肽和抗体文库及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明一般性涉及抗体文库、多肽文库及其应用，包括产生抗体文库的方法、鉴别靶的抗体的方法，以及鉴别与病症相关的靶的方法。在具体的实施方案中，本发明涉及包含至少10000个不同成员的抗体文库，其可用于筛选对感兴趣的蛋白质具有高亲和性的抗体。
【专利说明】化和抗体文库及其应用
[0001] 相关申请的交叉参考
[000引 本申请要求2012年3月31日申请的PCT申请号PCT/CN2012/000430的优先权， 其全文引入本文。 发明领域
[0003] 本发明一般性涉及抗体、抗体文库、多肤、多肤文库及其应用，包括产生抗体文库 的方法、鉴别祀的抗体的方法及鉴别与病症相关的祀的方法。在具体的实施方案中，本发明 涉及包含至少10000个不同成员的抗体文库，其可用于筛选对于祀如感兴趣的蛋白质具有 高亲和性的抗体。
[0004] 发明背景
[0005] 在医学、生物学、药学等领域中，不同抗体及抗体文库的需求快速增加。目前，获得 抗体的常用方法包括杂交瘤技术、重组抗体技术、多种分子展示技术，W及组合上述技术与 高通量方法的那些技术等等。
[0006] 在常规的抗体制备技术中，通常必需使用天然或重组蛋白质或其片段免疫动物， W使得该动物产生可W特异性识别并结合所述蛋白质的抗体。所述抗体然后可根据不同的 要求通过不同的技术方式得自所述动物的细胞。
[0007] 抗体的获得可包括杂交瘤技术。在该种方法中，在免疫动物之后，需要获取动 物细胞及随后进行细胞融合，W获得产生抗体的杂交瘤；然后将杂交瘤克隆并建立株 系W产生抗体，随后纯化并鉴别抗体。根据需要，也可W确定抗原的表位。该种杂交 瘤技术的详细步骤可见于各种教科书和手册（例如Bazin,Rathybridomasandrat monoclonalantibodies,CRCPress, 1990 ；Goding,Monoclonalantibodies!principles andpractice,3"edition,AcademicPress,1996；ShepherdandDeanMonoclonal antibodies,OxfordUniversityPress, 2000等）。目前该些方法仍广泛用于抗体制备，但 是它们有许多缺点，如较长的制备周期、非常复杂的制备技术及高成本。此外，该些方法不 能用于所有蛋白质，例如对于具有不佳溶解性、低免疫原性或毒性的一些抗原，该些方法是 不适用的（SinclairNRetal. , 2004Bcell/antibodytolerancetoourownantigens. RrontBiosci9:3019 - 3028)。
[0008]此外，为了获得具有特异性的单克隆抗体，常用的方式是将化学合成的肤片段与 载体蛋白质偶联，然后使用其免疫小鼠。该种方法可产生针对相同蛋白质的单一表位的抗 体。然而，由于不同肤片段的免疫原性的不同，该种方案的整体成功率不够好，特别是对于 示出与宿主具有高同源性的蛋白质，其肤具有非常差的免疫原性，且在小鼠中难W刺激有 效的免疫反应。另一常规策略是使用全长蛋白质或其片段作为免疫原，该个策略部分解决 了上述问题，但是仍存在一些其它缺陷，如在蛋白质表达中低整体成功率（对于正常表达 和纯化系统为 30-70%)(ThorstenKohLQiristianSchmi化，StefanWiemann,Annemarie PoustkaandUlrikeKorf.化ew，2003)。对于使用的与宿主动物具有高同源性的蛋白质片 段，其在动物中的免疫应答通常较弱，且制备单克隆抗体的成功率相对较低（SinclairNR et吐 2004,Automatedproductionofrecombinanthumanproteinsasresourcefor proteomeresearch,ProteomeScience2008,6:4;SinclairN民（2004)6cell/antibody tolerancetoourownantigens.FrontBiosci9:3019 - 3028)。
[0009] 重组抗体技术可W与各种分子展示技术组合，W产生多个抗原的抗体（与靴 具有高亲和性），抗原的表位可W同时确定，因此这个策略常用于药物开发（化ristine Rothe,StefanieUrlinger,MakikoYamashitaetal.TheHumanCombinatorialAntibody LibraryHuCALGOLDCombinesDiversificationofAllSixCDRsAccordingtothe NaturalImmuneSystemwithaNovelDisplayMethodforEfficientSelectionof Hi組-AffinityAntibodies.J.Mol.Biol. (2008) 376, 1182 - 1200, 2007)。但是重组抗体技 术的操作是复杂的、高成本的，且其产率相对较低，经常存在非特异性结合，由此该些技术 不會長广泛使用(Levitan,B.Stochasticmodelingandoptimizationofphagedisplay. J.Mol.Biol. 277, 893 - 916 (1998).Bradburyetal, 2004)。
[0010] 如此，现有【技术领域】中所有常规的抗体制备方法均典型包括复杂的操作方法，女口 免疫动物、制备杂交瘤细胞等。因此，它们均具有较长的制备周期、复杂的制备技术及高成 本等缺点。
[0011] 基于瞻菌体抗体的抗体文库技术是近年来开发的一种新的抗体制备技术。将在体 外克隆的抗体基因片段插入瞻菌体载体中，然后表达；随后，使用抗原针对表达的抗体文库 进行筛选，从而获得具有特异性的单克隆瞻菌体抗体。然而，瞻菌体抗体文库技术需要文库 中极大量抗体W获得具有高亲和性的抗体，该种抗体产生方法仍相对复杂。
[0012] 为了解决上述问题，需要一种制备或筛选抗体的新方法，W省略复杂的、耗时的及 高成本的步骤，因此可W快速及有效地制备或筛选具有高亲和性的抗体。本发明解决了上 述及本领域涉及的其它相关问题。
[001引发明概述
[0014] 一方面，本发明涉及鉴别祀的抗体的方法，所述方法包括；a)提供得自对象如哺 乳动物的抗体文库，其中所述抗体文库包含少于1〇7个不同种类的抗体；b)将所述祀与所 述抗体文库在适于所述祀与所述抗体文库中的抗体结合的条件下接触，如果该种抗体存在 与所述抗体文库中；及C)评估所述祀与所述抗体之间的结合W鉴别所述抗体是所述祀的 抗体。在一些实施方案中，所述抗体文库得自免疫系统尚未受外来祀刺激的对象或哺乳动 物。另一方面，本发明涉及特异性结合祀的抗体，其中所述抗体是通过上述方法鉴别的。
[0015] 再一方面，本发明涉及鉴别祀的抗体的抗体文库，所述抗体文库得自对象或哺乳 动物，所述抗体文库包含少于1〇7个不同种类的抗体。在一些实施方案中，所述抗体文库得 自免疫系统尚未被外来祀刺激的对象或哺乳动物。
[0016]另一方面，本发明涉及多肤文库，该多肤文库包含多个分离的包含不同的随机 氨基酸序列的多肤，其中所述多肤包含大约5-100个氨基酸，优选10-20、10-30、10-40、 10-50、10-60、10-70、10-80、10-90或10-100个氨基酸，所述多肤不包含切S，不包含3个或 更多个相同的连续氨基酸，和/或不包含5个或更多个相同氨基酸。再一方面，本发明涉及 产生抗体文库的方法，该方法包括；a)用上述多肤文库免疫对象；及b)从所述对象中回收 抗体。再一方面，本发明涉及通过上述方法产生的抗体文库。
[0017] 再一方面，本发明涉及在序列表（SEQIDNO: 1-55471)中列出的分离的多肤。在 一些实施方案中，本发明涉及序列表（SEQIDN0:l-55471)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8 或9个分离的多肤。
[0018] 再一方面，本发明涉及多肤文库，该多肤文库包含序列表（SEQIDNO: 1-55471) 中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000 个或者所有分离的多肤。再一方面，本发明涉及产生抗体文库的方法，所述方法包括：a)用 上述多肤文库免疫对象；及b)从所述对象中回收抗体。再一方面，本发明涉及通过上述方 法产生的抗体文库。
[0019] 再一方面，本发明涉及特异性结合序列表（SEQIDNO: 1-55471)中列出的多肤的 分离的抗体。在一些实施方案中，本发明涉及特异性结合序列表（SEQIDNO: 1-55471)中 列出的至少2、3、4、5、6、7、8或9个分离的多肤的分离的抗体。
[0020] 再一方面，本发明涉及抗体文库，该抗体文库包含特异性结合序列表（SEQID N0:l-55471)中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、 40000、45000、50000个或者所有多肤的抗体。
[0021] 再一方面，本发明涉及鉴别祀抗体的肤抗原性序列的方法，所述方法包括；a)将 祀抗体与包含序列表（SEQIDN0:l-55471)中列出的至少10、100、1000、10000、15000、 20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000个或者所有分离多肤的多肤文库在适于 所述祀抗体与所述多肤文库中的多肤结合的条件下接触，如果该种肤存在于所述多肤文库 中；及C)评估所述祀抗体与所述多肤之间的结合W鉴别所述祀抗体的肤抗原性序列。
[0022] 再一方面，本发明涉及特异性结合Akt的分离的抗体，该分离的抗体特异性结合 包含于氨基酸序列孤GGQKAVKD中的表位。
[0023] 再一方面，本发明涉及特异性结合ERK2的分离的抗体，该分离的抗体特异性结合 包含于氨基酸序列HPLGSPGSAS中的表位。
[0024] 再一方面，本发明涉及特异性结合Desmin的分离的抗体，该分离的抗体特异性结 合包含于氨基酸序列REIRRYQKST中的表位。
[0025] 再一方面，本发明涉及特异性结合CBL4的分离的抗体，该分离的抗体特异性结合 包含于氨基酸序列RSRA服QAYT中的表位。
[0026] 再一方面，本发明涉及特异性结合霍乱毒素的分离的抗体，该分离的抗体特异性 结合包含于氨基酸序列阳EREQANTA、EYQQAQLEAE或DSSMSMADSE中的表位。
[0027] 再一方面，本发明涉及特异性结合VEGF的分离的抗体，该分离的抗体特异性结合 包含于氨基酸序列VLDFILSMGL、AKRKAGTSPR或RNSDFSAGSP中的表位。
[0028] 再一方面，本发明涉及鉴别与某种病症相关的祀的方法，所述方法包括；a)将得 自患有某种病症的来源的样品与抗体文库接触，并评估所述样品中的物质与所述抗体文 库中抗体之间的结合或者缺乏结合，其中所述抗体文库得自免疫系统尚未被外来祀刺激 的对象或哺乳动物及所述抗体文库包含少于1〇7个不同种类的抗体，或者所述抗体文库 是通过用多肤文库免疫对象或哺乳动物而获得的，所述多肤文库包含具有不同的随机氨 基酸序列的多个分离的多肤，其中所述多肤包含大约5-100个氨基酸，优选10-20U0-30、 10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90或10-100个氨基酸，所述多肤不包含切S，不包 含3个或更多个相同的连续氨基酸，和/或不包含5个或更多个相同氨基酸，或者所述抗 体文库是通过用多肤文库免疫对象或哺乳动物而获得的，所述多肤文库包含序列表（SEQ IDN0:l-55471)中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、 40000、45000、50000个或者所有分离的多肤；b)将得自不具有所述病症的来源的样品与 上述抗体文库接触，并评估所述样品中的物质与所述抗体文库中抗体之间的结合或缺乏结 合；及C)当在步骤a)和b)中所述物质与所述抗体之间的结合或缺乏结合存在差别时，贝U 鉴别该物质为与所述病症相关的祀。
[0029] 再一方面，本发明涉及鉴别与病症相关的祀的方法，所述方法包括；a)将得自患 有病症的来源的样品与多肤文库接触，所述多肤文库包含具有不同的随机氨基酸序列的多 个分离的多肤，其中所述多肤包含大约5-100个氨基酸，优选10-20、10-30、10-40、10-50、 10-60、10-70、10-80、10-90、或10-100个氨基酸，所述多肤不包含切S，不包含3个或更多 个相同的连续的氨基酸，和/或不包含5个或更多个相同的氨基酸，或者多肤文库包含序列 表（SEQIDN0:l-55471)中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、 35000、40000、45000、50000个或者所有分离的多肤，并评估所述样品中的物质与所述多肤 文库中的多肤之间的结合或缺乏结合；b)将得自不具有所述病症的来源的样品与上述多 肤文库接触，并评估所述样品中的物质与所述多肤文库中多肤之间的结合或缺乏结合；及 C)当步骤a)和b)中所述物质与所述多肤之间的结合或缺乏结合存在差别时，则鉴别该物 质为与所述病症相关的祀。
[0030] 再一方面，本发明提供了抗体文库，其包含；（1)针对具有10-20个氨基酸的随机 肤的抗体，（2)IgG抗体，由从初次用于实验的（naYve)哺乳动物的脾细胞产生的杂交瘤细 胞分泌，（3)IgG抗体，由从用总蛋白质提取物免疫的哺乳动物的脾细胞产生的杂交瘤分泌， 所述蛋白质提取物来自完整生物体、一或多种其组织、和/或一或多种其细胞，（4)IgG抗 体，由针对一或多种抗原建立的稳定杂交瘤品系分泌；或者（1)-(4)的任意组合。
[0031] 在一个实施方案中，所述抗体文库包含至少10000个不同成员，当所述抗体文库 用于筛选针对祀或感兴趣的蛋白质的抗体时，其成功率为至少85%。
[0032] 在一个实施方案中，本发明的抗体文库是杂交瘤细胞文库的形式。
[0033] 在一个实施方案中，本发明的随机肤；1)不含有半脫氨酸，2)不含有3个或更多个 连续的相同氨基酸，3)不含有5个或更多个相同氨基酸。
[0034] 在一个实施方案中，每个随机肤的初始分值设定为任何值，通过如下步骤选择随 机肤；1)对于具有潜在糖基化位点的氨基酸，每个潜在的糖基化位点从所述分值中减去1 点，2)每个氨基酸K或R残基从所述分值中减去4点；基于上述分值，从上至下选择具有最 高分值的希望数量的肤。
[00巧]在一个实施方案中，例如从上至下选择具有最高分值的10000个肤。在另一实 施方案中，例如从上至下选择具有最高分值的15000、20000、25000、30000、35000、40000、 45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000 或 100000 个 肤。在一个实施方案中，选择的随机肤是化学合成的。
[0036] 在一个实施方案中，初次用于实验的哺乳动物选自小鼠、大鼠和兔。
[0037] 在一个实施方案中，所述完整生物体选自拟南芥、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、果虫电、 斑马鱼、烧虫、水稻或者玉米等。
[0038] 在一个实施方案中，所述组织选自血液组织、拟南芥花弯、不同发育阶段的烧虫组 织，或者小鼠脑组织。
[0039] 在一个实施方案中，所述一或多种细胞选自脾细胞、肿瘤细胞或细胞系，如人肿瘤 细胞系。
[0040] 在一个实施方案中，对抗体文库中的抗体进行亲和性成熟。在特定实施方案中，本 发明的抗体文库可用于基于相对少量文库成员获得具有高亲和性的抗体。
[0041] 再一方面，本发明提供了包含本发明的抗体文库的组合。
[0042] 另一方面，本发明提供了生物芯片，其包含本发明的抗体文库。
[0043] 另一方面，本发明提供了筛选针对感兴趣的蛋白质的抗体的方法，包括使用本发 明的抗体文库、本发明的组合或者本发明的生物芯片筛选针对所述感兴趣的蛋白质的一或 多种抗体。
[0044] 在一个实施方案中，本发明的方法包括；(a)将所述感兴趣的蛋白质与所述抗体 文库的抗体或抗体组混合，化）选择能结合所述感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组。
[0045] 在一个实施方案中，本发明的方法包括；(a)将所述感兴趣的蛋白质与所述抗体 文库的抗体或抗体组混合，化）选择能结合所述感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组，（C)将所 述感兴趣的蛋白质与在步骤化）中选择的抗体或抗体组的抗体亚组混合，（d)选择能结合 所述感兴趣的蛋白质的抗体或抗体亚组。在另一实施方案中，本发明的方法进一步包括使 用在步骤（d)中选择的抗体亚组重复步骤（C)和（d)，直至选择能结合所述感兴趣的蛋白质 的抗体。
[0046] 在另一实施方案中，本发明的方法包括针对几个感兴趣的蛋白质同时筛选，包括 (a)将所述几个感兴趣的蛋白质与所述抗体文库的抗体或抗体组混合，化）选择能结合所 述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组，（C)将所述几个感兴趣的蛋白质的每个蛋白质单 独与在步骤化）中选择的能结合所述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组混合，然后分别 选择能结合各个感兴趣的蛋白质每一个的抗体或抗体组。
[0047] 在另一实施方案中，本发明的方法包括针对几个感兴趣的蛋白质同时筛选，包括： (a)将所述几个感兴趣的蛋白质与所述抗体文库的抗体或抗体组混合，化）选择能结合所 述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组，（C)将所述几个感兴趣的蛋白质的每个蛋白质单 独与在步骤化）中选择的能结合所述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组混合，然后分别 选择能结合所述几个感兴趣的蛋白质的每一个的抗体或抗体组，（d)将所述几个感兴趣的 蛋白质的每一个单独与在步骤（C)中选择的能结合各个所述感兴趣的蛋白质的抗体或抗 体组的抗体亚组混合，（e)分别选择能结合所述几个感兴趣的蛋白质的每一个的抗体或抗 体亚组。在另一实施方案中，本发明的方法进一步包括使用在步骤（e)中选择的抗体亚组 重复步骤（d)和（e)，直至分别选择了能结合所述几个感兴趣蛋白质的每一个的抗体。
[0048] 在一个实施方案中，本发明的方法可W使用高通量筛选装置进行。
[0049] 在一个实施方案中，本发明方法中使用的高通量筛选装置是生物芯片，如蛋白质 芯片，或者 1 油-〇n-a-chip(LOC)。
[0050] 另一方面，本发明还涉及本发明的抗体文库在制备筛选感兴趣的蛋白质的抗体的 装置或试剂盒中的应用。在一个实施方案中，所述装置是高通量筛选装置。在另一实施方 案中，所述高通量筛选装置是生物芯片，如蛋白质芯片，或者1油-on-a-chip(LOC)。
[0051] 在一个实施方案中，所述感兴趣的蛋白质是翻译后修饰的蛋白质或多肤，或者毒 性蛋白质或多肤。
[0052] 附图简述
[0053] 图1示出AKT蛋白质SER473磯酸化的测定。
[0054] 图2示出E服2蛋白质Western印迹核实。
[00巧]图3示出VEGF蛋白质Western印迹核实。
[0056] 图4不出CBL4蛋白质Western印迹核实。
[0057] 图5示出质粒pHG。
[0058]图6示出质粒pHLDis-VL。
[00则发明详述
[0060] 为了清晰说明本发明而无限制之意，本发明的详细描述分成如下部分。
[006。A.定义
[0062]除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域技术人员 通常理解的相同含义。本文提及的所有专利、申请、公开的申请及其它出版物均W其全部内 容并入本文作参考。如果该个章节中的定义与并入本文作参考的专利、申请、公开的申请及 其它出版物中的定义相反或者不一致，则W该个章节中的定义而非并入本文作参考的文献 中的定义为主。
[0063] 如本文所用，"一个"是指"至少一个"或者"一或多个"。
[0064] 术语"多肤"、"寡肤"、"肤"和"蛋白质"在本文可互换使用，是指任何长度的氨基 酸例如至少 5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1000 或更多个氨基酸的 聚合物。所述聚合物可W是线性或分支的，其可包含修饰的氨基酸，及其可W被非氨基酸中 断。该术语还涵盖已经天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、月旨 质化、己醜化、磯酸化，或者任何其它操纵或修饰，如与标记成分缀合。该定义还包含例如含 有一或多个氨基酸类似物（包括例如非天然氨基酸等）W及本领域已知的其它修饰的多 肤。
[0065]"抗体"是通过位于免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点而能特 异性结合祀如碳水化合物、多核巧酸、脂质、多肤等的免疫球蛋白分子，且可W是任何类别 的免疫球蛋白，例如IgG、IgM、IgA、I曲和I班。！巧，是在禽类物种如鸡中的主要抗体类型， 也包含在该定义中。如本文所用，该术语涵盖了不仅完整的多克隆或单克隆抗体，而且还包 括其片段（如F油、F油'、F(油'）2、Fv)、单链（ScFv)、其突变体、天然发生的变体、包含具有 需要的特异性的抗原识别位点的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体，及包含需要 的特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰的构型。
[0066] 如本文所用，术语"特异性结合"是指抗体的特异性，由此其优先结合祀抗原，如多 肤抗原。在存在其它潜在干扰物质条件下抗体对特定祀的识别是该种结合的一个特性。优 选地，特异于或特异性结合祀抗原的抗体或抗体片段与祀抗原的结合亲和性高于结合其它 非祀物质的亲和性。也优选地，特异于或特异性结合祀抗原的抗体或抗体片段避免结合较 高百分比的非祀物质如检测样品中存在的非祀物质。在一些实施方案中，本发明的抗体或 抗体片段避免结合高于大约90%的非祀物质，尽管显然考虑并优选更高的百分比。例如， 本发明的抗体或抗体片段避免结合大约91 %、大约92 %、大约93 %、大约94%、大约95 %、 大约96%、大约97%、大约98%、大约99%及大约99%或更多的非祀物质。在其它实施 方案中，本发明的抗体或抗体片段避免结合高于大约10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %或 70%、或者高于大约75%、或者高于大约80%、或者高于大约85%的非祀物质。
[0067] 如本文所用，术语"特异性结合"也是指多肤的特异性，由此其优先结合祀抗体，女口 检测样品中的祀抗体。在存在其它抗体或物质的条件下多肤对特定祀抗体的识别是该种结 合的一个特性。优选地，特异于或特异性结合抗体的多肤与祀抗体的结合亲和性高于与其 它非祀抗体或物质的结合亲和性。也优选地，特异于或特异性结合祀抗体的多肤避免结合 较高百分比的非祀抗体或物质，例如检测样品中存在的非祀抗体。在一些实施方案中，本发 明的多肤避免结合高于大约90%的非祀抗体或物质，尽管显然考虑并优选就更高百分比。 例如，本发明的多肤避免结合大约91 %、大约92%、大约93%、大约94%、大约95%、大约 96%、大约97%、大约98%、大约99%及大约99%或更多的非祀抗体或物质。在其它实施 方案中，本发明的多肤避免结合高于大约10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%、或者 高于大约75%、或者高于大约80%、或者高于大约85%的非祀抗体或物质。
[006引如本文所用，术语"抗原"是指由抗体通过其抗原识别位点特异性结合的祀分子。 所述抗原可W是单价或多价的，即其可W具有由一或多个抗体识别的一或多个表位。可W 由抗体识别的抗原的种类例如包括多肤、寡糖、糖蛋白、多核巧酸、脂质等。
[006引术语"多核巧酸"、"寡核巧酸"、"核酸"及"核酸分子"在本文可互换使化是指任何 长度的核巧酸例如至少8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1000或更多个核巧 酸的聚合形式，及可包含核糖核巧酸、脱氧核糖核巧酸、其类似物、或者其混合物。该术语仅 是指分子的一级结构。因此，该术语包括H链、双链及单链脱氧核糖核酸值NA),W及H链、 双链和单链核糖核酸（RNA)。其还包括所述多核巧酸的修饰的及未修饰的形式，所述修饰如 通过焼化和/或通过加帽修饰。更特别地，术语"多核巧酸"、"寡核巧酸"、"核酸"和"核酸 分子"包括聚脱氧核糖核巧酸（含有2-脱氧-D-核糖）、聚核糖核巧酸（含有D-核糖），包 括tRNA、rRNA、hRNA和mRNA，无论是剪接或是非剪接的，是嘿岭或嚼巧碱基的N-或C-糖巧 的任何其它类型的多核巧酸，及含有normucleotidic主链的其它聚合物，例如聚醜胺（如 肤核酸（PNA))及polymo巧holino(可商购自Anti-Virals,Inc. ,Corvallis,OR.,Neugen e)聚合物，及其它合成的序列特异性核酸聚合物，条件是所述聚合物在构型中含有核碱基， 使得可W碱基配对和碱基堆积，如在DNA和RNA中发现的。因此，该些术语包括例如3' -脱 氧-2'，5' -DNA，寡脱氧核糖核巧酸N3' -P5'氨基磯酸醋，2' -0-焼基-取代的RNA，DNA与 RNA之间或者PNA与DNA或RNA之间的杂交体，也包括已知类型的修饰，例如标记、焼化、"加 帽"、用类似物取代一或多个核巧酸，核巧酸间修饰如具有无电荷键（例如甲基麟酸醋、磯酸 H醋、氨基磯酸醋、氨基甲酸醋等）、具有负电荷键（例如硫代磯酸醋、二硫代磯酸醋等）及 具有正电荷键（氨基焼基氨基磯酸醋、氨基焼基磯酸H醋）的那些，含有息垂（pendant)部 分的那些，例如蛋白质（包括酶（例如核酸酶）、毒素、抗体、信号肤、聚-k赖氨酸等），具 有嵌合剂的那些（例如吓巧、补骨脂素等），含有馨合物的那些（例如金属、放射性金属、测、 氧化金属等的馨合物），含有焼化剂的那些，具有修饰的键的那些（例如a异头核酸等）， W及多核巧酸或寡核巧酸的未修饰形式。
[0070] 如本文所用，意识到术语"核巧"和"核巧酸"包括不仅含有已知嘿岭和嚼巧碱基 的那些部分，而且还含有已经修饰的其它杂环碱基。该种修饰包括甲基化嘿岭或嚼巧，醜化 的嘿岭或嚼巧，或者其它杂环。修饰的核巧或核巧酸也可W包含在糖部分的修饰，例如其中 一或多个轻基极端用团素、脂肪族基团置换，或者功能化为離、胺等等。术语"核巧酸单位" 是指涵盖核巧与核巧酸。
[0071] 如本文所用，"生物学样品"是指得自活体或病毒来源或者其它大分子和生物分子 来源的任何样品，包括对象的任何细胞类型或组织，从中可获得核酸或蛋白质或其它大分 子。所述生物学样品可W是直接得自生物学来源的样品或被加工的样品。例如，扩增的分 离核酸构成生物学样品。生物学样品包括但不限于动物和植物的体液，如血液、血浆、血清、 脑脊液、滑液、尿液和汗液、组织和器官样品及从中衍生的加工的样品。生物学样品还包括 ±壤和水样品及其它环境样品，病毒，细菌，真菌，藻类，原生动物及其成分。
[0072] 如本文所用，术语"评估"是指包括在获得关于样品中存在的分析物的量或浓度的 绝对值的意义上及在获得指数、比率、百分比、目测值或表示样品中分析物水平的其它值的 意义上的定量和定性确定。评估可W是直接或间接评估，实际检测的化学物质不必当然是 分析物自身，可例如是其衍生物或者一些进一步的物质。
[0073] 如本文所用，"血清"是指在除去纤维蛋白凝块和血液细胞之后获得的血液的液体 部分，与循环血中血浆区别。
[0074] 如本文所用，"血浆"是指血液的液体的无细胞部分，与凝血后获得的血清区别。
[00巧]如本文所用，"通过重组方式产生"是指使用重组核酸方法的产生方法，所述方法 依赖于熟知的表达由克隆的核酸编码的蛋白质的分子生物学方法。
[0076] 如本文所用，"液体"是指可W流动的任何组合物。因此，液体涵盖了半固体、糊状、 溶液、水性混合物、凝胶、乳液、乳霜等形式的组合物及其它该类组合物。
[0077]如本文所用，"样品"是指可含有分析物的任何东西，对其希望进行分析物测定。样 品可W是生物学样品，如生物学体液或生物学组织。生物学液体例如包括尿液、血液、血浆、 血清、唾液、精液、大便、姨液、脑脊液、巧液、粘液、羊水等。生物学组织是细胞聚集体，通常 是特定种类与其细胞间物质一起形成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构材料之 一，包括结缔组织、上皮组织、肌肉组织和神经组织。生物学组织的实例还包括器官、肿瘤、 淋己结、动脉和个体细胞。
[0078] 如本文所用，"疾病或失调"是指生物体中得自例如感染或遗传缺陷的病理学状 况，特征在于可鉴别的症状。
[0079] 如本文所用，"芯片"是指固体基材，具有多个一维、二维或H维显微结构（micro structure)或者小尺度结构（micro-scalestruc1:ure)，在其上可W进行某些过程，如物 理、化学、生物学、生物物理学或生物化学过程等。显微结构或小尺度结构如通道和孔、电极 元件、电磁元件惨入于、建造于或者另外附着于所述基材上，W促进在该芯片上的物理学、 生物物理学、生物学、生物化学、化学反应或过程。所述芯片在一维可W是薄的，在其它维度 可具有不同形状，例如矩形、圆形、楠圆形或者其它不规则形状。本发明的芯片的主要表面 的大小可W大幅度变化，例如从大约Imm2至大约0. 25m2。优选地，芯片的大小是大约4mm2 至大约25cm2,特征性尺寸为大约Imm至大约5cm。芯片表面可W是平或不平的。具有不平 表面的芯片在其表面上可包含构造的通道或孔。
[0080] 应理解本文描述的本发明的方面和实施方案包括由方面和实施方案"组成"和/ 或"基本上组成"。
[0081] 在该个发明公开中，本发明的各个方面均W范围形式呈现。应理解范围形式的描 述只是为了方便和简洁，不应理解为对本发明范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应 被认为是具有特别掲示的所有可能的子范围W及该范围内的各个数值。例如，1-6范围的描 述应理解为具有特别掲示的子范围，如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，W及该范围内的各 个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何均如此适用。
[0082] 本发明的其它目的、优势和特征通过如下说明书结合附图将显而易见。
[0083] B.鉴别祀的抗体的方法
[0084] -方面，本发明涉及鉴别祀的抗体的方法，所述方法包括；a)提供得自对象如哺 乳动物的抗体文库，其中所述抗体文库包含少于1〇7个不同种类抗体；b)将所述祀与所述 抗体文库在适于所述祀与所述抗体文库中的抗体之间结合的条件下接触，如果该种抗体存 在于所述抗体文库中；及C)评估所述祀与所述抗体之间的结合，W鉴别所述抗体为所述祀 的抗体。
[0085] 任何合适的抗体文库均可用于本发明方法中。在一些实施方案中，抗体文库得自 免疫系统尚未被外来祀刺激的对象或哺乳动物。典型地，所述对象或哺乳动物尚未用分离 及纯化形式的祀免疫，或者至少未主动免疫。在一些实例中，所述对象或哺乳动物尚未用含 有所述祀的组合物免疫，或者至少未主动免疫。在其它实例中，所述对象或哺乳动物尚未用 其中所述祀组成其主要部分或百分比的组合物免疫，或者至少未主动免疫。例如，如果所述 祀是特定的多肤，则所述对象或哺乳动物可W用含有所述祀多肤的细胞、组织或生物体免 疫。然而，由于所述细胞、组织或生物体不含有有意义量的祀多肤，或者祀多肤不组成所述 细胞、组织或生物体的主要部分或百分比，则所述对象或哺乳动物仍被认为是未受外来祀 多肤刺激。
[0086] 在一些实施方案中，所述抗体文库中抗体的氨基酸序列先前是未知的。例如，抗体 文库中的抗体可通过适当的免疫得自宿主，抗体的氨基酸序列仍未知。在其它实例中，抗体 文库中的抗体通过适当的免疫而可W最初得自宿主。一旦获得抗体，则抗体的氨基酸序列 可W通过任何合适的方法确定，例如蛋白质测序方法。在该种情况中，抗体文库中抗体的氨 基酸序列先前是未知的，因为所述抗体不是从头合成的，而是用祀文库免疫产生的。相反， Maoetal.，化Uire,28 (11): 1195-1178 (2010)描述了抗体文库的重新合成，其抗体文库中 抗体的氨基酸序列先前已知。
[0087] 在一些实施方案中，抗体文库中的抗体包含完整（或完全）抗体分子。例如，如果 抗体文库中的抗体得自哺乳动物，则抗体文库中的抗体可包含完整（或完全）结构的IgG、 IgM、IgA、I曲和/或I班分子。如果抗体文库中的抗体得自禽类物种如鸡，则抗体文库中 的抗体可包含完整（或完全）结构的I巧分子。
[0088] 抗体文库可W使用任何合适的免疫原通过任何合适的方法产生。在一些实施方 案中，抗体文库是通过用多个多肤免疫哺乳动物产生的，所述多肤包含不同的随机的氨基 酸序列。所述多肤可包含任何合适数目的氨基酸。在一些实施方案中，所述多肤包含大约 5-100 个氨基酸，优选 10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90 或 10-100 个 氨基酸。所述多肤可包含任何合适类型氨基酸和/或氨基酸序列。在一些实施方案中，所 述多肤不包含切S，不包含3个或更多个相同的连续氨基酸，和/或不包含5个或更多个相 同的氨基酸。
[0089] 用于产生抗体文库的多肤可W通过任何合适的标准或方法选择。在一些实施方案 中，所述多肤通过如下标准选择；a)为所有候选多肤指定初始的相同分值；b)候选多肤中 每个潜在的糖基化位点则从初始分值中减去I点；C)候选多肤中每个Lys或Arg残基则从 初始分值中减去4点；及d)根据免疫哺乳动物希望的多肤数目选择具有最高可能分值的候 选多肤。
[0090] 任何合适数目的多肤均可用于免疫哺乳动物W产生抗体文库。在一些实施方案 中，至少10000个多肤用于免疫哺乳动物W产生抗体文库。在一些实施方案中，至少10000、 15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、 75000、80000、85000、90000、95000或100000个不同多肤用于免疫哺乳动物W产生抗体文 库。典型地，一个哺乳动物用较少数目的多肤免疫，多个哺乳动物的免疫覆盖指定数目的免 疫。在一些实施方案中，一个哺乳动物可W用大约1、2、3、4、5、10、15、20或25个不同多肤 免疫。例如，如果一个哺乳动物用10个不同多肤免疫，及100000个不同多肤指定使用，贝U 可W免疫10000个哺乳动物覆盖指定使用的100000个不同多肤。
[0091] 所述多肤可包含任何合适数目的氨基酸。在一些实施方案中，所述多肤可包含 5-100 个氨基酸，优选 10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90 或 10-100 个 氨基酸。在一些实施方案中，所述多肤可包含大约1〇、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20 个氨基酸。所述多肤可包含任何合适类型的氨基酸。在一些实施方案中，所述多肤可包含 天然和/或非天然氨基酸。所述多肤可W通过任何合适方法产生。在一些实施方案中，所 述多肤是通过化学合成和/或重组产生方法产生的。
[0092] 在一些实施方案中，所述多肤通过如下标准从候选多肤中选择；a)每个候选多肤 包含大约10个氨基酸，不包括切S;b)每个候选多肤不包含3个或更多个相同的连续氨基 酸；C)每个候选多肤不包含5个或更多个相同氨基酸油每个候选多肤指定初始分值为 10 ;e)候选多肤中每个潜在的糖基化位点则从初始分值中减去1点；f)候选多肤中每个 Lys或Arg残基则从初始分值中减去4点；及g)选择具有最高分值的至少10000个候选多 肤。
[0093] 任何合适的对象或哺乳动物均可用于产生抗体文库。在一些实施方案中，抗体文 库是由免疫系统尚未被有意刺激W产生指定祀的抗体的对象或哺乳动物产生。在一些实 施方案中，所述哺乳动物是小鼠，大鼠，兔，山羊，牛科动物如公牛、奶牛或水牛，犬科动物如 狗，猪科动物如猪，或者马。在一些实施方案中，所述哺乳动物可W是人。其它非哺乳动物 对象如禽类动物如鸡佑alius)也可用于产生抗体文库。其它举例的禽类动物包括鹤冀 (Co1:u;rnix)、火鸡（Meleagrisgallopavo)、鸭、鶴和日本鹤冀（Coturnixjaponica)。
[0094] 在一些实施方案中，抗体文库可W通过用完整的生物体、组织、细胞或者所述生物 体、组织或细胞的全部蛋白质提取物免疫对象或哺乳动物而产生，其中所述完整生物体、组 织、细胞与所述祀是免疫学不同的。例如，所述祀可W不或者可W不期望包含于用作免疫原 的所述完整生物体、组织、细胞或者所述生物体、组织或细胞的全部蛋白质提取物中。在另 一实例中，所述祀可W包含于用作免疫原的所述完整生物体、组织、细胞或者所述生物体、 组织或细胞的全部蛋白质提取物中，但是仅组成所述完整生物体、组织、细胞或者所述生物 体、组织或细胞的全部蛋白质提取物的一小部分或无意义部分。
[0095] 任何合适的完整生物体均可W使用。在一些实施方案中，可W使用拟南芥、小鼠、 大鼠、兔、牛、山羊、果禍、斑马鱼、秀丽隐杆线虫（Caenorh油ditiselegans)、水稻或玉米。
[0096] 任何合适的组织均可W使用。在一些实施方案中，可W使用血液、拟南芥芽、不同 发育阶段的秀丽隐杆线虫组织或者小鼠脑组织。
[0097] 任何合适的细胞均可W使用。在一些实施方案中，可W使用脾细胞、肿瘤细胞或细 胞系，例如人肿瘤细胞系。
[0098] 在一些实施方案中，抗体文库由用与所述祀免疫学不同的抗原免疫的哺乳动物产 生。
[0099] 在一些实施方案中，所述抗体文库；a)由用多个多肤免疫的哺乳动物产生，所述 多肤包含不同的随机的氨基酸序列；b)由其免疫系统未被有意刺激的哺乳动物产生；C)由 用完整生物体、组织、细胞或所述生物体、组织或细胞的全部蛋白质提取物免疫的哺乳动物 产生；d)由用与所述祀免疫学不同的抗原免疫的哺乳动物产生；或者e)上述a)-d)的任意 组合。
[0100] 所述抗体文库可包含任何合适类型的抗体。例如，所述抗体文库可包含多克隆抗 体、单克隆抗体和/或产生单克隆抗体的杂交瘤。抗体文库中的抗体在其从所述对象或哺 乳动物中获得后可W分离、纯化、处理和/或修饰。
[0101] 在一些实施方案中，抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。在免疫学中，亲和性成熟 是在免疫应答期间B细胞产生对于抗原具有增加的亲和性的抗体的过程。重复暴露于相同 抗原，宿主将产生持续更高亲和性的抗体。二次应答可引出与初次应答相比具有几个对数 倍增高的亲和性的抗体。与天然原型一样，体外亲和性成熟基于突变和选择的原理。体外 亲和性成熟已经成功用于优化抗体、抗体片段或其它肤分子如抗体模拟物。CDR内部的随 机突变可W使用任何合适方法导入，例如放射、化学诱变或者易错PCR。此外，遗传多样性 可W通过链改组而增加。使用展示方法如瞻菌体展示方法的两或H轮突变和选择循环通常 获得具有在低纳摩尔范围亲和性的抗体。见例如Roskosetal.，（2007).Stefanmibel. ed.HandbookofTherapeuticAntibodies.Weinheim:Wiley-VCH.PP. 145 - 169。
[0102] 抗体文库可包含任何合适数目的不同抗体。在一些实施方案中，抗体文库包含 至少 10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、 70000、75000、80000、85000、90000、95000 或 100000 个不同抗体。
[0103] 抗体文库中的抗体可W任何合适形式胆存、运输和/或使用。在一些实施方案 中，至少一些抗体固定在固体表面上。在一些实施方案中，至少1%、5%、10%、20%、30%、 40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或者所有抗体均固定在固体表面上。可W使用任 何合适的固体表面。例如，所述固体表面可W是管如试管的一部分、平板如微滴定平板上的 孔、珠、或者生物芯片。
[0104] 所述抗体文库可W任何合适方式或形式筛选。例如，可W获得杂交瘤细胞并从所 述杂交瘤细胞克隆抗体基因。抗体分子可W从编码基因中表达。抗体分子可W置于合适的 测定形式中，如ELISA平板，W进行筛选。在另一实例中，腹水或纯化的抗体可用于筛选。在 再一个实例中，可W直接培养杂交瘤细胞，并可W将上清用于筛选中。
[0105] 抗体文库可W在任何合适测定形式中筛选。在一些实施方案中，祀-抗体复合物 可W通过如下方式评估；酶联免疫吸附测定巧LISA)，免疫印迹，免疫沉淀，放射性免疫测 定化IA)，免疫染色，胶乳凝集，间接血凝测定（IHA)，补体结合，间接免疫英光测定（IFA)， 浊度法，流式细胞计量术，等离子共振测定，化学发光测定，侧向流免疫测定法，U-捕获测 定，抑制测定或者亲合力测定。在一些实施方案中，祀-抗体复合物可W在均质或异质测定 形式中评估。
[0106] 所述祀可W是任何合适的物质。举例的祀包括细胞、细胞器、病毒、颗粒、分子，或 者其聚集体或复合物，或者分子的聚集体或复合物。举例的细胞可W是有机或无机分子。 举例的有机分子可W是氨基酸，肤，蛋白质，如抗体或受体，核巧，核巧酸，寡核巧酸，核酸如 DNA或RNA，维生素，单糖，寡糖，碳水化合物，脂质，或其复合物。在一些实施方案中，所述祀 是多肤。举例的多肤包括线性多肤、可溶多肤、修饰的多肤、毒性多肤，或者导致对象中自身 免疫的多肤。
[0107] 所述祀可W任何合适的方式或顺序与抗体文库中的抗体接触。例如，所述祀可W 一次或同时与抗体文库中所有抗体接触。或者，所述祀可W与抗体文库中的部分抗体平行 或相继地接触。
[0108] 在一些实施方案中，所述祀与抗体文库中抗体亚组接触W确定所述抗体亚组是否 包含特异性结合所述祀的抗体。一旦确定所述抗体亚组包含特异性结合所述祀的抗体，贝U 该方法可进一步包括步骤：a)将所述抗体亚组分成更小的抗体亚组；及b)与所述祀接触W 确定所述更小的抗体亚组是否包含特异性结合所述祀的抗体。在一些实施方案中，可W重 复步骤a)和b)直至鉴别出特异性结合所述祀的各个抗体。
[0109] 本发明的方法可用于鉴别特异性结合任何合适数目祀的抗体。在一些实施方案 中，本发明的方法可用于鉴别特异性结合单个祀的抗体。在一些实施方案中，本发明的方法 可用于鉴别特异性结合多个祀如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 或 更多个祀的抗体。
[0110] 在一些实施方案中，将抗体文库与多个祀接触W鉴别特异性结合所述多个祀的抗 体或抗体组。在一些实施方案中，所述方法可进一步包括将多个祀的每一个与鉴别的抗体 或抗体组接触W鉴别特异性结合多个祀的每一个的抗体或抗体组。
[0111] 在一些实施方案中，所述方法可进一步包括；a)将鉴别的抗体或抗体组分成更小 的抗体亚组；及b)将多个祀的每一个与更小的抗体亚组接触W确定所述更小的抗体亚组 是否包含特异性结合多个祀的每一个的抗体。在一些实施方案中，可W重复步骤a)和b)， 直至鉴别出特异性结合多个祀的每一个的各个抗体。
[0112] 可W进行本发明的方法W获得鉴别特异性结合指定祀的抗体的任何合适的、预期 的或希望的成功率。通常，所述成功率依赖于一或多种因素，如祀的类型、祀的数目、抗体文 库的大小、抗体文库中抗体的类型和品质、产生抗体或抗体文库的过程W及筛选测定形式 等。在一些实施方案中，鉴别特异性结合祀的抗体的成功率是至少10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些实施方案中，所 述抗体文库包含至少10000个不同抗体，鉴别特异性结合祀的抗体的成功率为至少80%、 85%'90%'95%'96%'97%'98%'99% 或 100%。
[0113] 尽管上文使用得自哺乳动物的抗体文库描述或说明鉴别祀的抗体的方法，但是本 发明方法中也可W使用得自非哺乳动物对象如禽类动物如鸡的抗体文库。
[0114] 另一方面，本发明涉及特异性结合祀的抗体，其中所述抗体是通过上述方法鉴别 的。
[0115] C.抗体、抗体文库、多肤、多肤文库及其应用
[0116] 再一方面，本发明涉及抗体文库W鉴别祀的抗体，所述抗体文库得自对象或哺乳 动物及所述抗体文库包含少于1〇7个不同种类抗体。在一些实施方案中，所述抗体文库得 自免疫系统未被祀外来刺激的对象或哺乳动物。
[0117] 抗体文库可W通过任何合适方法产生。在一些实施方案中，抗体文库；a)是由用 多个多肤免疫的哺乳动物产生的，所述多肤包含不同的随机的氨基酸序列；b)是由免疫系 统未被有意刺激的哺乳动物产生的；C)是由用完整生物体、组织、细胞或者所述生物体、组 织或细胞的全部蛋白质提取物免疫的哺乳动物产生的；d)是由用与所述祀免疫学不同的 抗原免疫的哺乳动物产生的；或者e)上述a)-d)的任意组合。
[0118] 抗体文库可包含任何合适数目的抗体。在一些实施方案中，所述抗体文库包含 至少 10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、 70000、75000、80000、85000、90000、95000、或 100000 个不同抗体。
[0119] 抗体文库可包含任何合适类型的抗体。在一些实施方案中，抗体文库包含多克隆 抗体、单克隆抗体和/或产生单克隆抗体的杂交瘤。在一些实施方案中，抗体文库中抗体的 氨基酸序列先前是未知的。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体包含完整（或完全）抗 体分子。
[0120] 抗体文库中的抗体在其得自所述对象或哺乳动物之后可W被分离、纯化、处理和/ 或修饰。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。
[0121] 再一方面，本发明涉及多肤文库，所述多肤文库包含多个分离的包含不同的随机 氨基酸序列的多肤，其中所述多肤包含大约5-100个氨基酸，优选10-20、10-30、10-40、 10-50、10-60、10-70、10-80、10-90或10-100个氨基酸，所述多肤不包含切S、不包含3个或 更多个相同的连续的氨基酸，和/或不包含5个或更多个相同的氨基酸。在一些实施方案 中，所述多肤可包含大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
[0122] 所述多肤可W通过任何合适的标准或方法选择。在一些实施方案中，所述多肤通 过如下标准选择；a)为所有候选多肤指定初始的相同的分值；b)候选多肤中每个潜在的糖 基化位点则从初始分值中减去1点；C)候选多肤中每个Lys或Arg残基则从初始分值中减 去4点；及d)根据希望的多肤数目选择具有最高可能分值的候选多肤。
[0123] 所述多肤文库可包含任何合适数目的肤。在一些实施方案中，所述多肤文库包含 至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、60000、 70000、80000、90000、100000或更多个不同的多肤。在一些实施方案中，所述多肤文库包含 至少10000个不同的多肤。
[0124] 所述多肤可包含任何合适类型的氨基酸。在一些实施方案中，所述多肤可包含天 然和/或非天然氨基酸。所述多肤可W通过任何合适方法产生。在一些实施方案中，所述 多肤是通过化学合成和/或重组产生方法产生的。
[0125] 多肤文库可用于任何合适的目的。例如，多肤文库可用于产生抗体文库。
[0126] 再一方面，本发明涉及产生抗体文库的方法，所述方法包括；a)用上述多肤文库 免疫对象；及b)从所述对象回收抗体。
[0127] 抗体文库中的抗体在其得自所述对象或哺乳动物之后可W被分离、纯化、处理和/ 或修饰。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。在一些实施方案中，本发 明的方法可进一步包括使用上述多肤文库亲和性纯化从对象回收的抗体。
[012引所述对象可W用文库中的多肤W任何合适的方式或顺序免疫。典型地，单个对象 或哺乳动物用较少数目的多肤免疫，多个哺乳动物免疫覆盖指定数目的免疫。在一些实施 方案中，单个对象或哺乳动物可W用大约1、2、3、4、5、10、15、20或25个不同的多肤免疫。例 女口，如果单个哺乳动物用10个不同的多肤免疫及计划使用100000个不同的多肤，则可W免 疫10000个哺乳动物覆盖计划使用的100000个不同多肤。在一些实施方案中，一个对象或 哺乳动物用文库中一组大约5-20个多肤免疫例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19个不同多肤免疫，多个对象用文库中多组大约5-20个多肤免疫，大约5-20个多肤的 多个组涵盖文库中所有多肤。
[0129] 再一方面，本发明涉及抗体文库，其是通过本发明方法产生的。
[0130] 所述抗体文库可包含任何合适数目的抗体。在一些实施方案中，所述抗体文库 包含至少 10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、 65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000 或 100000 个不同抗体。抗体文库可包含 任何合适类型的抗体。在一些实施方案中，抗体文库包含多克隆抗体、单克隆抗体和/或产 生单克隆抗体的杂交瘤。在一些实施方案中，抗体文库中抗体的氨基酸序列先前是未知的。 在一些实施方案中，抗体文库中的抗体包含完整（或完全）抗体分子。
[0131] 抗体文库中的抗体在其得自所述对象或哺乳动物之后可W被分离、纯化、处理和/ 或修饰。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。
[013引再一方面，本发明涉及序列表（SEQIDNO: 1-55471)中列出的分离的多肤。在一 些实施方案中，本发明涉及序列表（SEQIDN0:l-55471)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8或9 个分离的多肤。所述分离的多肤可W是组合物、组合、复合物、试剂盒或者产品的任何合适 形式。所述分离的多肤可W通过任何合适方法产生，例如化学合成、重组产生或者其组合。
[0133] 再一方面，本发明涉及多肤文库，所述多肤文库包含序列表（SEQIDNO: 1-55471) 中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000 个或者所有分离的多肤。
[0134] 所述多肤文库可用于任何合适目的。例如，多肤文库可用于产生抗体文库。
[01巧]再一方面，本发明涉及产生抗体文库的方法，所述方法包括；a)用上述多肤文库 免疫对象；及b)从所述对象中回收抗体。
[0136] 抗体文库中的抗体在其从所述对象或哺乳动物中获得之后可W被分离、纯化、处 理和/或修饰。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。在一些实施方案 中，本发明的方法可进一步包括使用上述多肤文库对自所述对象中回收的抗体进行亲和性 纯化。
[0137] 再一方面，本发明涉及抗体文库，其是通过上述方法产生的。
[0138] 抗体文库可包含任何合适数目的抗体。在一些实施方案中，所述抗体文库包含 至少 10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、 70000、75000、80000、85000、90000、95000、或 100000 个不同抗体。
[0139] 抗体文库可包含任何合适类型的抗体。在一些实施方案中，抗体文库包含多克隆 抗体、单克隆抗体和/或产生单克隆抗体的杂交瘤。在一些实施方案中，抗体文库中抗体的 氨基酸序列先前是未知的。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体包含完整（或完全）抗 体分子。
[0140] 抗体文库中的抗体在其从所述对象或哺乳动物中获得后可W被分离、纯化、处理 和/或修饰。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。
[014。 再一方面，本发明涉及分离的抗体，其特异性结合序列表（SEQIDNO: 1-55471) 中列出的多肤。在一些实施方案中，本发明涉及分离的抗体，其特异性结合序列表（SEQID NO: 1-55471)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8或9个分离的多肤。所述分离的抗体可W是组 合物、组合、复合物、试剂盒或产品的任何合适形式。分离的抗体可W通过任何合适方法产 生，例如免疫宿主、各种展示技术如瞻菌体展示技术、杂交瘤技术、重组产生或者其组合。
[0142] 再一方面，本发明涉及抗体文库，所述抗体文库包含特异性结合序列表（SEQ IDN0:l-55471)中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、 40000、45000、50000个或者所有多肤的抗体。
[0143] 抗体文库可包含任何合适类型的抗体。在一些实施方案中，抗体文库包含多克隆 抗体、单克隆抗体和/或产生单克隆抗体的杂交瘤。在一些实施方案中，抗体文库中抗体的 氨基酸序列先前是未知的。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体包含完整（或完全）抗 体分子。
[0144] 抗体文库中的抗体在其得自所述对象或哺乳动物之后可W被分离、纯化、处理和/ 或修饰。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。
[0145] D.鉴别祀抗体的肤抗原性序列的方法
[0146] 再一方面，本发明涉及鉴别祀抗体的肤抗原性序列的方法，所述方法包括；a)将 祀抗体与多肤文库在适于所述祀抗体与所述多肤文库中多肤之间结合的条件下接触，如果 该种多肤存在于所述多肤文库中的话，所述多肤文库包含序列表（SEQIDNO: 1-55471)中 列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000 个或者所有分离的多肤；及C)评估所述祀抗体与所述多肤之间的结合，W鉴别所述祀抗体 的肤抗原性序列。
[0147] 所述祀抗体可W与多肤文库中的多肤W任何合适方式或顺序接触。例如，所述祀 抗体与多肤文库中的所有多肤可W-次或同时接触。或者，祀抗体可W与多肤文库中的一 部分多肤平行或相继接触。
[014引在一些实施方案中，将祀抗体与多肤文库中的多肤亚组接触W确定所述多肤亚组 是否包含特异性结合祀抗体的多肤。一旦确定了所述多肤亚组包含特异性结合祀抗体的多 肤，则所述方法可进一步包括；a)将所述多肤亚组分成更小的多肤亚组；及b)将祀抗体与 所述更小的多肤亚组接触W确定该个更小的多肤亚组是否包含特异性结合祀抗体的多肤。 可W重复步骤a)和b)，直至鉴别出特异性结合祀抗体的各个多肤。
[0149] 本发明的方法可用于鉴别单个祀抗体的肤抗原性序列。本发明的方法也可W用于 鉴别多个祀抗体的肤抗原性序列。
[0150] 一旦鉴别出祀抗体的肤抗原性序列，则本发明的方法可包括进一步的鉴别后步 骤。在一些实施方案中，所述方法可进一步包括分离特异性结合祀抗体的多肤。在一些实 施方案中，所述方法可进一步包括确定分离的多肤的氨基酸序列。
[0151] 本发明的方法可用于任何合适的目的。在一些实施方案中，本发明的方法可用于 鉴别祀抗体的肤抗原性序列，所述祀抗体是生物标记，例如诊断或预后生物标记。
[0152]E.特定祀的分离的抗体
[0153] 再一方面，本发明涉及特异性结合Akt的分离的抗体，所述分离的抗体特异性结 合氨基酸序列孤GGQKAVKD中包含的表位。
[0154] 再一方面，本发明涉及特异性结合ERK2的分离的抗体，所述分离的抗体特异性结 合氨基酸序列HPLGSPGSAS中包含的表位。
[0155] 再一方面，本发明涉及特异性结合Desmin的分离的抗体，所述分离的抗体特异性 结合氨基酸序列REIRRYQKST中包含的表位。
[0156] 再一方面，本发明涉及特异性结合CBL4的分离的抗体，所述分离的抗体特异性结 合氨基酸序列RSRA服QAYT中包含的表位。
[0157] 再一方面，本发明涉及特异性结合霍乱毒素的分离的抗体，所述分离的抗体特异 性结合氨基酸序列FEEREQANTA、EYQQAQLEAE或DSSMSMADSE中包含的表位。
[015引再一方面，本发明涉及特异性结合VEGF的分离的抗体，所述分离的抗体特异性结 合氨基酸序列VLDFILSMGL、AKRKAGTSPR或RNSDFSAGSP中包含的表位。
[0159] 上述抗体可W是任何合适类型的抗体。在一些实施方案中，所述抗体可W是多克 隆抗体、单克隆抗体和/或产生单克隆抗体的杂交瘤。
[0160] 上述抗体可W通过任何合适方法产生，通过用祀多肤免疫宿主、通过瞻菌体展示 或者重组产生方法等。上述抗体可W进一步被纯化、处理和/或修饰。在一些实施方案中， 上述抗体可W是亲和性成熟的。
[0161]F.鉴别与病症相关的祀的方法
[0162] 再一方面，本发明涉及鉴别与病症相关的祀的方法，所述方法包括；a)将得自患 有病症的来源的样品与抗体文库接触，并评估所述样品中的物质与所述抗体文库中的抗体 之间的结合或缺乏结合情况，其中所述抗体文库得自对象或哺乳动物，优选免疫系统未被 祀外来刺激，所述抗体文库包含少于1〇7个不同种类的抗体，或者所述抗体文库是通过用多 肤文库免疫对象或哺乳动物获得的，所述多肤文库包含多个分离的包含不同的随机的氨基 酸序列的多肤，其中所述多肤包含大约10-20个氨基酸，所述多肤不包含切S、不包含3个或 更多个相同的连续的氨基酸，和/或不包含5个或更多个相同的氨基酸，或者所述抗体文库 是通过用多肤文库免疫对象获得的，所述多肤文库包含序列表（SEQIDNO: 1-55471)中列 出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000 个 或者所有分离的多肤；b)将得自不具有所述病症的来源的样品与上述抗体文库接触，并评 估所述样品中的物质与所述抗体文库中抗体之间的结合或缺乏结合情况；及C)当步骤a) 和b)中所述物质与所述抗体之间的结合或缺乏结合存在差别时，鉴别物质为与所述病症 相关的祀。
[0163] 本发明的方法可用于任何合适目的。在一些实施方案中，本发明的方法用于鉴别 与对象中病症相关的祀。在一些实施方案中，本发明的方法用于鉴别与疾病或失调相关的 祀。
[0164] 本发明的方法可用于鉴别与一种病症相关的祀。或者，本发明的方法可用于鉴别 与病症相关的多个祀。再或者，本发明的方法可用于鉴别与一种病症相关的多个祀。再或 者，本发明的方法可用于鉴别与多种病症相关的多个祀。
[0165] 所述物质与抗体之间的结合或缺乏结合中的差别可W通过任何合适方式评估。在 一些实施方案中，步骤a)和b)中所述物质与抗体之间的结合或缺乏结合中的差别是定性 的。在一些实施方案中，步骤a)和b)中所述物质与抗体之间的结合或缺乏结合的差别是 定量的。在一些实施方案中，步骤a)中所述物质与抗体之间的结合及步骤b)中所述物质 与抗体之间的缺乏结合鉴别出所述物质为与所述病症相关的祀。在一些实施方案中，步骤 a)中所述物质与抗体的缺乏结合及步骤b)中所述物质与抗体的结合鉴别出所述物质是与 所述病症相关的祀。
[0166] 所述祀可W是任何合适的物质。举例的祀包括细胞、细胞器、病毒、颗粒、分子，或 者其聚集体或复合物，或者分子的聚集体或复合物。举例的细胞可W是有机或无机分子。举 例的有机分子可W是氨基酸，肤，蛋白质，例如抗体或受体，核巧，核巧酸，寡核巧酸，核酸， 如DNA或RNA，维生素，单糖，寡糖，碳水化合物，脂质，或者其复合物。在一些实施方案中，所 述祀是多肤。举例的肤包括线性多肤、可溶多肤、修饰的多肤、毒性多肤或者导致对象中自 身免疫的多肤。
[0167] 再一方面，本发明涉及鉴别与病症相关的祀的方法，所述方法包括；a)将得自患 有病症的来源的样品与多肤文库接触，所述多肤文库包含多个分离的包含不同的随机氨基 酸序列的多肤，其中所述多肤包含大约10-20个氨基酸，所述多肤不包含切S、不包含3个 或更多个相同的连续的氨基酸，和/或不包含5个或更多个相同的氨基酸，或者多肤文库包 含序列表（SEQIDN0:l-55471)中列出的至少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、 30000、35000、40000、45000、50000个或所有分离的多肤，并评估所述样品中的物质与所述 多肤文库中多肤之间的结合或缺乏结合；b)将得自不具有所述病症的来源的样品与上述 多肤文库接触，并评估所述样品中的物质与所述多肤文库中多肤之间的结合或缺乏结合； 及C)当步骤a)和b)中所述物质与所述多肤之间的结合或缺乏结合中存在差别时，则鉴别 物质为与所述病症相关的祀。
[016引本发明的方法可用于任何合适目的。在一些实施方案中，本发明的方法用于鉴别 与对象中病症相关的祀。在一些实施方案中，本发明的方法用于鉴别与疾病或失调相关的 祀。
[0169] 本发明的方法可用于鉴别与一种病症相关的祀。或者，本发明的方法可用于鉴别 与病症相关的多个祀。再或者，本发明的方法可用于鉴别与一种病症相关的多个祀。再或 者，本发明的方法可用于鉴别与多种病症相关的多个祀。
[0170] 所述物质与抗体之间的结合或缺乏结合的差别可W任何合适方式评估。在一些实 施方案中，在步骤a)和b)中所述物质与多肤之间的结合或缺乏结合中的差别是定性的。在 一些实施方案中，步骤a)和b)中所述物质与多肤之间的结合或缺乏结合中的差别是定量 的。在一些实施方案中，步骤a)中所述物质与多肤的结合及步骤b)中所述物质与多肤的 缺乏结合鉴别出所述物质是与所述病症相关的祀。在一些实施方案中，步骤a)中所述物质 与多肤之间的缺乏结合与步骤b)中所述物质与多肤之间的结合鉴别出所述物质是与所述 病症相关的祀。
[0171] 所述祀可W是任何合适的物质。举例的祀包括细胞、细胞器、病毒、颗粒、分子，或 者其聚集体或复合物，或者分子的聚集体或复合物。举例的细胞可W是有机或无机分子。举 例的有机分子可W是氨基酸，肤，蛋白质，例如抗体或受体，核巧，核巧酸，寡核巧酸，核酸， 如DNA或RNA，维生素，单糖，寡糖，碳水化合物，脂质，或者其复合物。在一些实施方案中，所 述祀是多肤。举例的多肤包括线性多肤，可溶多肤，修饰的多肤，毒性多肤或者导致对象中 自身免疫的多肤。在一些实施方案中，所述祀包含抗体。
[0172]G.举例的实施方案
[0173] 除非特别指出，本文使用的所有技术和科学术语均具有本领域已知的其通常的含 义。除非特别指出，所有专利、专利申请、出版物、GenBank序列、网站及其它掲示的材料均 并入本文作参考。
[0174] 关于蛋白质的抗体，其通常仅识别蛋白质的几个氨基酸。当针对随机的氨基酸序 列制备的不同抗体的数目是足够的时，该些抗体可构成抗体文库。使用该种文库，可W针对 感兴趣的蛋白质进行筛选，W获得能识别所述蛋白质的抗体。
[0175] 此外，关于特定的生物体，如小鼠，如果其某一组织的总蛋白质提取物用于免疫动 物，然后可W制备相应的抗体文库，该种抗体文库也可W用于筛选对所述生物体某一蛋白 质具有高亲和性的抗体。初次用于实验的哺乳动物可用于进行杂交瘤融合，W筛选能分泌 IgG抗体的杂交瘤细胞，该些杂交瘤细胞也可W用于构建抗体文库W筛选抗体。
[0176] 因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体文库W筛选抗体，及使用所述抗体文 库筛选感兴趣的蛋白质的抗体的方法。特别地，本发明涉及具有至少10000个不同成员的 抗体文库，其可用于筛选对感兴趣的蛋白质具有高亲和性的抗体。
[0177] 一方面，本发明提供了抗体文库，其包含；（1)针对具有10-20个氨基酸的随机肤 的抗体，（2)IgG抗体，由从初次用于实验的哺乳动物的脾细胞产生的杂交瘤细胞分泌，（3) IgG抗体，由从通过总蛋白质提取物免疫的哺乳动物的脾细胞产生的杂交瘤细胞分泌，所述 蛋白质提取物来自完整生物体、其一或多种组织、和/或其一或多个细胞，（4)IgG抗体，由 针对一或多个抗原建立的稳定杂交瘤株分泌；或者（1)-(4)的任意组合。
[0178] 在一些实施方案中，术语"抗体文库"是指一系列抗体的集合，其可含有不同来源 的抗体，如针对特定表位产生的抗体，或者针对感兴趣的蛋白质的随机肤产生的抗体。
[0179] 本发明的抗体文库可W是具有单一来源的抗体的抗体文库；其也可W是不同来源 的抗体的抗体文库混合物。
[0180] 在一些实施方案中，术语"初次用于实验的哺乳动物"是指从未使用实验方式刺激 或处理的动物。在一些实施方案中，其特别是指从未用外源抗原接种或免疫的动物，所述动 物可W是小鼠、大鼠、兔等。
[0181] 在一些实施方案中，术语"总蛋白质提取物"是指源自完整生物体、其组织或其细 胞的所有蛋白质的集合。所述生物体可W是多种模型生物体，如拟南芥、小鼠、鼠、兔、牛、山 羊、果禍、斑马鱼、烧虫、玉米或者水稻等。
[018引在一些实施方案中，本文所用术语"随机肤"是指随机产生的氨基酸序列，其中所 述氨基酸选自天然氨基酸或其类似物。在本发明中，随机肤的长度可W是例如10-20个氨 基酸，例如10个氨基酸的随机肤。
[0183] 在一个实施方案中，本发明的随机肤；1)不含有半脫氨酸，2)不含有3个或更多个 连续相同的氨基酸，和/或3)不含有5个或更多个相同氨基酸。
[0184] 在一个实施方案中，每个随机肤的初始分值设定为任何值，通过如下过程选择随 机肤；1)对于具有潜在糖基化位点的氨基酸，每个潜在的糖基化位点从所述分值中减去1 点，2)每个氨基酸K或R从所述分值中减去4点；基于上述分值，从上至下选择具有最高分 值的希望数目的肤。
[0185] 在一个实施方案中，本发明的随机肤通过如下步骤选择；1)随机产生具有10-20 个氨基酸的肤序列，其不含有半脫氨酸，2)每个随机肤的初始分值等于其中含有的氨基酸 的数目；对于具有潜在糖基化位点的氨基酸，每个潜在的糖基化位点从所述分值中减去1 点，3)具有10-20个氨基酸的所述肤序列不允许含有3个或更多个连续的相同氨基酸，4) 具有10-20个氨基酸的所述肤序列不允许含有5个或更多个相同氨基酸，5)具有10-20个 氨基酸的所述肤序列中每个氨基酸K或R从所述分值中减去4点。基于上述评分原则，从 上至下选择具有最高分值的肤。
[0186] 在一个实施方案中，从上选择例如10000个具有最高分值的肤。在另一实施方案 中，从上选择例如 15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、 65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000 或 100000 个具有最高分值的肤。在一个实 施方案中，选择的随机肤是化学合成的。
[0187] 在一特定实施方案中，使用具有10个氨基酸的随机肤为实例，随机肤的选择可例 如包括如下步骤；1)随机产生具有10个氨基酸的肤序列，其不含有半脫氨酸；2)肤序列的 淘选原则：每个随机产生的肤的初始分值设定为10 ;对于具有潜在糖基化位点的氨基酸， 每个潜在的糖基化位点从所述分值中减去1点；3)具有10个氨基酸的所述肤序列不允许 含有3个或更多个连续的相同氨基酸；4)具有10个氨基酸的所述肤序列不允许含有5个 或更多个相同氨基酸；及5)所述肤序列中每个氨基酸K或R从所述分值中减去4点。
[0188] 基于上述评分原则，可W从上至下选择具有最高分值的10000个肤，然后可W化 学合成。
[0189] 在本发明的一个实施方案中，所述随机肤可W通过多种方法获得，如化学合成、重 组表达等。该种技术手段为本领域熟知。
[0190] 动物的免疫可W使用本领域已知的任何方法进行。用于本发明中进行免疫的动物 可W是本领域常用的动物，如小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、马、牛等。
[0191] 在一个实施方案中，所述抗体文库包含至少10000个不同成员，所述抗体文库当 用于筛选感兴趣的蛋白质的抗体时的成功率为至少85%。在另一实施方案中，本发明的 抗体文库中的成员数目通过添加新抗体而可W进一步增加，如至少15000、20000、25000、 30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、 90000、95000、100000个不同抗体及甚至更多。随着抗体文库中抗体量的增加，所述抗体文 库筛选感兴趣的蛋白质的抗体的成功率也因此增加，如86%、87%、88%、89%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及甚至更高。随着文库内容的增加，所述成功 率可接近100%。
[0192] 在一个实施方案中，本发明的抗体文库是杂交瘤细胞文库形式。
[019引关于杂交瘤技术的详细介绍可见于例如Bazin,Rathybridomasandrat monoclonalantibodies,CRCPress, 1990 ；Goding,Monoclonalantibodies:principles andpractice,3"edition,AcademicPress, 1996；ShepherdandDeanMonoclonal Antibodies,OxfordUniversityPress, 2000 等。
[0194] 使用随机肤产生的本发明的抗体文库可含有抗体的不同集合，如单克隆抗体的集 合，多克隆抗体的集合。在一个实施方案中，本发明的抗体文库含有针对一个物种所有蛋白 质的抗体。在另一实施方案中，本发明的抗体文库含有针对感兴趣的一或多个蛋白质的所 有表位的抗体。
[0195] 在一个实施方案中，本发明的抗体文库存在于高通量筛选装置中。
[0196] 在一个实施方案中，本发明中使用的高通量筛选装置是生物芯片，如蛋白质芯片， 或者 1 油-〇n-a-chip(LOC)D
[0197] 在一些实施方案中，术语"高通量筛选装置"是指可用于进行高通量筛选（HT巧的 装置。高通量筛选是指使用分子水平或细胞水平的实验手段为基础，进行自动操作W在微 平板形式的实验载体上进行实验过程，使用检测仪器收集实验数据，然后使用计算机分析 并处理实验数据。高通量筛选装置和技术可用于同时检测大量不同样品，其可W与本发明 的抗体文库组合W实现快速有效筛选抗体的目的。
[019引常用的高通量筛选装置包括生物芯片。生物芯片是一种微阵列技术，可用于高通 量筛选生物学样品。关于生物芯片，借助于显微处理和微电子技术，可W将具有已知序列的 大量核酸或蛋白质片段有序地排列在微玻片的表面上。待检测样品的相应成分或活性可W 通过与标记的核酸或蛋白质分子反应而分析。生物芯片典型可W分为H种不同类型，即基 因芯片、蛋白质芯片和1油-on-a-chip(LOC)。
[0199] 蛋白质芯片是分析蛋白质功能的一种高通量技术，其可用于分析蛋白质的表达 谱、研究蛋白质之间的相互作用及研究DNA与蛋白质W及RNA与蛋白质之间的相互作用。
[0200]Ub-on-a-chip是使用芯片作为平台的一种显微分析系统，其可W在生物芯片上 整合基本的操作单元如样品的制备和/或筛选及产物的分离和/或检测，W完成不同的生 物学或化学反应过程，从而分析所述产物。使用lab-on-a-chip，本发明的抗体的筛选、检 测和/或分离可W在一个芯片上快速有效进行。关于Ub-on-a-chip的详细描述可见于 例女口Herold,KE;Rasooly,A(eds) :Lab-〇n-a-ChipTechnology:BiomolecularSeparation andAnalysi,CaisterAcademicPress(2009)及EdwinOosterbroek&A.vandenBe rg(eds. ):Lab-on-a-Chip:Miniaturizedsystemsfor(bio)chemicalanalysisand synthesis,ElsevierScience,secondedition(2003)等。
[0201] 在一个实施方案中，对本发明抗体文库中的抗体进行亲和性成熟。在一特定实施 方案中，本发明的抗体文库可用于基于相对小量文库成员获得具有高亲和性的抗体。
[0202] 术语"亲和性成熟"的含义为本领域熟知，可见于例如Dong,Zhiweiet al.=AntibodyEngineering,BeijingMedicalUniversityPublications(2002)。典型地， 术语"亲和性成熟"是指在用特定抗原免疫动物之后，因此产生和分离的抗体是结构重排及 重构的，W便所述蛋白质对于特定抗原的亲和性可W增加例如3-4个数量级。在一些实施 方案中，进行亲和性成熟的抗体是所有IgG亚型抗体。因此，在对抗体文库中的抗体进行亲 和性成熟的情况中，从该个抗体文库中筛选具有高亲和性的抗体的可能性将大大增加。
[0203] 另一方面，本发明提供了包含本发明抗体文库的组合。
[0204] 本发明的抗体文库可W是组合形式，例如所述抗体文库的抗体成员可W制备为一 定浓度的抗体溶液（制备方法包括腹水及体外培养等）。制备的抗体溶液可W化ISA平板 形式胆存（例如96或384孔平板），或者W芯片形式胆存。
[0205] 或者，编码所述抗体文库中抗体成员的基因也可W自细胞株系中克隆，然后所述 基因可用于制备抗体。
[0206] 另一方面，本发明提供了生物芯片，其包含本发明的抗体文库。
[0207]另一方面，本发明提供了筛选感兴趣的蛋白质的抗体的方法，包括使用本发明的 抗体文库、本发明的组合或者本发明的生物芯片筛选针对所述感兴趣的蛋白质的一或多个 抗体。
[020引在一些实施方案中，术语"感兴趣的蛋白质"或者"感兴趣的多肤"或者"感兴趣的 肤"在本文可W互换使用，其均是指任何天然蛋白质或其片段，或者通过可变剪接获得的天 然蛋白质的同种型，或者天然蛋白质的突变体，或者上述蛋白质的任意组合。
[0209] 在一些实施方案中，本文所用术语"可变剪接"是指从同一mRNA前体中通过不同 的剪接模式（即通过不同的剪接位点组合外显子）产生不同的HiRNA剪接同种型的过程。通 过可变剪接获得的蛋白质产物彼此是同种型，其可W呈现出不同功能和结构性质，或者由 于其在相同细胞中的不同表达水平而可W产生不同的表型。
[0210] 在一个实施方案中，本发明的方法包括；(a)将所述感兴趣的蛋白质与所述抗体 文库的抗体或抗体组混合，及化）选择能结合所述感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组。
[0211] 在一个实施方案中，本发明的方法包括；(a)将所述感兴趣的蛋白质与所述抗体 文库的抗体或抗体组混合，化）选择能结合所述感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组，（C)将所 述感兴趣的蛋白质与在步骤化）中选择的抗体或抗体组的抗体亚组混合，及（d)选择能结 合所述感兴趣的蛋白质的抗体或抗体亚组。在另一实施方案中，本发明的方法进一步包括 使用在步骤（d)中选择的抗体亚组重复步骤（C)和（d)，直至选择出能结合所述感兴趣的蛋 白质的抗体。
[0212] 在另一实施方案中，本发明的方法包括针对几个感兴趣的蛋白质同时筛选，包括： (a)将所述几个感兴趣的蛋白质与所述抗体文库的抗体或抗体组混合，化）选择能结合所 述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组，（C)将所述几个感兴趣的蛋白质的每一个单独与 在步骤化）中选择的能结合所述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组混合，然后分别选择 能结合所述几个感兴趣的蛋白质的每一个的抗体或抗体组。
[0213] 在另一实施方案中，本发明的方法包括针对几个感兴趣的蛋白质同时筛选，包括： (a)将所述几个感兴趣的蛋白质与所述抗体文库的抗体或抗体组混合，化）选择能结合所 述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组，（C)将所述几个感兴趣的蛋白质的每一个单独与 在步骤化）中选择的能结合所述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组混合，然后分别选择 能结合所述几个感兴趣的蛋白质的每一个的抗体或抗体组，（d)将所述几个感兴趣的蛋白 质的每一个单独与在步骤（C)中选择的能结合各个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组的抗 体亚组混合，及（e)分别选择能结合所述几个感兴趣的蛋白质的每一个的抗体或抗体亚 组。在另一实施方案中，本发明的方法进一步包括使用在步骤（e)中选择的抗体亚组重复 步骤（d)和（e)，直至分别选择出能结合所述几个感兴趣的蛋白质的每一个的抗体。
[0214] 在一些实施方案中，术语"抗体组"是指不同抗体的混合物，其可含有几个、几十 个、几百个或者几千个不同的抗体。抗体组可W进一步分成含有不同抗体的几个抗体亚组。
[0215] 在一特定实施方案中，本领域技术人员根据特定需求可W将抗体文库分成几个抗 体组，如含有几个、几十个、几百个或几千个不同抗体的组。例如，含有10000个抗体的抗体 文库可分成100个组，每组含有100个不同的抗体。将感兴趣的蛋白质单独与每组混合，然 后选择可W结合所述感兴趣的蛋白质的组。该种组可用于进一步筛选。例如，上述选择的 含有100个抗体的抗体组可W进一步分成10个亚组，每个亚组含有10个抗体。将感兴趣 的蛋白质单独与每个亚组混合，然后选择可W结合所述感兴趣的蛋白质的亚组。根据该种 策略，可W重复进行所述筛选，直至选择出可W结合所述感兴趣的蛋白质的抗体。
[0216]在一个实施方案中，所述抗体可直接使用或者在稀释后使用，优选其W相同浓度 使用。例如，可W将不同的抗体均稀释为100yg/ml，可W取等体积的抗体溶液及随后混合， W获得含有不同抗体的组。W此方式，几十至几千个抗体可W制备为抗体组组合。本领域技 术人员可W选择适合所述抗体的稀释液体，如肥阳S溶液，例如含有2mg/mlProclin300、 I%BSA、pH7. 4的肥阳S溶液。
[0217]本发明中使用的筛选方法可W是化ISA、斑点印迹或蛋白质芯片W及可证实蛋白 质与抗体之间相互作用的其它检测方法。该些方法均是本领域熟知的技术手段。
[021引在一个实施方案中，本发明的方法可用于筛选线性多肤的抗体。
[0219]术语"线性多肤"是指在蛋白质中连续的氨基酸序列。
[0220] 在一个实施方案中，本发明的方法可用于筛选可溶多肤的抗体。
[0221] 在一个实施方案中，本发明的方法可用于筛选修饰的多肤的抗体。
[0222] 术语"修饰的多肤"、"修饰的蛋白质"和"修饰的肤"在本文可互换使用，其均是指 已经被修饰或翻译后修饰的蛋白质或多肤，如已经磯酸化、甲基化或己醜化的蛋白质或多 肤。
[0223]本发明的抗体文库可用于产生分别针对修饰的多肤和未修饰的前体多肤（也称 作区别多肤，即未被翻译后修饰的多肤形式）的不同抗体。对于所述多肤是阳性的细胞株 系可用于分别检测修饰的多肤和未修饰的多肤的效价。当该两个效价之间的差别达到某种 程度时，如大于8 [单位？]，则所述抗体被认为能区分该两种多肤。
[0224]在一个实施方案中，本发明的方法可用于筛选毒性多肤的抗体。术语"毒性多肤" 和"毒性蛋白质"在本文可互换使用，其均是指在动物或在细胞中可产生毒性的蛋白质或多 肤。由于其毒性，常规的抗体制备方法不可用于产生对所述毒性多肤具有高亲和性的抗体。
[0225]在一个实施方案中，本发明的方法可W使用高通量筛选装置进行。在一个 实施方案中，本发明方法中使用的高通量筛选装置是生物芯片，如蛋白质芯片，或者 lab-〇n-a-chip(LOC)D
[0226]另一方面，本发明还涉及本发明的抗体文库在制备筛选针对感兴趣的蛋白质的抗 体的装置或试剂盒中的应用。在一个实施方案中，所述装置是高通量筛选装置。在另一实 施方案中，所述高通量筛选装置是生物芯片，如蛋白质芯片，或者1油-on-a-chip化OC)。
[0227]使用本发明的抗体文库，可W获得针对不同类型蛋白质（线性、可溶、未修饰的、 修饰的）的抗体。使用本发明的抗体文库获得的50%W上的抗体的亲和性低于lOOnM。获 得可用细胞株系的可能性在万分之几至几万分之一之间，该较常规的展示技术高得多。对 于常规的瞻菌体展示文库，尽管文库的含量达到1〇6水平，但是从中筛选可用抗体的成功率 几乎为0,该是由于获得的抗体的亲和性通常不能满足应用要求。
[022引本发明的抗体文库基于相对特异性原理，所述抗体文库含有针对几万个抗原的抗 体，从而可W在短时间内（如一周）获得对于祀抗原具有高亲和性的单克隆抗体。该个时 间及其成本较常规单克隆技术低得多。对于正常的蛋白质抗原，由此获得的抗体的亲和性 当与W常规方法获得的抗体相比时示出无实际差别。此外，本发明的抗体文库的含量持续 增加，随着文库含量的增加，筛选抗体的成功率将由此迅速增加。
[0229]另外，本发明的筛选方法也可用于筛选针对抗原的抗体，所述抗原的抗体不能使 用常规方法制备，如毒性抗原或者自身免疫性抗原。
[0230] 本发明实现了W低成本及高通量方式制备具有高亲和性的抗体的技术方法，其可 用于在短时间内制备抗体。本发明的抗体文库W及筛选方法也可W与高通量技术如蛋白质 芯片组合。
[0231] D.实施例
[0232] 本发明通过如下实施例进一步详细描述。提供该些实施例只是说明目的，不应理 解为限制本发明的范围。具体地，本发明含有如下实施例：
[0233] 实施例1描述了含有10000个抗体的抗体文库的构建，及证实筛选20个不同蛋白 质的抗体的成功率为85% ;
[0234] 实施例2描述了含有50000个抗体的抗体文库的构建；
[0235] 实施例3描述了筛选修饰的肤的抗体；
[0236] 实施例4描述了筛选及检测邸K2蛋白质的抗体；
[0237] 实施例5描述了筛选及检测可溶蛋白质Desmin的抗体；
[023引实施例6描述了筛选毒性蛋白质霍乱毒素的抗体，及获得的抗体的亲和性成熟；
[0239] 实施例7描述了筛选不溶蛋白质的抗体；及
[0240] 实施例8描述了抗体生物芯片的制备，及使用所述生物芯片筛选人血管内皮生长 因子（VEG巧的抗体。
[0241] 实施例1 ;抗体文库的构建
[0242] 该个实施例描述了举例的抗体文库的构建。 。24引A.体巧随化化产牛杭体
[0244] 随机肤的产生：
[0245] i.随机产生具有10个氨基酸的肤序列，其不含有半脫氨酸；
[0246] ii.所述肤序列的淘选原理：每个随机产生的肤的初始分值设定为10 ;对于具有 潜在糖基化位点的氨基酸，每个潜在糖基化位点从所述分值中减去1点；
[0247] iii.具有10个氨基酸的所述肤序列不含有3个或更多个连续的相同氨基酸； [024引iv.具有10个氨基酸的所述肤序列不含有5个或更多个相同氨基酸；
[0249]V.所述肤序列中每个氨基酸K或R从所述分值中减去4点；及
[0巧0] Vi.基于上述分值，从上至下选择具有最高分值的10000个肤，然后化学合成（合 成方法可见于QiemistryofP巧tideSynthesis,N.LeoBenoiton, 2005)。
[0251]肤抗原的制备、免疫方法及单克隆抗体的制备均是本领域已知的常用技术， 关于该些技术的描述可见于相关出版物和教材，例如Bazin,Rathybridomasandrat monoclonalantibodies,CRCPress, 1990 ；Goding,Monoclonalantibodies!principles andpractice,3"edition,AcademicPress,1996；ShepherdandDeanMonoclonal antibodies,OxfordUniversityPress, 2000等。 。巧引 B.体巧初次巧于连輪的小鼠的脾细胸产牛杭体
[0巧；3] 制备单克隆抗体的方法可见于例如Bazin,Rathybridomasandrat monoclonalantibodies,CRCPress, 1990 ；Goding,Monoclonalantibodies!principles andpractice,3"edition,AcademicPress, 1996；ShepherdandDeanMonoclonal antibodies,OxfordUniversityPress, 2000等。
[0254] 从未进行免疫的小鼠脾中取淋己细胞，然后通过细胞融合制备杂交瘤细胞；使用 山羊抗小鼠IgG抗体（Abmart, 20100815)检测可W分泌抗体的杂交瘤细胞。
[0255] 特别地，将山羊抗小鼠IgG抗体使用0.OlMNa2C〇3/NaHC〇3缓冲液（pH9. 0)稀释为 1yg/ml，然后加入具有高吸附容量的96孔ELISA平板（SYBI0,化ngzhou，China)中，在每 孔中加入IOOy1，在4°C包被过夜，用PBST洗涂3次，每次加入250y1/孔洗涂溶液。在每 个孔中加入250y1封闭溶液（含有1 %BSA的PBST溶液），在37C封闭1小时，用PBST洗 涂3次，每次加入250y1/孔洗涂溶液。从细胞融合平板的每个孔取20y1上清，补加80y1 封闭溶液，在37C保温1小时，除去平板中剩余的溶液，用PBST洗涂3次，每次加入250y1/ 孔洗涂溶液。将100UlHRP-标记的山羊抗小鼠抗体（Abmart，20110228)加入每个孔中， 在37C保温1小时，用PBST洗涂5次，每次加入250y1/孔洗涂溶液。加入辣根过氧化物 酶底物TMB溶液（Sigma)，在37C保温15分钟，在每个孔中加入50y1的2M略〇4溶液W 结束反应，在450nm读取吸收值。 。巧引C.通巧巧总帝白质据取物免疫动物产牛杭体
[0巧7] 蛋白质制备；将化La细胞用含有蛋白酶抑制剂（Roche)的RIPA缓冲液巧OmM TrispH7.4，150mM化Cl，l%Triton-X-100，l%脱氧胆酸轴，0.1%SDS裂解溶液）裂解，并 通过BCA炬iocolors,Shan曲ai,Qiina)量化。
[025引肤抗原的制备、免疫方法及单克隆抗体的制备均为本领域已知的常用技术， 关于该些技术的描述可见于相关出版物和教材，例如Bazin,Rathybridomasandrat monoclonalantibodies,CRCPress, 1990 ；Goding,Monoclonalantibodies!principles andpractice,3"edition,AcademicPress, 1996；ShepherdandDeanMonoclonal antibodies,OxfordUniversityPress, 2000等。 。巧引D.构律杭体专库
[0260] 取在上述步骤A、B和C中获得的纯化的抗体并混合，W构成抗体文库。将抗体文 库的每100个不同抗体混合W形成抗体亚文库，获得共100个亚文库。 。261 ] E.体巧含有10000个杭体的构律的杭体专库筛洗帝白质的杭体
[0262] 将长度为100-600个氨基酸的20个可溶蛋白质用作祀蛋白质，W证实含有10000 个抗体的抗体文库在筛选具有特殊构象的蛋白质的抗体的成功率。
[0263] 所述碑!蛋白质均购自化an曲aiPrimeGeneBio-TechLTD,所述特定的蛋白质可 见于下表2。
[0264] 表2 ;筛选重组蛋白质的特异性抗体
【权利要求】
1. 一种鉴别靶的抗体的方法，所述方法包括： a) 提供得自哺乳动物的抗体文库，所述哺乳动物的免疫系统未受靶外来刺激，其中所 述抗体文库包含少于1〇7个不同种类抗体； b) 将所述靶与所述抗体文库在适于所述靶与所述抗体文库中的抗体结合的条件下接 触，如果这种抗体存在于所述抗体文库中；及 c) 评估所述靶与所述抗体之间的结合以鉴别所述抗体是所述靶的抗体。
2. 权利要求1的方法，其中所述抗体文库是通过用包含不同的、随机氨基酸序列的多 个多肽免疫哺乳动物产生的。
3. 权利要求2的方法，其中所述多肽包含大约10-20个氨基酸。
4. 权利要求2或3的方法，其中所述多肽不包含Cys，不包含3个或更多个相同的连续 氨基酸，和/或不包含5个或更多个相同氨基酸。
5. 权利要求2-4任一项的方法，其中所述多肽通过如下标准选择： a) 为所有候选多肽指定初始的相同分值； b) 对于候选多肽中每个潜在糖基化位点则从初始分值减去1点； c) 对于候选多肽中每个Lys或Arg残基则从初始分值减去4点；及 d) 针对希望数目的多肽，选择具有最高可能分值的候选多肽用以免疫哺乳动物。
6. 权利要求2-5任一项的方法，其中所述哺乳动物用至少10000个多肽免疫。
7. 权利要求6的方法，其中所述哺乳动物用至少10000、15000、20000、25000、30000、 35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000 或100000个不同的多肽免疫。
8. 权利要求2-7任一项的方法，其中所述多肽包含大约10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19或20个氨基酸。
9. 权利要求2-8任一项的方法，其中所述多肽包含天然和/或非天然氨基酸。
10. 权利要求2-9任一项的方法，其中所述多肽是通过化学合成和/或重组产生方法产 生的。
11. 权利要求2的方法，其中所述多肽通过如下标准选自候选多肽： a) 每个候选多肽包含大约10个氨基酸，不包括Cys; b) 每个候选多肽不包含3个或更多个相同的连续氨基酸； c) 每个候选多肽不包含5个或更多个相同的氨基酸； d) 每个候选多肽被指定为初始分值为10 ; e) 对于候选多肽中每个潜在的糖基化位点，从初始分值中减去1点； f) 对于候选多肽中每个Lys或Arg，从初始分值中减去4点；及 g) 选择具有最高分值的至少10000个候选多肽。
12. 权利要求1的方法，其中所述抗体文库是由哺乳动物产生的，所述哺乳动物的免疫 系统未被有意刺激。
13. 权利要求12的方法，其中所述哺乳动物选自小鼠、大鼠和兔。
14. 权利要求1的方法，其中所述抗体文库是由哺乳动物产生的，所述哺乳动物用完整 生物体、组织、细胞或者所述生物体、组织或细胞的全部蛋白质提取物免疫，所述完整生物 体、组织、细胞与所述靶是免疫学不同的。
15. 权利要求14的方法，其中所述完整生物体选自拟南芥（Arabidopsisthaliana)、 小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、果蝇?rosophila)、斑马鱼、秀_隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)、水稻和玉米。
16. 权利要求14的方法，其中所述组织选自血液、拟南芥芽、在不同发育阶段的秀丽隐 杆线虫组织、以及小鼠脑组织。
17. 权利要求14的方法，其中所述细胞选自脾细胞、肿瘤细胞和细胞系，如人肿瘤细胞 系。
18. 权利要求1的方法，其中所述抗体文库是由哺乳动物产生的，所述哺乳动物用与所 述靶免疫学不同的抗原免疫。
19. 权利要求1的方法，其中所述抗体文库： a) 是由用包含不同的随机氨基酸序列的多个多肽免疫的哺乳动物产生的； b) 是由免疫系统未被有意刺激的哺乳动物产生的； c) 是由用完整生物体、组织、细胞或所述生物体、组织或细胞的全部蛋白质提取物免疫 的哺乳动物产生的； d) 是由用与所述靶免疫学不同的抗原免疫的哺乳动物产生的；或者 e) 上述a)-d)任意的组合。
20. 权利要求1-19任一项的方法，其中所述抗体文库中的抗体包含多克隆抗体、单克 隆抗体和/或产生单克隆抗体的杂交瘤。
21. 权利要求1-20任一项的方法，其中所述抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。
22. 权利要求1-21任一项的方法，其中所述抗体文库包含至少10000、15000、20000、 25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、 85000、90000、95000 或 100000 个不同抗体。
23. 权利要求1-22任一项的方法，其中至少一些抗体被固定在固体表面上。
24. 权利要求23的方法，其中所有抗体均被固定在固体表面上。
25. 权利要求23和24任一项的方法，其中所述固体表面是生物芯片的一部分。
26. 权利要求1-25任一项的方法，其中所述靶是多肽。
27. 权利要求26的方法，其中靶多肽选自线性多肽、可溶多肽、修饰的多肽、毒性多肽 及在对象中导致自身免疫性的多肽。
28. 权利要求1-27任一项的方法，其中将所述靶与抗体文库中的抗体亚组接触以确定 所述抗体亚组是否包含特异性结合所述靶的抗体。
29. 权利要求28的方法，其中所述抗体亚组包含特异性结合所述靶的抗体，及进一步 包含： a) 将所述抗体亚组进一步分为更小的抗体亚组；及 b) 与所述靶接触以确定所述更小的抗体亚组是否包含特异性结合所述靶的抗体。
30. 权利要求29的方法，其中重复步骤a)和b)直至鉴别出特异性结合所述靶的各个 抗体。
31. 权利要求1-30任一项的方法，其用于鉴别特异性结合多个靶的抗体。
32. 权利要求31的方法，其中将所述抗体文库与多个靶接触以鉴别特异性结合多个靶 的抗体或者抗体组。
33. 权利要求32的方法，其进一步包括将多个靶的每个靶与鉴别的抗体或抗体组接触 以鉴别特异性结合所述多个靶的每个靶的抗体或抗体组。
34. 权利要求32的方法，其进一步包括： a) 将鉴别的抗体或抗体组分成较小的抗体亚组；及 b) 将所述多个靶的每个靶与所述较小抗体亚组接触以确定所述较小抗体亚组是否包 含特异性结合所述多个靶的每个靶的抗体。
35. 权利要求34的方法，其中重复步骤a)和b)直至鉴别出特异性结合所述多个靶的 每个靶的各个抗体。
36. 权利要求1-35任一项的方法，其中鉴别出特异性结合所述靶的抗体的成功率是至 少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%。
37. 权利要求1-35任一项的方法，其中所述抗体文库包含至少10000个不同抗体，鉴别 出特异性结合所述靶的抗体的成功率为至少80 %、85 %、90 %、95 %或100 %。
38. 特异性结合所述靶的抗体，其中所述抗体通过权利要求1-37任一项的方法鉴别。
39. 用于鉴别靶的抗体的抗体文库，所述抗体文库得自免疫系统未受靶外来刺激的哺 乳动物，其中所述抗体文库包含少于1〇7个不同种类抗体。
40. 权利要求39的抗体文库，所述抗体文库： a) 由用包含不同的随机氨基酸序列的多个多肽免疫的哺乳动物产生； b) 由免疫系统未被有意刺激的哺乳动物产生； c) 由用完整生物体、组织、细胞或所述生物体、组织或细胞的全部蛋白质提取物免疫的 哺乳动物产生； d) 由用与所述靶免疫学不同的抗原免疫的哺乳动物产生；或者 e) a)-d)任意的组合。
41. 权利要求39和40任一项的抗体文库，其包含至少10000、15000、20000、25000、 30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、 90000、95000或100000个不同抗体。
42. 权利要求39-41任一项的抗体文库，其中所述抗体文库中的抗体包含多克隆抗体、 单克隆抗体和/或产生单克隆抗体的杂交瘤。
43. 权利要求39-42任一项的抗体文库，其中所述抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。
44. 多肽文库，所述多肽文库包含多个分离的包含不同的随机氨基酸序列的多肽，其中 所述多肽包含大约10-20个氨基酸，所述多肽不包含Cys，不包含3个或更多个相同的连续 氨基酸，和/或不包含5个或更多个相同氨基酸。
45. 权利要求44的多肽文库，其中所述多肽通过如下标准选择： a) 为所有候选多肽指定初始相同的分值； b) 对于候选多肽中每个潜在的糖基化位点，从初始分值中减去1点； c) 对于候选多肽中每个Lys或Arg残基，从初始分值中减去4点；及 d) 根据希望的多肽数目选择具有最高可能分值的候选多肽。
46. 权利要求44和45任一项的多肽文库，其包含至少10000个多肽。
47. 产生抗体文库的方法，所述方法包括： a)用权利要求44-46任一项的多肽文库免疫对象； b)从所述对象中回收抗体。
48. 权利要求47的方法，其进一步包括使用权利要求44-46任一项的多肽文库亲和性 纯化从所述对象中回收的抗体。
49. 抗体文库，其是通过权利要求47和48任一项的方法产生的。
50. 权利要求49的抗体文库，其包含至少10000、15000、20000、25000、30000、35000、 40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000 或 100000个不同抗体。
51. 权利要求49和50任一项的抗体文库，其中所述抗体文库中的抗体包含多克隆抗 体、单克隆抗体和/或产生单克隆抗体的杂交瘤。
52. 权利要求49-51任一项的抗体文库，其中所述抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。
53. 多肽文库，所述多肽文库包含序列表（SEQIDNO:l-55471)中列出的至少10、100、 1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000 个或者所有分离的多 肽。
54. 产生抗体文库的方法，所述方法包括： a) 用权利要求53的多肽文库免疫对象； b) 从所述对象中回收抗体。
55. 权利要求54的方法，其进一步包括使用权利要求53的多肽文库亲和性纯化自对象 中回收的抗体。
56. 抗体文库，其通过权利要求55的方法产生。
57. 权利要求56的抗体文库，其包含至少10000、15000、20000、25000、30000、35000、 40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000 或 100000个不同抗体。
58. 权利要求56和57任一项的抗体文库，其中所述抗体文库中的抗体包含多克隆抗 体、单克隆抗体和/或产生单克隆抗体的杂交瘤。
59. 权利要求56-58任一项的抗体文库，其中所述抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。
60. 抗体文库，所述抗体文库包含特异性结合序列表（SEQIDNO: 1-55471)中列出的至 少 10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000 个或者所 有多肽的抗体。
61. 权利要求60的抗体文库，其中所述抗体文库中的抗体包含多克隆抗体、单克隆抗 体和/或产生单克隆抗体的杂交瘤。
62. 权利要求60和61任一项的抗体文库，其中所述抗体文库中的抗体是亲和性成熟 的。
63. 鉴别靶抗体的肽抗原性序列的方法，所述方法包括： a)将靶抗体与包含序列表（SEQIDNO: 1-55471)中列出的至少10、100、1000、10000、 15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000 个或者所有分离的多肽的多肽文库 在适于所述靶抗体与所述多肽文库中的多肽结合的条件下接触，如果这种多肽存在于所述 多肽文库中；以及 c) 评估所述靶抗体与所述多肽之间的结合以鉴别所述靶抗体的肽抗原性序列。
64. 权利要求63的方法，其中将所述靶抗体与多肽文库中多肽亚组接触以确定所述多 肽亚组是否包含特异性结合所述靶抗体的多肽。
65. 权利要求64的方法，其中所述多肽亚组包含特异性结合所述靶抗体的多肽，及进 一步包括： a) 将所述多肽亚组分成更小的多肽亚组；及 b) 将所述靶抗体与所述更小的多肽亚组接触以确定所述更小的多肽亚组是否包含特 异性结合所述靶抗体的多肽。
66. 权利要求65的方法，其中重复步骤a)和b)直至鉴别出特异性结合所述靶抗体的 各个多肽。
67. 权利要求63-66任一项的方法，其用于鉴别多个祀抗体的肽抗原性序列。
68. 权利要求63-67任一项的方法，其进一步包括分离特异性结合所述靶抗体的多肽。
69. 权利要求68的方法，其进一步包括确定所述分离的多肽的氨基酸序列。
70. 权利要求63-69任一项的方法，其中所述靶抗体是生物标记。
71. 权利要求70的方法，其中所述生物标记是诊断或预后生物标记。
72. 特异性结合Akt的分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合氨基酸序列 QDGGQKAVKD中包含的表位。
73. 特异性结合ERK2的分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合氨基酸序列 HPLGSPGSAS中包含的表位。
74. 特异性结合Desmin的分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合氨基酸序列 REIRRYQKST中包含的表位。
75. 特异性结合CBL4的分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合氨基酸序列 RSRARKQAYT中包含的表位。
76. 特异性结合霍乱毒素的分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合氨基酸序列 FEEREQANTA、EYQQAQLEAE或DSSMSMADSE中包含的表位。
77. 特异性结合VEGF的分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合氨基酸序列 VLDFILSMGL、AKRKAGTSPR或RNSDFSAGSP中包含的表位。
78. 权利要求1的方法，其中所述抗体文库中抗体的氨基酸序列先前是未知的。
79. 权利要求1的方法，其中所述抗体文库中的抗体包含完整（或完全）抗体分子。
80. 权利要求39的抗体文库，其中所述抗体文库中抗体的氨基酸序列先前是未知的。
81. 权利要求39的抗体文库，其中所述抗体文库中的抗体包含完整（或完全）抗体分 子。
82. 权利要求47的方法，其中一个对象用所述文库中一组大约5-20个多肽免疫，多个 对象用所述文库中多组大约5-20个多肽免疫，所述多组大约5-20个多肽涵盖了所述文库 中所有多肽。
83. 权利要求49的抗体文库，其中所述抗体文库中抗体的氨基酸序列先前是未知的。
84. 权利要求49的抗体文库，其中所述抗体文库中的抗体包含完整（或完全）抗体分 子。
85. 权利要求55的抗体文库，其中所述抗体文库中抗体的氨基酸序列先前是未知的。
86. 权利要求55的抗体文库，其中所述抗体文库中的抗体包含完整（或完全）抗体分 子。
87. 权利要求60的抗体文库，其中所述抗体文库中抗体的氨基酸序列先前是未知的。
88. 权利要求60的抗体文库，其中所述抗体文库中的抗体包含完整（或完全）抗体分 子。
89. 鉴别与病症相关的靶的方法，所述方法包括： a) 将得自患有病症的来源的样品与权利要求39-43、49-52和56-62任一项的抗体文库 接触，评估所述样品中的物质与所述抗体文库中的抗体之间的结合或者缺乏结合； b) 将得自未患有所述病症的来源的样品与权利要求39-43、49-52和56-62任一项的抗 体文库接触，评估所述样品中的物质与所述抗体文库中的抗体之间的结合或者缺乏结合； 及 c) 当步骤a)和b)中所述物质与所述抗体之间的所述结合或缺乏结合存在差别时，鉴 别物质为与所述病症相关的靶。
90. 权利要求89的方法，其用于鉴别与对象中病症相关的靶。
91. 权利要求89的方法，其用于鉴别与疾病或失调相关的靶。
92. 权利要求89的方法，其用于鉴别与病症相关的多个靶。
93. 权利要求89的方法，其中步骤a)和b)中所述物质与所述抗体之间的结合或缺乏 结合的差别是定性的。
94. 权利要求89的方法，其中步骤a)和b)中所述物质与所述抗体之间的结合或缺乏 结合的差别是定量的。
95. 权利要求89的方法，其中步骤a)中所述物质与所述抗体之间的结合及步骤b)中 所述物质与所述抗体之间缺乏结合鉴别所述物质是与所述病症相关的靶。
96. 权利要求89的方法，其中步骤a)中所述物质与所述抗体之间缺乏结合及步骤b) 中所述物质与所述抗体之间的结合鉴别出所述物质是与所述病症相关的靶。
97. 权利要求89的方法，其中所述靶包含多肽。
98. 鉴别与病症相关的靶的方法，所述方法包括： a) 将得自患有病症的来源的样品与权利要求44-46和53任一项的多肽文库接触，并评 估所述样品中的物质与所述多肽文库中的多肽之间的结合或缺乏结合； b) 将得自不具有所述病症的来源的样品与权利要求44-46和53任一项的多肽文库接 触，并评估所述样品中的物质与所述多肽文库中的多肽之间的结合或缺乏结合；以及 c) 当步骤a)和b)中所述物质与所述多肽之间的结合或缺乏结合存在差别时，鉴别物 质是与所述病症相关的靶。
99. 权利要求98的方法，其用于鉴别与对象中的病症相关的靶。
100. 权利要求98的方法，其用于鉴别与疾病或失调相关的靶。
101. 权利要求98的方法，其用于鉴别与病症相关的多个靶。
102. 权利要求98的方法，其中步骤a)和b)中所述物质与所述多肽之间的结合或缺乏 结合中的差别是定性的。
103. 权利要求98的方法，其中步骤a)和b)中所述物质与所述多肽之间的结合或缺乏 结合中的差别是定量的。
104. 权利要求98的方法，其中步骤a)中所述物质与所述多肽之间的结合及步骤b)中 所述物质与所述多肽之间的缺乏结合鉴别出所述物质是与所述病症相关的靶。
105. 权利要求98的方法，其中步骤a)中所述物质与所述多肽之间的缺乏结合及步骤 b)中所述物质与所述多肽之间的结合鉴别出所述物质是与所述病症相关的靶。
106. 权利要求98的方法，其中所述靶包括抗体。
107. 抗体文库，其包含： (1) 针对具有10-20个氨基酸的随机肽的抗体， (2) IgG抗体，由初次用于实验的哺乳动物的脾细胞产生的杂交瘤细胞分泌， (3) IgG抗体，由用总蛋白质提取物免疫的哺乳动物的脾细胞产生的杂交瘤细胞分泌， 所述蛋白质提取物来自完整生物体、其一或多个组织、和/或其一或多个细胞， (4) IgG抗体，由针对一或多种抗原建立的稳定杂交瘤株系分泌，或者 (5) (1)-⑷的任意组合； 其中所述抗体文库包含至少10000个不同成员，所述抗体文库当用于筛选感兴趣的蛋 白质的抗体时具有至少85%的成功率。
108. 权利要求107的抗体文库，其是杂交瘤细胞文库形式。
109. 权利要求107的抗体文库，其中所述随机肽： 1) 不含有半胱氨酸， 2) 不含有3个或更多个连续的相同氨基酸， 3) 不含有5个或更多个相同氨基酸。
110. 权利要求109的抗体文库，其中每个随机肽的初始分值设定为任何值，所述随机 肽通过如下方法选择： 1) 对于具有潜在糖基化位点的氨基酸，每个潜在的糖基化位点从所述分值中减去1 点， 2) 每个氨基酸K或R从所述分值中减去4点； 基于上述分值，从上至下选择具有最高分值的希望数量的肽。
111. 权利要求107的抗体文库，其中所述初次用于实验的哺乳动物选自小鼠、大鼠、 兔。
112. 权利要求107的抗体文库，其中所述完整生物体选自拟南芥、小鼠、大鼠、兔、牛、 山羊、果蝇、斑马鱼、蛲虫、水稻或玉米。
113. 权利要求107的抗体文库，其中所述一或多个组织选自血液组织、拟南芥花萼、不 同发育阶段的蛲虫组织、或者小鼠脑组织。
114. 权利要求107的抗体文库，其中所述一或多个细胞选自脾细胞、肿瘤细胞或细胞 系，如人肿瘤细胞系。
115. 权利要求107的抗体文库，其中所述抗体已经进行亲和性成熟。
116. 权利要求107的抗体文库，其中所述抗体文库包含至少15000、20000、25000、 30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、 90000、95000或100000个不同成员。
117. -种组合，其包含权利要求107-116任一项的抗体文库。
118. -种生物芯片，其包含权利要求106-116任一项的抗体文库。
119. 筛选感兴趣的蛋白质的抗体的方法，包括使用权利要求106-116任一项的抗体文 库、权利要求117的组合、或者权利要求118的生物芯片筛选所述感兴趣的蛋白质的一或多 种抗体。
120. 权利要求119的方法，包含： (a) 将所述感兴趣的蛋白质与所述抗体文库的抗体或抗体组混合， (b) 选择能结合所述感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组。
121. 权利要求120的方法，进一步包括： (c) 将所述感兴趣的蛋白质与在步骤（b)中选择的抗体或抗体组的抗体亚组混合， (d) 选择能结合所述感兴趣的蛋白质的抗体或抗体亚组。
122. 权利要求121的方法，进一步包括使用在步骤（d)中选择的抗体亚组重复步骤 (c) 和（d),直至选择能结合所述感兴趣的蛋白质的抗体。
123. 权利要求119的方法，其中所述筛选是针对几个感兴趣的蛋白质同时进行的，包 括： (a) 将所述几个感兴趣的蛋白质与所述抗体文库的抗体或抗体组混合， (b) 选择能结合所述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组， (c) 将所述几个感兴趣的蛋白质的每一个单独与在步骤（b)中选择的能结合所述几个 感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组混合，然后分别选择能结合所述几个感兴趣的蛋白质的每 一个的抗体或抗体组。
124. 权利要求123的方法，进一步包括： (d) 将所述几个感兴趣的蛋白质的每一个单独与在步骤（c)中选择的能结合各自感兴 趣的蛋白质的抗体或抗体组的抗体亚组混合， (e) 分别选择能结合所述几个感兴趣的蛋白质的每一个的抗体或抗体亚组。
125. 权利要求124的方法，其进一步包括使用在步骤（e)中选择的抗体亚组重复步骤 (d) 和（e)，直至分别选择了能结合所述感兴趣的蛋白质的每一个的抗体。
126. 权利要求119-125任一项的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是翻译后修饰的蛋白 质或多肽，或者毒性蛋白质或多肽。
【文档编号】C12P21/00GK104379821SQ201380018434
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年4月1日 优先权日:2012年3月31日
【发明者】孟逊, 李阳, 王小清 申请人:艾比玛特生物医药（上海）有限公司