骨膜素基因的表达抑制核酸分子、骨膜素基因的表达抑制方法及其用途
【专利摘要】本发明提供抑制骨膜素基因的表达的新分子。骨膜素基因的表达抑制核酸分子的特征在于，包含由序列号1?19中的任一个碱基序列构成的核苷酸作为骨膜素基因的表达抑制序列。利用本发明的表达抑制核酸分子，能够抑制骨膜素基因的表达，因此能够用于例如起因于骨膜素基因的表达的眼病，具体来说能够用于增殖性糖尿病视网膜病变或黄斑变性等的治疗。
【专利说明】骨膜素基因的表达抑制核酸分子、骨膜素基因的表达抑制 方法及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及成为眼病的原因的骨膜素（PeriOStin)基因的表达抑制核酸分子、骨 膜素基因的表达抑制方法及其用途。
【背景技术】
[0002] 近年来，伴随着糖尿病患者的增加，作为并发症之一的糖尿病视网膜病变 (Diabetic Retinopathy :DR)患者正在增加。糖尿病视网膜病变根据疾病分期而分 类为单纯糖尿病视网膜病变、前增殖型糖尿病视网膜病变和增殖型糖尿病视网膜病变 (Proliferative Diabetic Retinopathy JDR)。其中，增殖型糖尿病视网膜病变不仅存在 视力降低，而且有可能会失明。
[0003] 另外，作为眼病，老年性黄斑变性（Age-related Macular Degeneration :AMD)等 黄斑变性也同样地成为问题。黄斑变性是因年龄增长或压力等原因而出现黄斑变性、视力 降低的疾病。该疾病在严重时也有可能导致失明。
[0004] 这些眼病的起因是，脉络膜视网膜陷于缺氧状态等，为了补充氧，在视网膜上下形 成新生血管。由于新生血管脆弱，因而容易破裂出血，所出的血液会遮蔽光程，因而视力降 低。另外，所述新生血管发展为被称作增殖组织的纤维膜，由于该原因，还有可能产生牵引 性视网膜脱离。并且，若该状态持续、反复而严重化，则有可能导致失明（专利文献1)。因 此，关于这些眼病，要求提供能够成为治疗药的新的候补物质。
[0005] 有文献报道，这些眼病与骨膜素基因的表达有关（非专利文献1)。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1 :日本特开2011 - 220969号公报
[0009] 非专利文献
[0010] 非专利文献 I :S. Yoshida et al.，Investigative Ophthalmology&Visual Science，2011，Vol. 52, No. 8
【发明内容】
[0011] 发明要解决的问题
[0012] 因此，本发明的目的在于提供可抑制骨膜素基因的表达的新分子、以及提供使用 了该分子的表达抑制方法和眼病的治疗方法等用途。
[0013] 用于解决问题的方案
[0014] 为了达到上述目的，本发明的骨膜素基因的表达抑制核酸分子的特征在于，包含 下述（asl)、（as2)或（as3)的核苷酸作为骨膜素基因的表达抑制序列。
[0015] (asl)由序列号1?19中的任一个碱基序列构成的核苷酸；
[0016] (as2)由所述（asl)的碱基序列中缺失、置换和/或添加了一个或多个碱基的碱基 序列构成的、具有骨膜素基因的表达抑制功能的核苷酸；
[0017] (as3)由与所述（asl)的碱基序列具有90%以上的同源性的碱基序列构成的、具 有骨膜素基因的表达抑制功能的核苷酸。
[0018] 本发明的组合物的特征在于，其包含本发明的所述表达抑制核酸分子。
[0019] 本发明的眼病用药物的特征在于，其包含本发明的所述表达抑制核酸分子。
[0020] 本发明的抑制方法的特征在于，其为骨膜素基因的表达抑制方法，其使用本发明 的所述表达抑制核酸分子。
[0021] 本发明的眼病的治疗方法的特征在于，其包括将本发明的所述表达抑制核酸分子 投与患者的步骤。
[0022] 发明的效果
[0023] 利用本发明的表达抑制核酸分子，能够进行骨膜素基因的表达抑制。因此，本发明 对于骨膜素基因的表达成为原因的眼病、例如增殖型糖尿病视网膜病变或黄斑变性等各种 眼病的治疗有效。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1是示出本发明的核酸分子的一例的示意图。
[0025] 图2是示出本发明的核酸分子的另一例的示意图。
[0026] 图3是示出本发明的核酸分子的另一例的示意图。
[0027] 图4是示出本发明的核酸分子的另一例的示意图。
[0028] 图5是示出本发明的实施例1中的体外的骨膜素基因表达量的相对值的图。
[0029] 图6是本发明的实施例2的结果，（A)是示出小鼠的眼的纤维性增殖组织的体积 的图，（B)是示出小鼠的眼的新生血管的体积的图。
[0030] 图7是示出本发明的实施例3中的体外的骨膜素基因表达量的相对值的图。
[0031] 图8是示出本发明的实施例4中的体外的骨膜素基因表达量的相对值的图。
[0032] 图9是示出本发明的实施例4中的体外的骨膜素基因表达量的相对值的图。
[0033] 图10是示出本发明的实施例5中的体外的骨膜素基因表达量的相对值的图。
【具体实施方式】
[0034] 只要没有特别提及，则本说明书中使用的用语能够以该【技术领域】中通常所用的含 义使用。
[0035] 〈表达抑制核酸分子〉
[0036] 如前所述，本发明的表达抑制核酸分子（下文中也称为"本发明的核酸分子"）的 特征在于，其为表达抑制用的核酸分子，包括下述（asl)、（as2)或（as3)的核苷酸作为骨膜 素基因的表达抑制序列。
[0037] (asl)由序列号1?19中的任一个碱基序列构成的核苷酸；
[0038] (as2)由所述（asl)的碱基序列中缺失、置换和/或添加了一个或多个碱基的碱基 序列构成的、具有骨膜素基因的表达抑制功能的核苷酸；
[0039] (as3)由与所述（asl)的碱基序列具有90%以上的同源性的碱基序列构成的、具 有骨膜素基因的表达抑制功能的核苷酸。
[0040] 下文中，将所述（asl)、（as2)或（as3)的核苷酸称为as核苷酸，分别称为asl核 苷酸、as2核苷酸、as3核苷酸。
[0041] 本发明中，对骨膜素基因的表达的抑制没有特别限制，例如，可以为基因转录自身 的抑制，也可以为通过分解基因的转录产物而进行的抑制。另外，骨膜素基因的表达的抑制 例如可以为具有本来的功能的骨膜素蛋白质的表达的抑制，在蛋白质被表达的情况下，所 述蛋白质例如可以为所述功能被抑制的蛋白质，也可以为所述功能缺失的蛋白质。
[0042] 所述表达抑制序列例如可以为由所述as核苷酸构成的序列，也可以为包含所述 as核苷酸的序列。
[0043] 对所述表达抑制序列的长度没有特别限制，例如，为18?32碱基长、优选为19? 30碱基长、更优选为19、20、21碱基长。本发明中，例如，碱基数的数值范围公开了属于该 范围的全部正整数，例如"1?4碱基"的记载是指公开了"1、2、3、4碱基"的全部（以下相 同）。
[0044] 下面示出所述asl核苷酸的序列。需要说明的是，由所述序列号1?19的碱基序 列构成的核苷酸、由所述核苷酸构成的表达抑制序列、包含所述核苷酸的表达抑制序列、和 包含所述核苷酸的核酸分子分别还有时用以下所示的名称（序列号前的名称）表示。
【权利要求】
1. 一种骨膜素基因的表达抑制核酸分子，其特征在于，包含下述（asl)、（as2)或（as3) 的核苷酸作为骨膜素基因的表达抑制序列， (asl)由序列号1?19中的任一个碱基序列构成的核苷酸； (as2)由所述（asl)的碱基序列中缺失、置换和/或添加了一个或多个碱基的碱基序列 构成的、具有骨膜素基因的表达抑制功能的核苷酸； (as3)由与所述（asl)的碱基序列具有90%以上的同源性的碱基序列构成的、具有骨 膜素基因的表达抑制功能的核苷酸。
2. 根据权利要求1所述的表达抑制核酸分子，其特征在于，所述表达抑制核酸分子为 单链核酸分子， 从5'侧至3'侧依次包含5'侧区域（Xe)、内部区域⑵和3'侧区域（Yc)， 所述内部区域（Z)由内部5'侧区域（X)和内部3'侧区域（Y)连结而构成， 所述5'侧区域（Xe)与所述内部5'侧区域⑴互补， 所述3'侧区域（Yc)与所述内部3'侧区域⑴互补， 所述内部区域（Z)包含所述表达抑制序列。
3. 根据权利要求2所述的表达抑制核酸分子，其中， 在所述5'侧区域（Xe)与所述内部5'侧区域（X)之间具有连接子区域（Lx)， 介由所述连接子区域（Lx)连结所述5'侧区域（Xe)和所述内部5'侧区域（X)， 在所述3'侧区域（Yc)和所述内部3'侧区域（Y)之间具有连接子区域（Ly)， 介由所述连接子区域（Ly)连结所述3'侧区域（Yc)和所述内部3'侧区域（Y)。
4. 根据权利要求3所述的表达抑制核酸分子，其中，所述连接子区域（Lx)和所述连接 子区域（Ly)由核苷酸残基构成。
5. 根据权利要求3或4所述的表达抑制核酸分子，其中，所述连接子区域（Lx)和所述 连接子区域（Ly)由非核苷酸残基构成。
6. 根据权利要求5所述的表达抑制核酸分子，其中，所述非核苷酸残基包含吡咯烷骨 架和哌啶骨架中的至少一种。
7. 根据权利要求5或6所述的表达抑制核酸分子，其中，所述连接子区域（Lx)和所述 连接子区域（Ly)由下述式（I)表示，
所述式中， X1和X2各自独立地为H2、0、S或NH ; Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、0或S ; R3为与环A上的C-3、C-4、C-5或C-6键合的氢原子或取代基； L1为由n个原子构成的亚烷基链，此处，亚烷基碳原子上的氢原子任选被OH、0Ra、NH 2、 NHRa、NRaRb、SH、或者SRa取代或不被取代，或者， L1为所述亚烷基链的一个以上碳原子被氧原子取代的聚醚链， 其中，Y1为NH、0或S的情况下，与Y1键合的L1的原子为碳，与OR 1键合的L1的原子为 碳，氧原子彼此不相邻； L2为由m个原子构成的亚烷基链，此处，亚烷基碳原子上的氢原子任选被OH、0R\ NH2、 NHRe、NReRd、SH或者SRe取代或者不被取代，或者， L2为所述亚烷基链的一个以上碳原子被氧原子取代的聚醚链， 其中，Y2为NH、0或S的情况下，与Y2键合的L2的原子为碳，与OR 2键合的L2的原子为 碳，氧原子彼此不相邻； Ra、Rb、Re和Rd各自独立地为取代基或保护基； 1为1或2 ; m为0?30的范围的整数； n为0?30的范围的整数； 环A中，所述环A上的C-2以外的1个碳原子任选被氮、氧或硫取代， 所述环A内任选包含碳-碳双键或碳-氮双键， 所述区域（Xe)和所述区域（X)分别介由-OR1-或-OR2-与所述连接子区域（Lx)结合， 此处，R1和R2任选存在或不存在，在存在的情况下，R1和R2各自独立地为核苷酸残基 或所述结构（I)。
8. 根据权利要求2?7的任一项所述的表达抑制核酸分子，其中，所述内部区域（Z)的 碱基数（Z)、所述内部5'侧区域⑴的碱基数（X)、所述内部3'侧区域⑴的碱基数（Y)、 所述5'侧区域（Xe)的碱基数（Xe)和所述3'侧区域（Yc)的碱基数（Yc)满足下述式（1) 和⑵的条件， Z = X+Y ? ? ? (1) Z 彡 Xc+Yc ? ? ? (2)。
9. 根据权利要求8所述的表达抑制核酸分子，其中，所述内部5'侧区域⑴的碱基数 (X)与所述5'侧区域（Xe)的碱基数（Xe)之差、所述内部3'侧区域⑴的碱基数⑴与所 述3'侧区域（Yc)的碱基数（Yc)之差满足下述条件， (a) 满足下述式（11)和（12)的条件， X-Xc = 1、2 或 3 ? ? ? (11) Y-Yc = 0 ? ? ? (12) (b) 满足下述式（13)和（14)的条件， X-Xc = 0 ? ? ? (13) Y-Yc = 1、2 或 3 ? ? ? (14) (c) 满足下述式（15)和（16)的条件， X-Xc = 1、2 或 3 ? ? ? (15) Y-Yc = 1、2 或 3 ? ? ? (16) (d) 满足下述式（17)和（18)的条件， X-Xc = 0 ? ? ? (17) Y-Yc = 0 ? ? ? (18)。
10. 根据权利要求1?9的任一项所述的表达抑制核酸分子，其中，所述表达抑制序列 的长度为18?32碱基长。
11. 根据权利要求1?9的任一项所述的表达抑制核酸分子，其中，所述表达抑制核酸 分子的序列为选自由序列号83?97组成的组中的至少一个碱基序列。
12. 根据权利要求1所述的表达抑制核酸分子，其中， 所述表达抑制序列进一步具有突出序列， 在所述核苷酸的3'端附加有所述突出序列。
13. 根据权利要求1或12所述的表达抑制核酸分子，其中，所述表达抑制序列为包含所 述（asl)的核苷酸的、序列号20?38中的任一个碱基序列构成的核苷酸，其中，n为正整 数。
14. 根据权利要求1、12和13的任一项所述的表达抑制核酸分子，其中，所述表达抑制 序列的长度为18?32碱基长。
15. 根据权利要求1和12?14的任一项所述的表达抑制核酸分子， 其进一步具有与所述表达抑制序列退火的互补序列， 所述互补序列包含与所述表达抑制序列中的所述（asl)、（as2)或（as3)的核苷酸互补 的核苷酸。
16. 根据权利要求15所述的表达抑制核酸分子，其中，所述互补序列中的所述核苷酸 为下述（si)、（s2)或（s3)的核苷酸， (si)由与所述（asl)的碱基序列互补的碱基序列构成的核苷酸； (s2)由与所述（as2)的碱基序列互补的碱基序列构成的核苷酸； (S3)由与所述（as3)的碱基序列互补的碱基序列构成的核苷酸。
17. 根据权利要求16所述的表达抑制核酸分子，其中，所述（si)的核苷酸为由序列号 39?57中的任一个碱基序列构成的核苷酸。
18. 根据权利要求15?17的任一项所述的表达抑制核酸分子，其中， 所述互补序列进一步具有突出序列， 在所述核苷酸的5'端附加有所述突出序列。
19. 根据权利要求15?18的任一项所述的表达抑制核酸分子，其中，所述互补序列为 包含所述（si)的核苷酸的、序列号58?76中的任一个碱基序列构成的核苷酸，其中，n为 正整数。
20. 根据权利要求12?19的任一项所述的表达抑制核酸分子，其中，所述突出序列为 1?3碱基长。
21. 根据权利要求12?20的任一项所述的表达抑制核酸分子，其中，所述表达抑制核 酸分子为由两条单链构成的双链核酸分子，其反义链具有所述表达抑制序列，其有义链具 有所述互补序列。
22. -种组合物，其特征在于，其包含权利要求1?21的任一项所述的表达抑制核酸分 子。
23. -种眼病用药物，其特征在于，其包含权利要求1?21的任一项所述的表达抑制核 酸分子。
24. 根据权利要求23所述的眼病用药物，其中，所述眼病为选自由视网膜病变、黄斑变 性、翼状胬肉、结膜炎、眼内新生血管和眼的纤维瘢痕组成的组中的至少1种疾病。
25. 根据权利要求24所述的眼病用药物，其中，所述视网膜病变为增殖型糖尿病视网 膜病变或增殖性玻璃体视网膜病变。
26. -种抑制方法，其特征在于，其为抑制骨膜素基因的表达的方法，使用权利要求 1?21的任一项所述的表达抑制核酸分子。
27. 根据权利要求26所述的抑制方法，其中，所述方法包括将所述表达抑制核酸分子 投与细胞、组织或器官的步骤。
28. 根据权利要求26或27所述的抑制方法，其中，在体内或体外投与所述表达抑制核 酸分子。
29. -种眼病的治疗方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1?21的任一项所述 的表达抑制核酸分子投与患者的步骤。
30. 根据权利要求29所述的治疗方法，其中，所述眼病为选自由视网膜病变、黄斑变 性、翼状胬肉、结膜炎、眼内新生血管和眼的纤维瘢痕组成的组的至少1种疾病。
31. 根据权利要求30所述的治疗方法，其中，所述视网膜病变为增殖型糖尿病视网膜 病变或增殖性玻璃体视网膜病变。
32. 根据权利要求1?21的任一项所述的表达抑制核酸分子，其用于眼病的治疗。
33. 根据权利要求32所述的表达抑制核酸分子，其中，所述眼病为选自由视网膜病变、 黄斑变性、翼状胬肉、结膜炎、眼内新生血管和眼的纤维瘢痕组成的组的至少1种疾病。
34. 根据权利要求33所述的表达抑制核酸分子，其中，所述视网膜病变为增殖型糖尿 病视网膜病变或增殖性玻璃体视网膜病变。
【文档编号】C12N15/113GK104220598SQ201380018264
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年3月29日 优先权日:2012年3月29日
【发明者】吉田茂生, 滨崎智洋, 石川桂二郎, 水谷隆之, 石桥达朗, 大木忠明, 中间崇仁 申请人:国立大学法人九州大学, Aqua疗法股份有限公司