于WO 94/21785中的Xyl II或此 处的SEQ ID N0:6))、或烟曲霉（例如披露于W0 2006/078256中的一种或此处的SEQ ID N0:8)和/或一种β-木糖苷酶（源自于烟曲霉（例如披露于W0 2011/057140中的一种或 此处的 SEQ ID N0:9))。
[0043] 在以下"半纤维素酶"部分中列出了其他半纤维素酶。
[0044] 在一个实施例中，该半纤维素酶可以是一种纤维素分解酶制剂中的其他成分。在 这类实施例中，该半纤维素酶可以是一种纤维素分解酶制剂（例如来自里氏木霉），该纤维 素分解酶制剂进一步包括一种外来半纤维素酶（即不源自于该纤维素分解酶制剂生产生 物体），例如一种木聚糖酶（例如棘孢曲霉或烟曲霉木聚糖酶）和/或木糖苷酶（例如烟曲 霉β-木糖苷酶）。
[0045] 可以使用任何适合的方法预处理该未洗涤的预处理的纤维素材料。在以下"预处 理"部分中列出了适合的预处理方法。在一个优选实施例中，该材料是稀酸预处理的或自水 解的。
[0046] 在一个实施例中，该未洗涤的预处理的材料是未解毒的。
[0047] 在一个实施例中，该未洗涤的预处理的材料是压榨的纤维素材料。
[0048] 根据本发明，该纤维素材料可以是未洗涤的预处理的玉米秸杆（PCS)、未洗涤的预 处理的玉米穗轴、未洗涤的预处理的麦秸、未洗涤的预处理的稻秸或未洗涤的预处理的柳 枝稷。在一个优选实施例中，该纤维素材料是未洗涤的稀酸预处理的玉米秸杆。
[0049] 考虑到的纤维素材料的其他实例可以在以下"纤维素材料"部分中找到。
[0050] 在一个实施例中，预调节发生在5-50(w/w) % TS，例如10-40(w/w) % TS，例如 15-35(w/w) % TS。
[0051] 在一个实施例中，该纤维素材料的预调节孵育发生持续例如至少30分钟，例如至 少1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、或24小时、或更长，或从30分钟到24小时。
[0052] 在一个实施例中，该纤维素材料的预调节孵育发生在20°C -70°C之间，例如40°C 和60°C之间。
[0053] 在一个实施例中，该苯酚氧化酶装载（尤其虫漆酶）是l_500yg之间，例如 5_100^酶类蛋白质驶)/^纤维素。
[0054] 在一个实施例中，该半纤维素酶装载是0.01和20mg EP/g纤维素之间，例如 0· 1-lmg EP/g 纤维素。
[0055] 在一个实施例中，与当在相同条件下在预调节孵育中不存在苯酚氧化酶和半纤维 素酶时相比，根据本发明的预调节导致减少的木糖低聚物和木质素衍生物。
[0056] 纤维素材料
[0057] 如此处使用的，术语"纤维素材料"是指包括纤维素（i3-(l_4)-D-葡聚糖（包括 β (1-4)连接的D-葡萄糖单元的聚合物）的一种化学上异质的寡糖或多糖）的任何木质 纤维素材料。尽管纤维素一般为多态的，但可发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的 不溶性晶体基质存在。纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮、以及穗轴，或树的叶、枝、 以及木材中。纤维素材料可以是，但不限于：草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体 废物、废纸、以及纸浆和造纸厂残余物（参见，例如，维色洛戈尔（Wiselogel)等人，1995， 于生物乙醇手册（Handbook on Bioethanol)(查尔斯· E ·怀曼（Charles E. Wyman)编 辑），第105-118页，泰勒弗朗西斯出版集团（Taylor&Francis)，华盛顿特区（Washington D.C.);怀曼（Wyman)，1994,生物资源技术（Bioresource Technology) 50:3-16; 林德（Lynd), 1990，应用生物化学与生物技术（Applied Biochemistry and Biotechnology) 24/25:695-719 ;莫思尔（Mosier)等人，1999,木质纤维素的生物转化的 最近进展（Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics)，生物化学工 程/ 生物技术的进展（Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology)，Τ·谢 伯（T. Scheper)主编，第65卷，第23-40页，纽约斯普林格出版社（Springer-Verlag，New York)。纤维素材料包括任何形式的纤维素，例如降解或水解为寡糖的多糖。在此应理解的 是，纤维素可以是呈以下形式：木质纤维素的一个组分、包括木质素的植物细胞壁材料、纤 维素、以及混合基质中的半纤维素。
[0058] 在一方面，纤维素材料是草本材料（包括能源作物）。在另一方面，纤维素材料是 农业残余物。在另一方面，纤维素材料是木材（包括林业残余物）。在另一方面，纤维素材 料是城市固体废物。在另一方面，纤维素材料是废纸。在另一方面，纤维素材料是纸浆和造 纸厂残余物。
[0059] 在另一方面，纤维素材料是玉米秸杆。在另一方面，纤维素材料是小麦杆。在另一 方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一方面，纤维素材 料是柳枝稷。在另一方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一方面，纤维素材料是稻草。在另 一方面，纤维素材料是芒草。在另一方面，纤维素材料是芦竹。在另一方面，纤维素材料是 竹材。在另一方面，纤维素材料是橙皮。在另一方面，纤维素材料是白杨。在另一方面，纤 维素材料是松树。在另一方面，纤维素材料是山杨。在另一方面，纤维素材料是冷杉。在另 一方面，纤维素材料是云杉。在另一方面，纤维素材料是柳树。在另一方面，纤维素材料是 桉树。
[0060] 在另一方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一方面，纤维素材料是细菌纤维素。 在另一方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一方面，纤维素材料是棉绒。在另一方面，纤 维素材料是无定形的磷酸处理的纤维素。在另一方面，纤维素材料是滤纸。
[0061] 在另一方面，纤维素材料是一种水生生物质。如在此所使用，术语"水生生物质"意 指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。该水生生物质可以是藻类、沉水植物、挺 水植物、以及浮叶植物。
[0062] 预处理
[0063] 预处理的纤维素材料可以是例如通过一种化学预处理、一种物理预处理、或一种 化学预处理和一种物理预处理而被预处理的，如以下所述的。在一方面，该预处理的纤维素 材料已通过一种化学预处理被预处理。在另一方面，该预处理的纤维素材料已通过物理预 处理被预处理。在另一方面，该预处理的纤维素材料已通过一种化学预处理和一种物理预 处理被预处理。
[0064] 可以使用本领域已知的任何适合的预处理工艺来破坏纤维素材料的植物细胞 壁组分（参见，例如钱德拉（Chandra)等人，2007,底物预处理：木质纤维素的有效酶水 角军的关键？ (Substrate pretreatment:The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics?)，生物化学工程 / 生物技术的进展（Adv.Biochem.Engin·/ Biotechnol.) 108:67-93 ;盖博（Galbe)和小林（Zacchi)，2007,用于高效生物乙醇生 产的木质纤维素材料的预处理（Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production),生物化学工程/生物技术的进展108:41-65;亨德 里克斯（Hendriks)和季曼（Zeeman) ,2009,用以增强木质纤维素生物质的消化性的预处 理(Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass), 生物资源技术（Bioresource Technol. )100:10-18;莫热（Mosier)等人，2005,用于木 质纤维素生物质的预处理的有前景技术的特征（Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass)，生物资源技术 96:673-686;塔希尔扎 德（Taherzadeh)和卡里米（Karimi)，2008,预处理木质纤维素废弃物以改善乙醇和生物 气体产生：综述（Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production:A review)，分子科学国际杂志（Int.J. of Mol. Sci. )9:1621-1651;杨 (Yang)和怀曼,2008,预处理：释放低成本纤维素乙醇的关键（Pretreatment:the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol)，生物燃料、生物产品与生物精炼（Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.) 2:26-40) 〇
[0065] 纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、预浸 泡、润湿。
[0066] 常规预处理包括但不限于：蒸汽预处理（伴随或不伴随爆炸）、稀酸预处理、热水 预处理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理、以及生物预 处理。另外的预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界co2、超临界4〇、臭氧、以及Y 辐射预处理。在一个优选实施例中，该纤维素材料（例如未洗涤的玉米秸杆）是稀酸预处 理的。
[0067] 在糖化（水解）和/或发酵之前对纤维素材料进行预处理。
[0068] 蒸汽预处理：在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏棺物细胞壁成分，包括木 质素、半纤维素、以及纤维素，以使酶可接触纤维素和其他级分，例如，半纤维素。使纤维 素材料经过或通过反应容器，其中注入蒸汽以将温度增加至所需的温度和压力，并且在 其中保持所希望的反应时间。蒸汽预处理可以在140°C -230°C，例如160°C -200°C、或 170°C -190°C下执行，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的任意添加。蒸汽预处理的停 留时间可以是1-15分钟，例如3-12分钟、或4-10分钟，其中最佳停留时间取决于温度范围 和化学催化剂的任意添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，这样使得纤维素材料 在预处理过程中通常仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的爆炸放料组合，这 被称为蒸汽爆炸，即，迅速闪变至大气压和材料湍流，以通过破碎增加可及的表面积（达夫 (Duff)和默里（Murray)，1996,生物资源技术 855:1-33 ;盖博（Galbe)和小林（Zacchi)， 2002,应用微生物学与生物技术（Appl. Microbiol. Biotechnol. )59:618-628 ;美国专利申 请号2002/0164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基被裂解，并且所得到的酸自催 化半纤维素部分水解成变得更增溶的半纤维素单糖和半纤维素寡糖。仅在有限的程度上去 除木质素。所得的液体主要包括溶解的半纤维素材料（例如半纤维素单糖和半纤维素寡 糖），而余下的固体主要由纤维素材料组成。
[0069] 经常在蒸汽预处理之前添加催化剂，如H2S04或S0 2 (典型地0· 3 %至3 % w/w)， 这降低时间和温度、增加回收率、并且改善酶水解（巴列斯特罗斯（Ballesteros)等人， 2006,应用生物化学与生物技术129-132:496-508 ;瓦尔加（Varga)等人，2004,应用生物化 学与生物技术113-116:509-523;萨斯那（Sassner)等人，2006,酶与微生物技术（Enzyme Microb. Technol. )39:756-762)〇
[0070] 化学预处理：术语"化学处理"是指能促讲纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离 和/或释放的任何化学预处理。适合的化学预处理方法的实例包括：（例如）稀酸预处理、 石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸（AFEX)、氨渗滤（APR)、以及有机溶剂预处理。
[0071] 在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸（典型地&504)和水混合以形成浆料，通过 蒸汽加热至所希望的温度，并且在停留时间后闪变至大气压。可以用许多反应器设计来进 行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器、或连续逆流收缩床反应器（达夫和默里， 1996,见上文，舍尔（Schell)等人，2004,生物资源技术91:179-188;李（Lee)等人，1999， 生物化学工程与生物技术的进展65:93-115)。
[0072] 还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱性预处理包括但不限于：石灰 预处理、湿氧化、氨渗滤（APR)、以及氨纤维/冷冻爆炸（AFEX)。
[0073] 用碳酸钙、氢氧化钠、或氨，在85°C _150°C的低温下进行石灰预处理，并且停留 时间为从1小时到几天（怀曼等人，2005,生物资源技术96:1959-1966 ;莫热等人，2005， 生物资源技术 96:673-686)。W0 2006/110891、W02006/110899、W0 2006/110900、以及 W0 2006/110901披露了使用氨的预处理方法。
[0074] 湿氧化是一种热预处理，其典型地在添加氧化剂（如过氧化氧或过压 氧）的情况下在180°C -200°C下持续5-15分钟进行（施密特（Schmidt)和汤姆森 (Thomsen)，1998,生物资源技术64:139-151 ;帕罗内（Palonen)等人，2004,应用生 物化学与生物技术117:1-17 ;瓦尔加等人，2004,生物技术与生物工程（Biotechnol. Bioeng. )88:567-574 ;马丁（Martin)等人，2006,化学技术与生物技术杂志（J.Chem. Technol. Biotechnol.) 81:1669-1677)。预处理优选以1 %至40 %干物质，更优选2 %至 30%干物质，并且最优选5%至20%干物质进行，并且经常通过添加碱如碳酸钠来增加初 始pH。
[0075] 被称为湿爆炸（湿氧化和蒸汽爆炸的组合）的湿氧化预处理方法的修改方案能够 处理高达30 %的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中，在一定的停留时间之后引入氧化 齐U。然后通过闪变至大气压来终止预处理（W02006/032282)。
[0076] 氨纤维爆炸（AFEX)涉及在如90°C _100°C的中等温度和如17至20bar的高压下， 用液体或气态氨处理纤维素材料5至10分钟，其中干物质含量可以高达60% (格拉帕里 (Gollapalli)等人，2002,应用生物化学与生物技术98:23-35;俊达瓦特（Chundawat)等 人，2007,生物技术与生物工程（Biotechnol. Bioeng. )96:219-231 ;阿里扎德（Alizadeh) 等人，2005,应用生物化学与生物技术121:1133-1141 ;泰莫里（Teymouri)等人，2005,生物 资源技术96:2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素的解聚和半纤维素的部分水解。木质 素-碳水化合物复合物被裂解。
[0077] 有机溶剂预处理通过使用含水乙醇（40% -60%乙醇）在160°C _200°C下萃 取30-60分钟而将纤维素材料脱木质素（潘（Pan)等人，2005,生物技术与生物工程 90:473-481 ;潘等人，2006,生物技术与生物工程94:851-861 ;库拉比（Kurabi)等人，2005， 应用生物化学与生物技术121:219-230)。通常添加硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理 中，大部分半纤维素被去除。
[0078] 适合的预处理方法的其他实例由谢尔等人，2003,应用生物化学与生物技术 105-108:69-85,和马塞尔等人，2005,生物资源技术96:673-686,以及美国专利申请 2002/0164730 进行描述。
[0079] 在一个方面中，化学预处理是以酸处理进行，例如持续稀酸和/或弱酸处理。该酸 可以是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢、或 其混合物。弱酸处理优选在1-5,更优选1-4,并且最优选1-3的pH范围内进行。在一方面， 该酸浓度在优选从〇. 01至20wt%酸，更优选0. 05至10wt%酸，甚至更优选0. 1至5wt%酸， 并且最优选〇. 2至2. Owt%酸的范围中。使酸与纤维素材料相接触，并在优选160°C _220°C， 并且更优选165°C _195°C范围内的温度下保持从几秒到几分钟，例如1秒至60分钟范围内 的时期。
[0080] 在另一方面，预处理是作为氨纤维爆破步骤（AFEX预处理步骤）进行。
[0081] 在另一方面，预处理在含水浆料中进行。在一个方面，在预处理过程中纤维素材料 以优选在10_80wt %之间，例如20-70wt %之间或30-60wt %之间，例如约50wt %的量存在。 预处理的纤维素材料可以不洗涤或使用本领域已知的任何方法洗涤，例如，用水洗涤。
[0082] 机械预处理或物理预处理：术语"机械预处理"或"物理预处理"是指促进颗粒大 小减少的任何预处理。例如，这种预处理可以涉及各种类型的研磨或碾磨（例如，干磨、湿 磨、或振动球磨）。
[0083] 纤维素材料可以物理地（机械地）且化学地预处理。机械或物理预处理可以与 以下相结合：蒸汽/蒸汽爆炸、水热解（hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处 理、辐射（例如微波福射）、或其组合。在一方面，高压意指在优选约100至约400psi，更优 选约150至约250psi范围中的压力。在另一方面，高温意指在约100至约300°C，优选约 140至约200°C范围中的温度。在一个优选方面，机械或物理预处理在分批过程中使用蒸汽 枪水解器系统，例如从顺智公司（Sunds Defibrator AB)，瑞典（Sweden)可获得的Sunds水 解器（Sunds Hydrolyzer)来进行，该系统使用如上所定义的高压和高温。这些物理预处理 和化学预处理可以根据需要顺序地进行或同时进行。
[0084] 因此，在一个优选方面，使纤维素材料经受物理（机械）或化学预处理、或其任何 组合，以促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放。
[0085] 牛物预处理：术语"牛物预处理"是指促讲纤维素、半纤维素、和/或木质素从木 质纤维素材料中分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木 质素的微生物（参见，例如，舒· T. -A. (Hsu, Τ· -A. )，1996,生物质的预处理（Pretreatment of biomass),生物乙醇手册：生产和利用，怀曼*C.E.编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团， 华盛顿特区，179-212 ;高希（Ghosh)和辛格（Singh)，1993,用于纤维素生物质的酶/微 生物转化的物理化学与生物处理（Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass),应用微生物学进展（Adv. Appl. Microbiol. )39:295-333 ;麦克米兰· J.D. (McMillan, J.D·)，1994,预处理木质纤 维素生物质：综述（Pretreating lignocellulosic biomass:a review)，用于燃料生产 的生物质的酶转化（Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production)，希默 尔· Μ. E.、贝克· J. 0.、以及奥弗伦· R. P. (Overend，R. P.)编辑，美国化学学会讨论会系列 566 (ACS Symposium Series 566)，美国化学学会（American Chemical Society)，华盛顿 特区，第 15 章；贡· C. S. (Gong, C. S.)、卡奥· N. J. (Cao, N. J.)、杜· J. (Du, J.)、以及曹-G. T. (Tsao,G.T. ),1999,由可再生资源生产乙醇（Ethanol production from renewable resources)，生物化学工程/生物技术的进展，舍佩尔· T.编辑，施普林格出版社德国海 德堡柏林（Berlin Heidelberg, Germany) ,65:207-241);奥尔森（Olsson)和哈恩-哈格 达尔（Hahn-Hagerdal)，1996,用于乙醇生产的木质纤维素水解物的发酵（Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production),酶与微生物技术（Enz. Microb. Tech. )18:312-331 ;以及瓦蓝德（Vallander)和埃里克松（Eriksson)，1990，由 木质纤维素材料生产乙醇：技术现状（Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art),生物化学工程/生物技术的进展42:63-95)。
[0086] 从未洗涤的预处理的纤维素材料牛产一种发酵产物的工艺
[0087] 在第二方面中，本发明涉及从未洗涤的预处理的纤维素材料生产一种发酵产物 (例如乙醇）的工艺，包括：
[0088] (i)根据本发明的预调节方法进行预调节；
[0089] (ii)用一种纤维素分解酶制剂使该预调节的材料糖化；
[0090] (iii)使用一种发酵生物体进行发酵。
[0091] 在一个实施例中，该发酵产物是在步骤iii)之后回收。
[0092] 用于预调节的苯酚氧化酶（例如虫漆酶）和半纤维素酶在以上的"预调节未洗涤 的预处理的纤维素材料的方法"和以下的"酶"部分中说明。
[0093] 在糖化步骤（即水解步骤）中，将该预处理的纤维素材料水解，以将纤维素和/或 半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、 和/或可溶性寡糖。该糖化是使用一种纤维素分解酶制剂酶促地执行的。
[0094] 糖化（即水解）可以在适合的含水环境中在可以由本领域技术人员容易确定的条 件下进行。在一个方面中，糖化在适于纤维素分解酶制剂的活性，优选地对于纤维素分解酶 制剂最佳的条件下进行。糖化可以以进料分批过程或连续过程进行，其中将该预调节的未 洗涤的预处理的纤维素材料（基质）逐渐进料至水解溶液中。
[0095] 糖化通常在受控的pH、温度以及混合条件下在搅拌釜反应器或发酵罐中进行。适 合的处理时间、温度以及pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续 长达200小时，例如约12至约96小时，约16至约72小时或约24至约48小时。在一方面， 糖化发生持续例如12小时，例如24小时、36小时、48小时、60小时、或72小时。
[0096] 糖化期间的温度可以在约25°C至约75°C，例如约30°C至约70°C、约35°C至约 65°C、或约40°C至60°C、或约45°C至55°C、或约50°C的范围中。
[0097] 糖化期间的pH可以在约3. 0至7. 0,例如3. 5至6. 5、4· 0至6. 0、4· 5至5. 5或约 5.0的范围中。
[0098] 在一些方面，糖化期间的干固体（DS)含量（例如该纤维素材料中的总固体）是少 于约 25wt %、20wt %、15wt %、10wt %、7. 5wt %、5wt %、2. 5wt %、2wt %、lwt %、或 0· 5wt %。
[0099] 根据本发明，步骤（ii)中的糖化和步骤（iii)中的发酵可以按分开水解和发酵 (SHF)、同时糖化和发酵（SSF)、同时糖化和共发酵（SSCF)、杂合的水解和发酵（HHF)、分开 水解和共发酵（SHCF)、杂合的水解和共发酵（HHCF)，以及直接微生物转化（DMC)进行。 [0100] 在一个实施例中，在步骤（ii)中使用的纤维素分解酶制剂可以是真菌起源的。在 一个优选实施例中，该纤维素分解酶制剂源自于木霉属（例如里氏木霉）。在一个优选实 施例中，糖化（水解）是在包括选自下组的酶活性的一种纤维素分解酶制剂的存在下进行 的，该组包括：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶（例如烟曲霉或米曲霉 β -葡糖苷酶）。在一个优选实施例中，糖化是使用一种具有纤维素分解增强活性的多肽 (例如一种橙色嗜热子囊菌或埃默森青霉菌纤维素分解增强多肽）进行。
[0101] 在一个优选实施例中，该纤维素分解酶制剂源自于木霉属（例如里氏木霉），包括 内切葡聚糖酶（EG)、纤维二糖水解酶（CBH)、以及β-葡糖苷酶（BG)，并且进一步包括具有 纤维素分解增强活性的一种多肽（例如一种橙色嗜热子囊菌或埃默森青霉菌纤维素分解 增强多肽）、β_葡糖苷酶（例如烟曲霉或米曲霉β_葡糖苷酶）。
[0102] 纤维素分解酶制剂的实例可在以下的"纤维素分解酶制剂"部分中找到。
[0103] 在一个实施例中，糖化是进一步使用选自半纤维素酶、扩张蛋白、酯酶、虫漆酶、木 质素分解酶、果胶酶、过氧物酶、蛋白酶、以及膨胀素中的一种或多种酶进行。
[0104] 在一个实施例中，该半纤维素酶可以是一种木聚糖酶（例如一种棘孢曲霉或烟曲 霉木聚糖酶）、一种木糖苷酶（例如烟曲霉β -木糖苷酶）。
[0105] 在一个实施例中，产生的发酵产物是一种醇（例如乙醇或丁醇）、一种有机酸、一 种酮、一种氨基酸、或一种气体。
[0106] 与当在相同条件下在步骤（i)预调节中未使用苯酚氧化酶和半纤维素酶时相比， 本发明的工艺导致增加的糖化速率。
[0107] 发酵:
[0108] 从该纤维素材料的糖化（水解）获得的糖可以通过能够将这些糖直接或间接发酵 成所希望的发酵产物（例如乙醇）的一种或多种（若干种）发酵微生物体进行发酵。
[0109] "发酵"或"发酵工艺"是指任何发酵方法或包括发酵步骤的任何方法。发酵方法 还包括用于消费性醇工业（例如啤酒和葡萄酒）、乳品工业（例如发酵的乳制品）、皮革工 业和烟草工业的发酵方法。发酵条件取决于所希望的发酵产物和发酵生物体，并且可以由 本领域的技术人员容易地确定。
[0110] 通过一种发酵生物体（例如酵母）将从预调节的未洗涤的预处理的纤维素材料的 糖化释放的糖发酵为一种产物，例如乙醇。如上所述，糖化（水解）和发酵可以是分开的或 同时的。
[0111] 分开或同时的糖化（水解）和发酵包括但不限于：分开糖化（水解）和发酵 (SHF)、同时糖化和发酵（SSF)、同时糖化和共发酵（SSCF)、杂合的水解和发酵（HHF)、分 开水解和共发酵（SHCF)、杂合的水解和共发酵（HHCF)，以及直接微生物转化（DMC)。SHF 使用分开的处理步骤以首先将纤维素材料糖化（水解）为可发酵糖，例如，葡萄糖、纤维 二糖、纤维三糖、以及戊糖，并且然后将这些可发酵糖发酵成乙醇。在SSF中，纤维素材 料的酶水解和糖发酵成乙醇被组合在一个步骤中（菲利皮迪斯*G. P. (Philippidis，G. Ρ·)，1996，纤维素生物转化技术（Cellulose bioconversion technology)，生物乙 醇手册：生产和利用（Handbook on Bioethanol:Production and Utilization)，怀 曼· C. E(Wyman, C. E.)编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团（Taylor&Francis),华盛顿特区 (Washington, DC)，179-212))。SSCF 涉及多种糖的共发酵（希恩 *J. (Sheehan, J.)和希 默尔·Μ.(把1111^1，^)，1999，酶、能量与环境：美国能源部研究和开发生物乙醇活性的战 略性观点(Enzymes, energy and the environment:A strategic perspective on the U. S. Department of Energy's research and development activities for bioethanol), 生物技术进展（Biotechnol. Prog.) 15:817-827)。HHF涉及一个分开的水解步骤，并且另外 涉及一个同时糖化和水解步骤，这些步骤可以在同一反应器中进行。HHF过程中的步骤可 以在不同的温度下进行，即高温酶糖化，接着在发酵菌株能够耐受的更低温度下进行SSF。 DMC将全部三个过程（酶生产、水解、和发酵）组合在一个或多个（若干个）步骤中，其中 使用了相同的生物体来产生用于转化纤维素材料为可发酵糖并且用于转化可发酵糖为终 产物的酶（林德（Lynd)等人，2002,微生物纤维素利用：基本原理和生物技术（Microbial cellulose utilization:Fundamentals and biotechnology)，微生物学与分子生物学评论 (Microbiol. Mol. Biol. Reviews) 66:506-577)。在此应理解，本领域已知的任何方法包括预 处理、酶水解（糖化）、发酵或其组合，可以用于实践本发明的方法。
[0112] 发酵牛物体
[0113] "发酵生物体"是指适合在发酵过程中使用以产生所希望的发酵产物的任何微生 物体，包括细菌生物体和真菌生物体。发酵生物体可以是己糖（即c 6)和/或戊糖（c5)发 酵生物体、或其组合。己糖和戊糖发酵生物体二者均是本领域中所熟知的。适合的发酵生 物体能够将糖（如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或寡糖） 直接或间接地发酵（即，转化）成所希望的发酵产物。
[0114] 产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例由琳（Lin)等人，2006,应用微生物学 与生物技术69:627-642描述。
[0115] 能够发酵C6糖的发酵微生物的实例包括细菌生物体和真菌生物体，如酵母。优选 的酵母包括酵母属菌株，优选酿酒酵母。
[0116] 能够发酵C5糖的发酵生物体的实例包括细菌生物体和真菌生物体，如酵母。优选 的c 5发酵酵母包括毕赤酵母属的菌株，优选树干毕赤酵母，例如树干毕赤酵母CBS 5773 ; 假丝酵母属的菌株，优选博伊丁假丝酵母（Candida boidinii)、芸薹假丝酵母（Candida brassicae)、休哈塔假丝酵母（Candida sheatae)、迪丹斯假丝酵母（Candida diddensii)、 假热带假丝酵母（Candida pseudotropicalis)、或产朊假丝酵母（Candida utilis)。
[0117] 其他发酵生物体包括发酵单胞菌属的菌株，例如运动发酵单胞菌；汉逊酵母 属，例如异常汉森酵母；克鲁维酵母属，例如马克斯克鲁维酵母（K. marxianus)、乳酸 克鲁维酵母（K. lactis)、耐热克鲁维酵母（K. thermotolerans)、以及脆壁克鲁维酵母 (K. fragilis);裂殖酵母属，例如粟酒裂殖酵母（S. pombe);大肠杆菌，尤其已被遗传修饰 以提高乙醇产率的大肠杆菌菌株；梭菌属，例如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌（Chlostridium thermocellum)、以及 Chlostridium phytofermentans ; 土芽抱杆菌属(Geobacillus sp.);热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter)，例如解糖热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter saccharolyticum);以及芽孢杆菌属，例如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，例如萨纳瑞西斯假 丝酵母（C. sonorensis)、C. methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母（C. diddensiae)、近平滑假 丝酵母（C. parapsilosis)、C. naedodendra、布朗克假丝酵母（C. blankii)、嗜虫假丝酵母 (C. entomophilia)、芸薹假丝酵母、假热带假丝酵母、博伊丁假丝酵母、产朊假丝酵母、以及 休哈塔假丝酵母；克雷伯氏菌属，例如产酸克雷伯氏菌（K. oxytoca)。
[0118] 在一方面，酵母是酵母属种。在另一方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选方面， 酵母是糖化酵母。在另一个更优选方面，酵母是葡萄汁酵母。在另一方面，酵母是克鲁维酵 母属。在另一方面，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另 一方面，酵母是假丝酵母。在另一方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一方面，酵母是芸薹假 丝酵母。在另一方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一方面，酵母是假热带假丝酵母。在另 一方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一方面，酵母是棒孢酵母属。在另一方面，酵母是葡萄 牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae)。在另一方面，酵母是仙人掌棒孢酵母（Clavispora opuntiae)。在另一方面，酵母是管囊酵母属。在另一方面，酵母是嗜鞋管囊酵母。在另一方 面，酵母是毕赤酵母属。在另一方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一方面，酵母是酒香酵母 属。在另一方面，酵母是克劳森酒香酵母（菲利皮迪斯*G. P. (Philippidis，G. P.)，1996,纤 维素生物转化技术（Cellulose bioconversion technology),生物乙醇手册：生产和利用 (Handbook on Bioethanol:Production and Utilization),怀曼 *C. E (Wyman, C. Ε·)编辑， 泰勒-弗朗西斯出版集团（Taylor&Francis)，华盛顿特区（Washington, DC)，179-212))。
[0119] 能够有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌、丙酮 丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌（Clostridium thermocellum)、 phytofermentans梭菌、土芽抱杆菌属种、解糖热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter saccharolyticum)、以及凝结芽孢杆菌（菲利皮迪斯，1996,见上文）。
[0120] 在一方面,细菌是发酵单胞菌属。在一方面，细菌是运动发酵单胞菌。在另一方 面，细菌是梭菌属。在另一方面，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一方面，细菌是Clostridium phytofermentan。在另一方面，细菌是热纤维梭菌。在另一方面，细菌是土芽孢杆菌属种。 在另一方面，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一方面，细菌是凝结芽孢杆菌。
[0121] 适于乙醇生产的可商购的酵母包括，例如乙醇红酵母（ETHANOL REDTMyeast)(可 从富酶泰斯/乐斯富（Fermentis/Lesaffre)，USA获得）、FALI?(可从弗莱施曼酵母 (Fleischmann，s Yeast)，USA 获得）、SUPERSTART? 和 THERM0SACC? 新鲜酵母（可从乙醇 技术（Ethanol Technology)，WI，USA)、BI0FERM?AFT 和 XR(可从 NABC-北美生物产品公司 (North American Bioproducts Corporation), GA，USA 获得）、GERT STRAND?(可从 Gert Strand AB，瑞典获得）、以及FERMIOL?(可从帝斯曼食品配料部（DSM Specialties)获得）。
[0122] 在一个方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用木糖 的微生物、利用阿拉伯糖的微生物、以及共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
[0123] 将异源基因克隆到不同发酵微生物中已经构建出能够将己糖和戊糖转化成乙 醇（共发酵）的生物体（陈（Chen)和霍（Ho) ,1993,酿酒酵母中毕赤酵母木糖还原酶基 因的克隆和改善表达（Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae)，应用生物化学与生物技术 (Appl. Biochem. Biotechnol.) 39-40:135-147 ;霍等人，1998,能够有效共发酵葡萄糖和 木糖的遗传工程化的酵母菌属酵母（Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose)，应用与环境微生物学 64:1852-1859;科特（Kotter)和西拉塞（Ciriacy)，1993,酿酒酵母发酵木糖（Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae),应用微生物学与生物技术（八卩卩1· Microbiol. Biotechnol.) 38:776-783 ;维尔福森（Walfridsson)等人，1995，过表达编 码戊糖磷酸途径酶转酮醇酶和转醛醇酶的TKL1和TALI基因的木糖代谢酿酒酵母菌 株(Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKLland TALlgenes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase)，应用与环境微生物学 61:4184-4190 ;凯拍（Kuyper)等人，2004,用 于有效厌氧木糖发酵的酿酒酵母的最小代谢工程化：原理的证实（Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation:a proof of principle)，欧洲微生物学会联合会酵母研究（FEMS Yeast Research)4:655_664;比尔（Beall)等人，1991，通过重组大肠杆菌从木糖和其他糖产 生乙酉享的参数石开究（Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli)，生物技术与生物工程（Biotech. Bioeng. )38:296-303 ;英格拉姆（Ingram)等人，1998,用于乙醇产生的细菌的代谢工 程化（Metabolic engineering of bacteria for ethanol production)，生物技术与 生物工程58:204-214;张（Zhang)等人，1995,产生乙醇的运动发酵单胞菌中戊糖代谢 途径的代谢工程化（Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis)，科学（Science)267:240_243;狄安妲（Deanda)等 人，1996,通过代谢途径工程化开发发酵阿拉伯糖的运动发酵单胞菌菌株（Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering)，应用与环境微生物学62:4465-4470 ;W0 2003/062430,木糖异构酶）。
[0124] 在一方面，遗传修饰的发酵生物体是酿酒酵母。在另一方面，遗传修饰的发酵生物 体是运动发酵单胞菌。在另一方面，遗传修饰的发酵生物体是大肠杆菌。在另一方面，遗传 修饰的发酵生物体是产酸克雷伯氏菌。在另一方面，遗传修饰的发酵生物体是克鲁维酵母 属。
[0125] 本领域中熟知的是，以上所描述的生物体还可以用于产生其他物质，如在此所描 述。
[0126] 典型地向降解的纤维素材料或水解物中添加发酵生物体，并且进行发酵持续约8 至约96小时，例如约24至约60小时。温度典型地在约26°C至约60°C之间，具体地约32°C 或50°C，并且在约pH 3至约pH 8,例如pH 4至5、6、或7左右。
[0127] 在一方面，可以对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种生物体，并且进行发 酵持续约12小时至约96小时，例如24至60小时。在一方面，温度在约20°C至约60°C之间， 例如约25°C至约50°C、约32°C至约50°C，并且pH通常是从约pH 3至约pH 7,例如pH 4-7 左右，例如约pH 5。然而，一些发酵生物体（例如细菌）具有更高的最适发酵温度。酵母或 另一种微生物优选以每mL发酵液约105至10 12,例如从约107至101(1，特别是约2 X 108个活 细胞计数的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指南可以见于例如"醇教材"（"The Alcohol Textbook"）（Κ·雅克（Κ· Jacques)、Τ·Ρ·里昂（T.P. Lyons)以及 D.R.凯尔索 尔（D.R.Kelsall)编辑，诺丁汉大学出版社（Nottingham University Press),联合王国 (United Kingdom) 1999)，其通过引用结合在此。
[0128] 对于乙醇生产，在发酵之后，可蒸馏发酵的浆料以萃取乙醇。根据本发明的工艺获 得的乙醇可用作例如燃料乙醇、饮用乙醇，即可饮用的酒精，或工业乙醇。
[0129] 发酵刺激剂
[0130] 发酵刺激剂可以用在在此所描述的过程中，以进一步改进发酵，并且特别是改进 发酵生物体的性能，例如速率增加和产物产率（例如乙醇产率）。"发酵刺激剂"是指用于 发酵生物体（特别是酵母）生长的刺激剂。用于生长的优选发酵刺激剂包括维生素和矿 物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇、硫胺、吡哆醇、对 氨基苯酸、叶酸、核黄素、以及维生素 A、B、C、D和E，例如参见阿尔弗雷多（Alfenore)等 人，通过在进料分批方法过程中的一种维生素进料策略改进乙醇产生和酿酒酵母的存活 力(Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisia by a vitamin feeding strategy during fed-batch process)，施普林格（2002)，其特此通过引 用结合。矿物质的实例包括可以提供含？、1(、1%、5、0&、？ 6、211^11以及(：11的营养素的矿物 质和矿物盐。
[0131] 发酵产物
[0132] 根据本发明，（所希望的）发酵产物可以是由发酵得到的任何物质。该发酵产 物可以是（不限制于）一种醇（例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、丙三醇（glycerol)、甲醇、 1，3-丙二醇、山梨醇、以及木糖醇）；一种有机酸（例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠 檬酸、2, 5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟 基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、丁二酸、以及木糖酸）；一种 酮（例如，丙酮）；一种氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨 酸）；一种烷烃（例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷）；一种环烷 烃（例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷）；一种烯烃（例如，戊烯、己烯、庚烯、以及 辛烯）；以及一种气体（例如，甲烷、氢气（H 2)、二氧化碳（C02)、以及一氧化碳（C0))。发酵 产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
[0133] 在一方面，发酵产物是一种醇。应理解的是，术语"醇"涵盖包括一个或多个羟基 部分的物质。在一方面，该醇是阿拉伯糖醇。在另一方面，该醇是丁醇。在另一方面，该醇 是乙醇。在另一方面，该醇是甘油。在另一方面，该醇是甲醇。在另一方面，该醇是1，3-丙 二醇。在另一方面，该醇是山梨糖醇。在另一方面，该醇是木糖醇。参见，例如，贡*C. S.、卡奥· N. J.、杜· J.、以及曹· G.T.，1999,由可再生资源生产乙醇，生物化学工程/生 物技术的进展，舍佩尔· T.编辑，施普林格，德国海德堡柏林，65:207-241 ;西尔韦拉· M. (Silveira, M.)和乔纳斯（Jonas)，2002,山梨糖醇的生物技术生产（The biotechnological production of sorbitol)，应用微生物学与生物技术59:400-408 ;尼加姆（Nigam) 和辛格（Singh), 1995,用于木糖醇-一种糖替代品的发酵产生工艺（Processes for fermentative production of xylitol - a sugar substitute),力口工生物化学（Process Biochemistry) 30 (2) : 117-124 ;伊泽吉（Ezeji)等人，2003,通过拜季林斯基羧菌 BA101 生产丙酮、丁醇和乙醇并且通过气提原位回收（Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BAlOland in situ recovery by gas stripping),微生物与生物技术世界杂志（World Journal of Microbiology and Biotechnology)19(6):595-603。
[0134] 在另一方面，发酵产物是有机酸。在一方面，该有机酸是乙酸。在另一方面，该有机 酸是醋酮酸。在另一方面，该有机酸是己二酸。在另一方面，该有机酸是抗坏血酸。在另一 方面，该有机酸是朽 1檬酸。在另一方面，该有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一方面，该 有机酸是甲酸。在另一方面，该有机酸是富马酸。在另一方面，该有机酸是葡糖二酸。在另 一方面，该有机酸是葡糖酸。在另一方面，该有机酸是葡糖醛酸。在另一方面，该有机酸是戊 二酸。在另一方面，该有机酸是3-二轻基丙酸。在另一方面，该有机酸是衣康酸。在另一 方面，该有机酸是乳酸。在另一方面，该有机酸是苹果酸。在另一方面，该有机酸是丙二酸。 在另一方面，该有机酸是草酸。在另一方面，该有机酸是丙酸。在另一方面，该有机酸是琥拍 酸。在另一方面，该有机酸是木糖酸。参见例如陈（Chen)和李（Lee)，1997,用于从纤维素 生物质生产乳酸的膜介导的萃取发酵（Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass)应用生物化学与生物技术（Appl. Biochem. Biotechnol.),63-65:435-448〇
[0135] 在另一方面，发酵产物是一种酮。应理解的是，术语"酮"涵盖包括一个或多个酮 部分的物质。在另一方面，该酮是丙酮。参见，例如，库雷希和布拉舍克，2003,见上文。
[0136] 在另一方面，发酵产物是一种氨基酸。在一方面，该氨基酸是天冬氨酸。在另一 方面，该氨基酸是谷氨酸。在另一方面，该氨基酸是甘氨酸。在另一方面，该氨基酸是赖氨 酸。在另一方面，该氨基酸是丝氨酸。在另一方面，该氨基酸是苏氨酸。参见例如理查德 (Richard)和马加里蒂（Margaritis)，2004,用于聚（谷氨酸）生产和其他微生物生物聚合 物的分批发酵动力学的实验建模（Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly (glutamic acid) production and other microbial biopolymers),生物技术和 生物工程（Biotechnology and Bioengineering)87(4) :501_515。
[0137] 在另一方面，发酵产物是一种烷烃。该烷烃可以是非支链或支链烷烃。在一个方 面，该烧煙是戊烧。在另一方面，该烧煙是己烧。在另一方面，该烧煙是庚烧。在另一方面， 该烷烃是辛烷。在另一方面，该烷烃是壬烷。在另一方面，该烷烃是癸烷。在另一方面，该 烷烃是十一烷。在另一方面，该烷烃是十二烷。
[0138] 在另一方面，发酵产物是一种环烷烃。在一个方面，该环烷烃是环戊烷。在另一方 面，该环烷烃是环己烷。在另一方面，该环烷烃是环庚烷。在另一方面，该环烷烃是环辛烷。
[0139] 在另一方面，发酵产物是一种烯烃。该烯烃可以是非支链或支链烯烃。在一个方 面，该烯烃是戊烯。在另一方面，该烯烃是己烯。在另一方面，该烯烃是庚烯。在另一方面， 该烯烃是辛烯。
[0140] 在一个方面，发酵产物是异戊二烯。在另一方面，发酵产物是聚酮化合物。
[0141] 在另一方面，发酵产物是一种气体。在一个方面，该气体是甲烷。在另一方面，该气 体是H 2。在另一方面，该气体是C02。在另一方面，该气体是C0。参见例如片R (Kataoka) 等人，关于通过产氢气厌氧细菌的连续培养系统的氢气生产的研究（Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria)，水科学与技术（Water Science and Technology) 36 (6-7) :41-47 ;以及古那森 兰（Gunaseelan)，1997,生物质与生物能源（Biomass and Bioenergy) 13，（1-2):83-114, 用于甲烧生产的厌氧消化：一篇综述（Anaerobic digestion of biomass for methane production:A review)。
[0142] 通並：
[0143] 可以使用本领域已知的任何方法，任选地在发酵之后回收发酵产物，这些方法包 括但不限于：色谱法、电泳程序、差别溶解度、蒸馏、或萃取。例如，通过常规蒸馏方法从发 酵的甘蔗废物中分离和纯化醇。例如，可以获得纯度高达约96体积％的乙醇，其可以用作 (例如）燃料乙醇、饮用乙醇，即，饮用中性酒、或工业乙醇。
[0144] 酶
[0145] 以下部分说明了可以根据本发明的方法和工艺使用的多肽和酶。
[0146] 苯酚氧化酶
[0147] 根据本发明用于预调节的苯酚氧化酶可以是任何苯酚氧化酶。该苯酚氧化酶可以 是任何起源的，但优选真菌或细菌起源的。
[0148] 这一种或多种苯酚氧化酶可属于以下EC类中的任一种，该EC类包括：虫漆酶（EC 1. 10. 3. 2)、儿茶酚氧化酶（EC 1. 10. 3. 1)、0-氨基苯酚氧化酶（1. 10. 3. 4)、以及单酚单加 氧酶（1. 14. 18. 1)。虫漆酶是优选的。
[0149] 虫漆酶
[0150] 虫漆酶（EC 1. 10. 3. 2.)是含多拷贝的酶，该酶催化酚类化合物的氧化。虫漆酶是 由植物、细菌以及广泛多样的真菌产生，这些真菌包括子囊菌纲，例如曲霉属、脉孢菌属、以 及柄孢壳菌属；半知菌纲，包括葡萄孢属；以及担子菌纲，例如金钱菌属、层孔菌属、香菇属、 侧耳属、栓菌属、以及完全形式的丝核菌属。已经分离了多种真菌虫漆酶。例如，崔（Choi) 等人（分子植物 -微生物相互作用（Mol. Plant-Microbe Interactions) 5:119-128, 1992) 说明了板栗疫病真菌栗疫病菌（Cryphonectria parasitica)的编码虫漆酶的基因的分子 特性和克隆。小岛（Kojima)等人（生物化学杂志（J. Biol. Chem.) 265:15224-15230, 1990 ; JP 2-238885)提供了白腐担子菌毛革盖菌的两种等位基因形式的虫漆酶。杰曼（Germann) 和勒奇（Lerch)(经验（Experientia) 41:801，1985 ;PNAS USA 83:8854-8858, 1986)已报道 了粗糙脉孢菌虫漆酶基因的克隆和部分测序。萨洛黑莫（Saloheimo)等人（应用微生物学 杂志（J. Gen. Microbiol.) 137:1537-1544,1985 ;W0 92/01046)已披露来自真菌射脉菌的 虫漆酶基因的结构分析。
[0151] 尤其考虑到的虫漆酶包括源自于以下的一种菌株的那些：多孔菌属，优选 匹斯特斯多孔菌（Polyporus pinsitus);白丝菌属（Melanocarpus)，优选热白丝菌 (Melanocarpus albomyces);蚀丝霉属，优选嗜热丝霉（Myceliophtora thermophila);鬼 伞属，优选灰盖鬼伞；丝核菌属，优选立枯丝核菌或草地丝核菌（Rhizoctonia praticola); 革节孢属，优选嗜热革节孢（Scytalidium thermophilum);梨孢属，优选稻梨孢。
[0152] 在一个实施例中，该虫漆酶源自于漆树（吉田（Yoshida)，1883,漆的化学 (Chemistry of Lacquer(Urushi))第 1 部分·化学学会会刊（J. Chem. Soc.)43472_486。
[0153] 在另一个实施例中，该虫漆酶源自于匹斯特斯多孔菌，例如W0 96/00290(诺维信 (Novozymes))中所述的一种。
[0154] 强森（J0nss〇n )等人，1998,应用微生物学和生物技术如？1.]^(^〇1^〇1· Biotechnol.) 49, 691-697也披露了一种源自于云芝的适合的虫漆酶。
[0155] 其他虫漆酶包括例如穆拉利克里希纳（Muralikrishna)等人，1995,应用与环境 微生物学（Appl. Environ. Microbiol.) 61 (12)4374-4377)中关注的源自于稻梨孢的虫漆 酶，或披露于美国化学学会论文第209卷，第1-2期，1995的摘要中的源自于嗜热革节孢的 虫漆酶。
[0156] 该虫漆酶还可以源自于灰盖鬼伞，例如施耐德（Schneider)等人，1999,酶与微生 物技术（Enzyme and Microbial Technology) 25:502-508 中关注的一种。
[0157] 其他适合的虫漆酶包括在威尔伊司内尔（Waleithner)等人，1996,当代遗传学 (Curr. Genet.) 29 :395-403中关注的源自于立枯丝核菌的、或纪斯基内恩（Kiiskinen)等 人，2004,微生物学（Microbiology) 150:3065-3074中关注的源自于热白丝菌的那些。
[0158] 适合的细菌虫漆酶包括源自于天蓝色链霉菌的那些，例如由马赫印斯基 (Machczynski)等人，2004,蛋白质科学（Protein Science) 13:2388-2397 披露的。
[0159] 在一个优选实施例中，该虫漆酶源自于嗜热毁丝霉，例如在WO 95/33836(诺维 信）中作为SEQ ID N0:2或此处作为SEQ ID N0:12描述的一种。
[0160] 考虑到的虫漆酶还包括含与W0 95/33836中的SEQ ID N0:2或此处SEQ ID N0:12 中披露的嗜热毁丝霉虫漆酶或以上提到的虫漆酶中的任一种的成熟部分具有至少60%、至 少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 % -致性，至少97 %、至少98 %、至少99 % 一致性的氨基酸序列的那些。
[0161] 半纤维素酶
[0162] 用在本发明的方法或工艺中的半纤维素酶可以是任何半纤维素酶。该半纤维素酶 可以是任何起源的，但优选真菌或细菌起源的。
[0163] 术语"半纤维素酶"或"半纤维素分解酶"意指一种或多种（若干种）水解 半纤维素材料的酶。参见例如沙勒姆（Shal lom)和肖汉姆（Shoham)，2003，微生物 半纤维素酶（Microbial hemicellulases).医学病毒学评论（Current Opinion In Microbiology)6(3) :219-228中所述的。半纤维素酶是在植物生物质的降解中的关键 组分。半纤维素酶的实例包括但不限于：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚 糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖 醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。半纤维素酶的催化模块 是水解糖苷键的糖苷水解酶（GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键的碳水化合物酯酶 (CE)。这些催化模块基于它们一级序列的同源性，可以被分配到通过数字标记的GH和CE 家族中。具有总体相似的折叠的一些家族可以进一步被分组为以字母标记的氏族（例 如，GH-A)。这些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分类可在碳水化合物 活性酶（Carbohydrate-Active Enzymes) (CAZy)数据库中获得。可以根据高斯和比萨拉 (Bisaria)，1987,纯粹与应用化学（Pure&AppI. Chem. ) 59:1739-1752测量半纤维素分解酶 活性。
[0164] 木聚糖酶
[0165] 在一个优选实施例中，该半纤维素酶是一种"木聚糖酶"。术语"木聚糖酶"意指 1，4-β-D-木聚糖-木糖水解酶（E. C. 3. 2. 1. 8)，其催化木聚糖中的1，4-β-D-木糖苷键的 内切水解。出于本发明的目的，在37°C下在0. 01% TRITON? Χ-100和200mM磷酸钠缓 冲液（pH 6)中用0.2% AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来测定木聚糖酶活性。一个单 位的木聚糖酶活性定义为在37°C、pH 6下在200mM磷酸钠 （pH 6)缓冲液中从作为底物的 0. 2 % AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1. 0 μ摩尔天青蛋白。
[0166] 特别考虑到的木聚糖酶的实例包括GH10木聚糖酶，例如源自于曲霉属的菌株的 一种GH10木聚糖酶，例如来自烟曲霉的菌株的，例如在W02006/078256中披露为Xyl III 或此处为SEQ ID N0:8的，或来自棘孢曲霉的菌株的，例如在W0 94/21785中披露为SEQ ID NO: 5 (Xyl II)或此处为 SEQ ID NO:6 的。
[0167] 根据本发明用于预调节的木聚糖酶可包括在一种纤维素分解酶制剂（其进一步 包括一种木聚糖酶）中。在一个实施例中，半纤维素酶是一种纤维素分解酶制剂，该制剂进 一步包括一种木聚糖酶，优选一种GH10木聚糖酶，例如源自于曲霉属的菌株的一种GH10木 聚糖酶，例如来自烟曲霉的菌株的，例如在W0 2006/078256中披露为Xyl III或此处为SEQ ID N0:8的，或来自棘孢曲霉的菌株的，例如在W0 94/21785中披露为SEQ ID N0:5(Xyl II) 或此处为SEQ ID NO:6的。
[0168] 考虑到的木聚糖酶还包括含与WO 2006/078256中的烟曲霉Xyl III或此处的SEQ ID N0:8、或W0 94/21785 中披露为 SEQ ID N0:5(Xyl II)或此处为 SEQ ID N0:6 的棘孢曲 霉木聚糖酶具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95% -致性， 至少97%、至少98%、至少99% -致性的氨基酸序列的那些。
[0169] β-木糖苷酶
[0170] 在一个优选实施例中，用在本发明的方法或工艺中的半纤维素酶是一种" β -木 糖苷酶"。术语" β -木糖苷酶"意指一种β -D-木糖苷木糖水解酶（E. C. 3. 2. 1. 37)，其催 化短β (1 - 4)-木寡糖的外水解，以从非还原性末端去除连续的D-木糖残基。出于本发 明的目的，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40°C、pH 5下在含有0.01% TWEEN? 20 的100mM柠檬酸钠中从作为底物的ImM对硝基苯基-β -D-木糖苷每分钟产生1. 0微摩尔 的对硝基苯酚阴离子。
[0171] 特别考虑到的木糖苷酶的实例包括源自于曲霉属的菌株的一种木糖苷 酶，例如烟曲霉的菌株，例如在共同未决的美国临时#61/526833或W02013/028928 (实例16 和17)中披露的，或源自于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株，例如在W0 2011/057140中 为SEQ ID Ν0:58及此处为SEQ ID NO: 1的成熟多肽。
[0172] 在预调节期间使用的木糖苷酶可包括在一种纤维素分解酶制剂中。在一个 实施例中，该半纤维素酶是一种纤维素分解酶制剂，该制剂进一步包括一种β -木糖苷 酶，例如源自于曲霉属的菌株的一种β-木糖苷酶，例如烟曲霉的菌株（例如披露于W0 2011/057140中的一种），例如在共同未决的美国临时#61/526833或W0 2013/028928(实 例16和17)中披露的，或源自于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株，例如在W0 2011/057140 中 SEQ ID N0:58 的成熟多肽。
[0173] 考虑到的β-木糖苷酶还包括含与W0 2011/057140中披露为SEQ ID N0:206的 烟曲霉β-木糖苷酶或此处提到的β-木糖苷酶中的任一种（例如此处的SEQ ID N0:9) 具有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 % -致性，至少97 %、至 少98%、至少99% -致性的氨基酸序列的那些。
[0174] 用于预调节的半纤维素酶是或可包括一种商业半纤维素酶产品。商业半纤 维素酶产品的实例包括：例如SHEARZYME? (诺维信A/S)、CELLICTMHTec (诺维信A/S)、 CELLICTMHTec2 (诺维信 A/S)、CELLICTMHTec3 (诺维信 A/S)、VISCOZYME? (诺维信 A/ s)、ULTRAFLO? (诺维信 A/s)、PULPZYME? HC(诺维信 A/s)、MULTIFECT? 木聚糖酶（杰能科）、ECOPULP? ΤΧ-200Α(ΑΒ 酶（AB Enzymes))、HSP 6000 木聚糖酶 (帝斯曼（DSM))、DEP0L?333P(生物催化剂有限公司（Biocatalysts Limit)，英国威尔士 (Wales, UK))、DEP0L?740L(生物催化剂有限公司，英国威尔士）以及DEP0L?762P (生物催 化剂有限公司，英国威尔士）。
[0175] 纤维素分解酶制剂
[0176] 纤维素分解酶制剂是包括水解纤维素材料的一种或多种（例如若干种）酶的一种 制剂。此类酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β_葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤 维素分解活性的两种基本方法包括：（1)测量总纤维素分解活性，并且（2)测量单独的纤维 素分解活性（内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶），如在张（Zhang)等人， 纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略（Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies)，2006,生物技术进展（Biotechnology Advances) 24:452-481 中所综述的。总纤维素分解活性通常使用不溶性底物来测量，这些底物包括瓦特曼 (Whatman) 1号滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等 等。最常见的总纤维素分解活性测定是使用瓦特曼1号滤纸作为底物的滤纸测定。该 测定是由国际纯粹与应用化学联合会（International Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC))(高斯（Ghose)，1987，纤维素酶活性的测量（Measurement of cellulase activities)，纯粹与应用化学（Pure Appl.Chem. )59:257-68)确立的。
[0177] 出于本发明的目的，通过测量在以下条件下由一种或多种纤维素分解酶进行的纤 维素材料水解的增加来确定例如针对一种纤维素分解酶制剂的纤维素分解酶活性 ：l_5〇mg 的纤维素分解酶蛋白/g于PCS中的纤维素（或其他预处理的纤维素材料），在适合的温度 (例如501：、551：、601：、或65°〇下持续3-7天，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解 相比。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸钠 （pH 5)， ImM MnS04,50°C、55°C、60°C、或 65°C，72 小时，通过AMINEX? HPX-87H 柱（伯乐实验室 有限公司，美国加州赫拉克勒斯）进行的糖分析。
[0178] 如以上所述的在本发明的一种工艺中用于糖化（水解）的一种纤维素分解酶制剂 典型地包括一种或多种内切葡聚糖酶、纤维素生物质水解酶（cellubiohydrolase)和/或 β-葡糖苷酶。
[0179] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂源自于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌 株；腐质霉属的菌株，例如特异腐质霉的菌株，和/或金孢子菌属的菌株，例如拉克淖金孢 子菌（Chrysosporium lucknowense)的菌株。在一个优选实施例中，该纤维素分解酶制剂 源自于里氏木霉的菌株。
[0180] 该纤维素分解酶制剂可进一步包括以下多肽（例如酶）中的一种或多种：具有纤 维素分解增强活性的GH61多肽、β -葡糖苷酶、木聚糖酶、β -木糖苷酶、CBHI、CBHII，或其 两种、三种、四种、五种或六种的混合物。
[0181] 该另外的一种或多种多肽（例如GH61多肽）和/或一种或多种酶（例如β -葡 糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、CBH I和/或CBH II)对于该纤维素分解酶制剂生产生物 体（例如里氏木霉）可以是外来的。
[0182] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61 多肽和一种β-葡糖苷酶。
[0183] 在另一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种具有纤维素分解增强活性的 GH61多肽、一种β -葡糖苷酶、以及一种CBHI。
[0184] 在另一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种具有纤维素分解增强活性的 GH61多肽、一种β -葡糖苷酶、一种CBHI以及一种CBHII。
[0185] β-葡糖苷酶
[0186] 术语"β-葡糖苷酶"意指一种β-D-葡糖苷葡糖水解酶（E.C. 3. 2. 1.21)，其催 化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。出于本发明的目的， 根据文丘里（Venturi)等人，2002,来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-D-葡糖苷酶：产 生、纯化以及一些生物化学特性（Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum:production, purification and some biochemical properties),基础微生物学杂志（J. Basic Microbiol. )42:55-66的基本程序确定β-葡 糖苷酶活性。一个单位的β -葡糖苷酶定义为在25°C、pH 4. 8下，在含有0. 01%TWEEN? 20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的ImM对硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1. 0 微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
[0187] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂可包括一种或多种（例如若干种）葡 糖苷酶。在一个实施例中，该β_葡糖苷酶可以是源自于曲霉属（例如米曲霉）的菌株 的一种β-葡糖苷酶，例如W0 2002/095014中披露的一种或具有β-葡糖苷酶活性的披 露于W0 2008/057637中的融合蛋白，或源自于烟曲霉，例如披露于W0 2005/047499中 的一种或一种烟曲霉β -葡糖苷酶变体，例如共同未决的美国临时申请#61/388, 997或 W02012/044915(通过引用结合在此）中披露的一种，例如具有以下取代中的一个或多个 (优选全部）：F100D、S283G、N456E、F512Y。
[0188] 在另一个实施例中，该β-葡糖苷酶源自于青霉属的菌株，例如披露于TO 2007/019442中的巴西青霉（Penicillium brasilianum)的菌株，或木霉属的菌株，例如里 氏木霉的菌株。
[0189] 考虑到的β -葡糖苷酶包括含与W0 2002/095014中披露的米曲霉或 W02008/057637中披露的具有β -葡糖苷酶活性的融合蛋白具有至少60 %、至少70 %、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%-致性，至少97%、至少98%、至少99%-致性的氨 基酸序列的那些。
[0190] 考虑到的β-葡糖苷酶还包括含与W0 2005/047499中披露为SEQ ID Ν0:2的氨基 酸20至863(通过引用结合在此）或此处为SEQ ID NO: 5的烟曲霉β-葡糖苷酶或以上提 到的β -葡糖苷酶中的任一种具有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、 至少95%-致性，至少97%、至少98%、至少99% -致性的氨基酸序列的那些。
[0191] 具有纤维素分解增强活性的多肽
[0192] 术语"具有纤维素分解增强活性的多肽"意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤 维素材料的水解的增强的GH61多肽。
[0193] 出于本发明的目的，通过测量在以下条件下来自由纤维素分解酶水解纤维素材 料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性：l-50mg 总蛋白/g在PCS中的纤维素，其中总蛋白包括50-99. 5 % w/w的纤维素分解酶蛋白和 0. 5-50% w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白，在合适的温度（例如50°C、 55°C或60°C)下，持续1-7天，与不具有纤维素分解增强活性的相等总蛋白装载的对照水解 (l-50mg纤维素分解蛋白/g在PCS中的纤维素）相比较。在一个优选方面，使用在总蛋白 质重量的2%-3%的米曲霉β-葡糖苷酶（根据W0 02/095014在米曲霉中重组产生）或 总蛋白质重量的2%-3%的烟曲霉β-葡糖苷酶（如W0 2002/095014中所描述在米曲霉 中重组产生）的纤维素酶蛋白负载量存在的情况下CELLUCLAST? 1. 5L (诺维信A/S)， 丹麦巴格斯瓦尔德（Bagsvaerd，Denmark))的混合物作为纤维素分解活性的来源。
[0194] 术语"家族 61 的糖苷水解酶（Family 61Glycoside Hydrolase) " 或"家族 GH61" 或"GH61"是指属于根据HenriSSat，1991，"基于氨基酸序列的相似之的糖基水解酶的分 类"，生物化学期刊（Biochem. J.) 280 :309_316,以及 Henrissat 和 Bairoch，1996, "基于序 列的糖基水解酶的分类的更新"，生物化学期刊（Biochem. J.) 316 :695-696的糖苷水解酶 家族61的一种多肽。基于在一个家族成员中的极弱的内切l，4-i3-D-葡聚糖酶的活性的 测定，这个家族中的酶最初被分类为是一种糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式必 定是不规范的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于它们在与一种纤维素分解酶 结合使用时增强纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
[0195] 具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维 素分解酶的量降低优选至少1. 01倍、更优选至少1. 05倍、更优选至少1. 10倍、更优选至少 1. 25倍、更优选至少1. 5倍、更优选至少2倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至 少5倍、甚至更优选至少10倍、以及最优选至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶 催化的纤维素材料的水解。
[0196] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂可包括一种或多种具有纤维素分解增强 活性的GH61多肽。在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种具有纤维素分解增强 活性的GH61多肽，例如源自于嗜热子嚢菌属的，例如橙色嗜热子囊菌的菌株，例如在W0 2005/074656描述为SEQ ID N0:2,或此处为SEQ ID N0:4的；或源自于梭孢壳菌属的，例如 太瑞斯梭孢壳霉的菌株，例如在W0 2005/074647描述为SEQ ID N0:8、和在此处为SEQ ID N0:2的；或源自于曲霉属的菌株的，例如烟曲霉的菌株，例如在W0 2010/138754描述为SEQ ID N0:2、或在此处为SEQ ID N0:3的；或源自于源于青霉属的菌株的，例如埃默森青霉菌的 菌株，例如W0 2011/041397中披露的或此处的SEQ ID N0:7的。
[0197] 考虑到的GH61多肽还包括含与W0 2005/074656中披露为SEQ ID NO: 2或此处为 SEQ ID N0:4的橙色嗜热子囊菌GH61多肽、W0 2005/074647中披露为SEQ ID N0:8并且此 处为SEQ ID NO: 2的太瑞斯梭孢壳霉GH61多肽、或W0 2011/041397或此处SEQ ID NO: 7中 披露的埃默森青霉菌GH61多肽具有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、 至少95%-致性，至少97%、至少98%、至少99%-致性的氨基酸序列的那些（所有参考 文献通过引用结合在此）。
[0198] 纤维二糖水解酶
[0199] 术语"纤维二糖水解酶"意指一种1，4_β -D-葡聚糖纤维二糖水解酶 (E. C. 3. 2. 1. 91)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含有β -1，4-连接葡萄糖的聚合物 中的1，4-β -D-糖苷键的水解，从而从链的还原性或非还原性末端释放纤维二糖（泰 里（Teeri)，1997,结晶纤维素降解：对纤维二糖水解酶的功能的新认识（Crystalline cellulose degradation:New insight into the function of cellobiohydrolases),生 物技术趋势（Trends in Biotechnology)15:160_167;泰里等人，1998,里氏木霉纤维二糖 水解酶：对结晶纤维素为何如此有效？（Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose ?)，生物化学学会会刊（Biochem. Soc. Trans. )26:173-178)。根据里弗（Lever)等人，1972,分析生物化学（Anal. Biochem. )47:273-279 ;范·帝伯赫（van Tilbeurgh)等人，1982,欧洲生化学会联合会快 报（FEBS Letters)，149:152-156 ;范?帝伯赫和克莱森斯（Claeyssens)，1985,欧洲生化 学会联合会快报，187:283-288;以及汤美（Tomme)等人，1988,欧洲生物化学杂志（Eur. J. Biochem.) 170:575-581所描述的程序来测定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，汤美等 人的方法可以用于测定纤维二糖水解酶活性。
[0200] CBH I
[0201] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂可包括一种或多种CBH I (纤维二糖水解酶 I)。在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种纤维二糖水解酶I (CBH I)，例如源自于 曲霉属的菌株的一种纤维二糖水解酶I，例如烟曲霉的菌株，例如在W0 2011/057140中披 露为SEQ ID N0:2的Cel7A CBHI，或源自于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。
[0202] 考虑到的CBH I酶还包括含与在WO 2011/057140(通过引用结合在此）中被披露 为SEQ ID N0:2或此处为SEQ ID N0:10的来自烟曲霉的Cel7A CBH I具有至少60%、至少 70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 % -致性，至少97 %、至少98 %、至少99 % - 致性的氨基酸序列的那些。
[0203] CBH II
[0204] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂可包括一种或多种CBH II (纤维二糖水解 酶II)。在一个实施例中，该纤维二糖水解酶II (CBHII)，例如源自于曲霉属的菌株的一种 纤维二糖水解酶Π ，例如烟曲霉的菌株；或木霉属的菌株，例如里氏木霉，或梭孢壳菌属的 菌株，例如太瑞斯梭孢壳霉的菌株，例如来自太瑞斯梭孢壳霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
[0205] 考虑到的CBH II酶还包括含与源自于共同未决的美国临时#61/526833或TO 2013/028928(通过引用结合在此）中披露的或此处的SEQ ID N0:11的烟曲霉的CBH II具 有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 % -致性，至少97 %、至少 98%、至少99% -致性的氨基酸序列的那些。
[0206] 内切葡聚糖酶
[0207] 术语"内切葡聚糖酶"意指一种内切-1，4- (1，3 ; 1，4) - β -D-葡聚糖4-葡聚糖水 解酶（E. C. 3. 2. 1. 4)，其催化纤维素、纤维素衍生物（如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素）、 地衣多糖中的1，4- β -D-糖苷键和混合的β -1，3葡聚糖如谷类β -D-葡聚糖或木葡聚糖 以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β_1，4键的内切水解。可以通过测量底物粘度 的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性（张等人， 2006,生物技术进展24:452-481)。为了本发明的目的，使用羧甲基纤维素（CMC)作为底物， 根据在Ghose，1987,纯粹与应用化学（Pure and Appl. Chem.) 59 :257-268中所述的过程， 在pH 5、40°C下，确定内切葡聚糖酶的活性。
[0208] 如以上提到的，该纤维素分解酶制剂可包括多种不同的多肽，包括酶。
[0209] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种里氏木霉纤维分解制剂，其进一 步包括披露于此处的SEQ ID N0:4中的具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A 多肽（W0 2005/074656)、以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白（W0 2008/057637)。
[0210] 在另一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种里氏木霉纤维素分解酶制剂， 其进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽（W0 2005/074656中 的SEQ ID Ν0:2或此处的SEQ ID Ν0:4)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶（W0 2005/047499的SEQ ID N0:2)或此处的 SEQ ID N0:5。
[0211] 在另一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种里氏木霉纤维素分解酶制 齐U，其进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽（披露于TO 2011/041397或此处的SEQ ID N0:7)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶（TO 2005/047499的SEQ ID N0:2)或此处的 SEQ ID N0:5。
[0212] 在另一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种里氏木霉纤维素分解酶制 齐U，其进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽（披露于TO 2011/041397或此处的SEQ ID NO:7)，以及烟曲霉β-葡糖苷酶变体（披露于共同未决的美 国临时申请#61/388, 997或W0 2012/044915 (通过引用结合在此），具有以下取代：F100D、 S283G、N456E、F512Y(使用此处的 SEQ ID N0:5 用于编号））。
[0213] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂还包括一种木聚糖酶（例如源自于棘孢曲 霉或烟曲霉）和/或一种β-木糖苷酶（例如源自于烟曲霉）。
[0214] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种里氏木霉纤维分解制剂，其进一 步包括披露于的SEQ ID Ν0:4中的具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽 (W0 2005/074656)、米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白（W0 2008/057637)、以及棘孢曲霉木聚 糖酶（W0 94/21785 中的 Xyl II 或此处 SEQ ID Ν0:6)。
[0215] 在另一个实施例中，该纤维素分解制剂包括一种里氏木霉纤维素分解酶制剂，其 进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽（W0 2005/074656中 的 SEQ ID Ν0:2 或此处的 SEQ ID Ν0:4)、烟曲霉 β-葡糖苷酶（W0 2005/047499 的 SEQ ID N0:2或此处的SEQ ID N0:5)以及棘孢曲霉木聚糖酶（W0 94/21785中披露的Xyl II或此 处的 SEQ ID N0:6)。
[0216] 在另一个实施例中，该纤维素分解制剂包括一种里氏木霉纤维素分解酶制剂，其 进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽（W0 2005/074656中 的 SEQ ID N0:2 或此处的 SEQ ID N0:4)、烟曲霉 β-葡糖苷酶（W0 2005/047499 的 SEQ ID NO:2或此处的SEQ ID NO:5)以及棘孢曲霉木聚糖酶（W0 94/21785中披露的Xyl II或此 处的 SEQ ID N0:6)。
[0217] 在另一个实施例中，该纤维素分解制剂包括一种里氏木霉纤维素分解酶制剂，其 进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽（W0 2011/041397或此处 的SEQ ID N0:7中披露的）、烟曲霉β-葡糖苷酶（W0 2005/047499的SEQ ID N0:2或此 处的SEQ ID N0:5)以及烟曲霉木聚糖酶（W0 2006/078256中的Xyl III或此处的SEQ ID NO:8)〇
[0218] 在另一个实施例中，该纤维素分解制剂包括一种里氏木霉纤维素分解酶制剂，其 进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽（W0 2011/041397或此处 的SEQ ID Ν0:7中披露的）、烟曲霉β-葡糖苷酶（W0 2005/047499的SEQ ID Ν0:2或此处 的SEQ ID N0:5)、烟曲霉木聚糖酶（W0 2006/078256中的Xyl III或此处的SEQ ID N0:8)、 以及Cel7A CBH I(来自烟曲霉，在W0 2011/057140中被披露为SEQ ID N0:2或此处为SEQ ID NO:10)。
[0219] 在另一个实施例中，该纤维素分解制剂包括一种里氏木霉纤维素分解酶制剂，其 进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽（W0 2011/041397或此 处的SEQ ID NO: 7中披露的）、烟曲霉β-葡糖苷酶（WO 2005/047499的SEQ ID NO: 2或 此处的SEQ ID N0:5)、烟曲霉木聚糖酶（WO 2006/078256中的Xyl III或此处的SEQ ID N0:8)、Cel7A CBH I (来自烟曲霉，在WO 2011/057140中被披露为SEQ ID N0:2或此处为 SEQ ID NO:10)、以及CBH II (源自于烟曲霉，披露于共同未决的美国临时#61/526833或TO 2013/028928 的或此处的 SEQ ID NO: 11)。
[0220] 在另一个实施例中，该纤维素分解制剂包括一种里氏木霉纤维素分解酶制剂，其 进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽（W0 2011/041397中披 露的或此处的SEQ ID N0:7)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体（披露于共同未决的美国临时申 请#61/388, 997或W0 2012/044915(通过引用结合在此），具有以下取代：F100D、S283G、 N456E、F512Y(使用此处的SEQ ID N0:5用于编号））、烟曲霉木聚糖酶（W0 2006/078256中 的Xyl III或此处的SEQ ID N0:8)、Cel7A CBH 1(来自于烟曲霉，在TO2011/057140中披 露为SEQIDN0:2或此处为SEQIDN0 :10)、以及CBHII(源自于烟曲霉，披露于共同未决 的美国临时 #61/526833 或 W0 2013/028928 的或此处的 SEQ ID N0:11)。
[0221] 也考虑到披露于共同未决的美国临时#61/526833或W0 2013/028928的所有纤维 素分解酶制剂并通过引用结合在此。
[0222] 该纤维素分解酶制剂包括或可进一步包括选自下组的一种或多种（若干种）蛋白 质，该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、 苹果菌素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
[0223] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂是或包括一种商业纤维素分解酶制剂。
[0224] 适用于在本发明中使用的商业化纤维素分解酶制剂的实例包括例如 CELLIC?CTec (诺维信 A/S)、CELLIC?Ctec2 (诺维信 A/S)、CELLIC?Ctec3 (诺维信 A/ S)、CELLUCLAST?(诺维信 A/S)、N0V0ZYM?188(诺维信 A/S)、CELLUZYME?(诺维信 A/S)、CEREFL0?(诺维信 A/S)、以及 ULTRAFL0?(诺维信 A/S)、ACCELERASE?(杰能 科公司（Genencor Int.))、LAMINEX? (杰能科公司）、SPEZYME?CP (杰能科公司）、 R0HAMENT?7069W(罗姆公司（R0hmGmbH) )、FIBREZYME? LDI(并矢国际 公司（Dyadic International, Inc·))、FIB.REZYME·? LBR(并矢国际公司）、或 VISCOSTAR'? 150L(并矢国际公司）。
[0225] 在糖化期间可以按从约0. 001至约5. Owt%的固体（TS)，更优选从约0. 025至约 4. Owt %的固体，并且最优选从约0. 005至约2. Owt %的固体（TS)的有效量添加该纤维素分 解酶制剂。
[0226] 从未洗涤的预处理的纤维素材料牛产糖的工艺
[0227] 在一个第三方面，本发明涉及从未洗涤的预处理的纤维素材料生产糖的工艺，包 括：
[0228] (a)根据本发明的预调节方法进行预调节；
[0229] (b)用一种纤维素分解酶制剂使该预调节的材料糖化。
[0230] 在一个实施例中，在步骤（b)之后回收获得的这些糖。
[0231] 在一个实施例中，将这些糖用在用于生产糖浆（例如高果糖玉米糖浆）和木质纤 维素衍生的塑料（例如聚乙烯、聚苯乙烯以及聚丙烯）、聚乳酸（例如用于生产PET)的过程 中。
[0232] 用于预调节的苯酚氧化酶（例如虫漆酶）和半纤维素酶在以上的"预调节未洗涤 的预处理的纤维素材料的方法"和"酶"部分中说明。
[0233] 该纤维素分解酶制剂可以是任何纤维素分解酶制剂。适合的纤维素分解酶制剂的 实例在以上的"纤维素分解酶制剂"部分中给出。
[0234] 在一个优选实施例中，该纤维素分解酶制剂是真菌起源的。在一个实施例中，该纤 维素分解酶制剂源自于木霉属（例如里氏木霉）。在一个优选实施例中，糖化（水解）是在 包括选自下组的酶活性的一种纤维素分解酶制剂的存在下进行的，该组包括：内切葡聚糖 酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶（例如烟曲霉或米曲霉β-葡糖苷酶）。
[0235] 在一个优选实施例中，糖化是使用一种具有纤维素分解增强活性的多肽（例如一 种橙色嗜热子囊菌或埃默森青霉菌纤维素分解增强多肽）进一步进行的。
[0236] 在一个优选实施例中，糖化是使用选自半纤维素酶、扩张蛋白、酯酶、虫漆酶、木质 素分解酶、果胶酶、过氧物酶、蛋白酶、以及膨胀素中的一种或多种酶进一步进行的。
[0237] 在一个优选实施例中，该半纤维素酶选自一种木聚糖酶（例如一种棘孢曲霉或烟 曲霉木聚糖酶）、一种乙酰木聚糖酯酶、一种阿魏酸酯酶、一种阿拉伯呋喃糖苷酶、一种木糖 苷酶（例如烟曲霉木糖苷酶）、以及一种葡萄糖醛酸酶。
[0238] 在一个优选实施例中，与当在相同条件下在预调节步骤（a)中没有使用一种或多 种苯酚氧化酶和一种或多种半纤维素酶时相比，该预调节步骤（a)导致增加的糖化速率。
[0239] 以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
[0240] 材料&方法
[0241] 材料:
[0242] 虫漆酶A :源自于嗜热毁丝霍的在ffO 95/33836中被披露为SEQ ID NO: 2或此处 为SEQ ID NO :12的并可从丹麦的诺维信A/S获得的虫漆酶。
[0243] 半纤维素酶A :来自里氏木霉的纤维素分解酶制剂，进一步包括源自于棘孢曲霉 的GH10木聚糖酶（披露于W0 94/21785中的Xyl II和此处的SEQ ID N0:6)。
[0244] 半纤维素酶B :何括烟曲霉GH10木聚糖酶（在W0 2006/078256中的Xyl III或 此处的SEQ ID N0:8)和烟曲霉β-木糖苷酶（W0 2011/057140或此处的SEQ ID N0:9)的 里氏木霉纤维素酶制剂。
[0245] 纤维素分解酶制剂A :来自単氐木霍的纤维素分解酶制剂，讲一步何括具有纤维 素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽（W0 2005/074656中的SEQ ID N0:2和此处 的SEQIDN0:4)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶（W02005/047499 的SEQIDN0:2和此处的SEQ ID NO:5)以及源自于棘孢曲霉的GH10木聚糖酶（W0 94/21785中披露的Xyl II和此处的 SEQ ID N0:6)。
[0246] 纤维素分解酶制剂B :来自単氐木霍的纤维素分解酶制剂，讲一步何括具有纤维 素分解增强活性的青霉菌属种（Penicillium sp.)(埃默森）GH61多肽（W0 2011/041397和 此处的SEQ ID N0:7)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体（W02012/044915和此处的SEQ ID N0:5， 具有以下取代：F100D、S283G、N456E、F512Y)、烟曲霉纤维二糖水解酶I (W0 2011/057140和 此处的SEQ ID NO: 10)、烟曲霉纤维二糖水解酶II (W0 2011/057140和SEQ ID NO: 11)、烟 曲霉β-木糖苷酶（W0 2011/057140或此处的SEQ ID N0:9)、烟曲霉GH10木聚糖酶（TO 2006/078256 中的 Xyl III 和此处的 SEQ ID NO:8)。
[0247] 方法:
[0248] ?生物质中的总固体和液体处理样品中的总的溶解固体的确定。NREL/ TP-510-42621，2008 年 3 月修订
[0249] ?预处理的生物质材料中的不溶固体的确定。NREL/TP-510-42627, 2008年3月。
[0250] HPLC样品的制备。
[0251] 为了确定液体中的葡萄糖和木糖含量，按以下程序制备这些样品：
[0252]
【权利要求】
1. 一种预调节未洗涤的预处理的纤维素材料的方法，包括用苯酚氧化酶和半纤维素酶 孵育该未洗涤的预处理的纤维素材料。
2. 如权利要求1所述的方法，其中该苯酚氧化酶是一种虫漆酶。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中该半纤维素酶选自一种木聚糖酶（例如一种棘 孢曲霉或烟曲霉木聚糖酶）以及一种木糖苷酶（例如烟曲霉β-木糖苷酶）。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该纤维素材料是未解毒的。
5. 如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该纤维素材料是未洗涤的预处理的玉米 結杆（PCS)、玉米穗轴、麦結、稻結以及柳枝稷。
6. 如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中孵育发生持续至少30分钟，例如至少1 小时、2小时、4小时、8小时、12小时、或24小时，例如30分钟至24小时。
7. 如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中孵育发生在20°C -70°C之间，例如40°C 和60°C之间。
8. -种从未洗涤的预处理的纤维素材料生产一种发酵产物的工艺，包括： 如权利要求1-7中任一项中定义地进行预调节； 用一种纤维素分解酶制剂使该预调节的材料糖化； 使用一种发酵生物体进行发酵。
9. 如8所述的工艺，其中该纤维素分解酶制剂源自于木霉属（例如里氏木霉）。
10. 如权利要求8或9所述的工艺，其中糖化是在包括选自下组的酶活性的一种纤维素 分解酶制剂的存在下进行，该组包括：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β -葡糖苷酶 (例如烟曲霉或米曲霉β-葡糖苷酶）。
11. 如权利要求8-10中任一项所述的工艺，其中糖化是使用一种具有纤维素分解增强 活性的多肽（例如一种橙色嗜热子囊菌或埃默森青霉菌纤维素分解增强多肽）进行。
12. 如权利要求8所述的工艺，其中该半纤维素酶选自一种木聚糖酶（例如一种棘孢曲 霉或烟曲霉木聚糖酶）以及一种木糖苷酶（例如烟曲霉β-木糖苷酶）。
13. 如权利要求8-12中任一项所述的工艺，其中该发酵产物是一种醇（例如乙醇或丁 醇）、一种有机酸、一种酮、一种氨基酸、或一种气体。
14. 一种从未洗涤的预处理的纤维素材料生产一种糖的工艺，包括： (a) 如权利要求1-12中任一项中定义地进行预调节； (b) 用一种纤维素分解酶制剂使该调节的材料糖化。
15. 如权利要求14所述的工艺，进一步包括在步骤（b)之后回收该糖。
16. 如权利要求14或15所述的工艺，其中该纤维素分解酶制剂源自于木霉属（例如里 氏木霉）。
17. 如权利要求14-16中任一项所述的工艺，其中糖化是在包括选自下组的酶活性 的一种纤维素分解酶制剂的存在下进行，该组包括：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及 β-葡糖苷酶（例如烟曲霉或米曲霉β-葡糖苷酶）。
18. 如权利要求14-17中任一项所述的工艺，其中糖化是使用一种具有纤维素分解增 强活性的多肽（例如一种橙色嗜热子囊菌或埃默森青霉菌纤维素分解增强多肽）进行。
19. 如权利要求14-18中任一项所述的工艺，其中糖化是使用选自半纤维素酶、扩张蛋 白、酯酶、虫漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧物酶、蛋白酶、以及膨胀素中的一种或多种酶 进行。
20.如权利要求19所述的工艺，其中该半纤维素酶选自一种木聚糖酶（例如一种棘孢 曲霉或烟曲霉木聚糖酶）、一种乙酰木聚糖酯酶、一种阿魏酸酯酶、一种阿拉伯呋喃糖苷酶、 一种木糖苷酶（例如烟曲霉β -木糖苷酶）、以及一种葡萄糖醛酸酶。
【文档编号】C12P19/02GK104204215SQ201380016379
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2013年3月22日 优先权日:2012年3月26日
【发明者】X.李, M.T.史密斯 申请人:诺维信北美公司