处理纤维素材料的方法

处理纤维素材料的方法
【专利摘要】本发明涉及从预处理的纤维素材料生产糖和/或发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：预调节预处理的纤维素材料；使用一种纤维素分解酶制剂进行水解；并且用微生物发酵糖；其中进行得到一个固体级分和一个液体级分的一个固液分离步骤：在预调节后但在水解前；或在水解后但在发酵前；其中存在或添加酚氧化酶和半纤维素酶：在预调节过程中；在预调节后但水解前；或在水解过程中。
【专利说明】处理纤维素材料的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及从预处理的纤维素材料生产糖和/或发酵产物的方法，其中获得了改 善的固液分离。
[0002] 发明背景
[0003] 纤维素材料提供了用于产生化石燃料的可替代能源的一个有吸引力的平台。将纤 维素材料（例如来自木质纤维素原料）转化成生物燃料具有如下优点，即易于获得大量原 料、避免燃烧或填埋材料的合意性、以及该生物燃料（例如乙醇）的清洁性。一旦将纤维素 材料转化成可发酵的糖，例如葡萄糖，那么这些可发酵的糖就可以被酵母发酵成生物燃料 (例如乙醇）。
[0004] 可以在水解之前或之后使预处理的纤维素材料经受固液分离。固液分离的效率对 于最终的MESP(最低乙醇销售价格）是重要的。高固液分离导致更低的MESP。因此，改善 从预处理的纤维素材料生产糖和/或发酵产物的方法和工艺中的固液分离在本领域中会 是一个优势。
[0005] 发明简述
[0006] 此处所述的是改善从预处理的纤维素材料生产糖和/或发酵产物的方法中的固 液分离的工艺。
[0007] 在第一方面，本发明涉及从预处理的纤维素材料生产发酵产物的方法，包括以下 步骤：
[0008] i)预调节预处理的纤维素材料；
[0009] ii)使用一种纤维素分解酶制剂水解该预处理的纤维素材料；
[0010] iii)用微生物发酵糖；
[0011] 其中进行得到一个固体级分和一个液体级分的一个固液分离步骤：
[0012] a)在预调节后但在水解前；或
[0013] b)在水解后但在发酵前；
[0014] 其中存在或添加酚氧化酶和/或半纤维素酶：
[0015] -在预调节过程中；或
[0016] -在预调节后但在水解前；或
[0017] -在水解过程中。
[0018] 在一个优选实施例中，该预处理的纤维素材料是稀酸预处理的纤维素材料。在另 一个实施例中，该预处理的纤维素材料是自水解预处理的纤维素材料。
[0019] 在一个优选实施例中，该酚氧化酶是一种漆酶（例如来自嗜热毁丝霉）。在一个优 选实施例中，该半纤维素酶是一种木聚糖酶（例如源自于棘孢曲霉或烟曲霉）和/或一种 3-木糖苷酶（例如源自于烟曲霉）。
[0020] 该一种或多种半纤维素酶还可以是包括一种或多种半纤维素酶（例如木聚糖酶 和/或3 -木糖苷酶）的一种纤维素分解酶制剂的部分。在一个实施例中，该纤维素分解酶 制剂源自于木霉属（例如里氏木霉）。该纤维素分解酶制剂通常包括内切葡聚糖酶（EG)、 纤维二糖水解酶（CBH)、以及葡糖苷酶（BG)。该纤维素分解酶制剂可进一步包括一种 具有纤维素分解增强活性的多肽（例如橙色嗜热子囊菌或埃默森青霉菌纤维素分解增强 多肽）、0 -葡糖苷酶（例如烟曲霉或米曲霉0 -葡糖苷酶）和/或半纤维素酶。
[0021] 在另一方面，本发明涉及从预处理的纤维素材料生产糖的方法，包括以下步骤：
[0022] (a)预调节预处理的纤维素材料；
[0023] (b)使用一种纤维素分解酶制剂水解该预处理的纤维素材料；
[0024] 其中进行得到一个固体级分和一个液体级分的一个固液分离步骤：
[0025] i)在预调节后但在水解前；或
[0026] ii)在水解后；
[0027] 其中存在或添加酚氧化酶和/或半纤维素酶：
[0028] a.在预调节过程中；或
[0029] b?在预调节后但在水解前；
[0030] c?在水解过程中。
[0031] 所使用的酶可以与本发明的生产发酵产物的方法中的相同。根据本发明生产的这 些糖可被转化为多个产物，包括发酵产物（例如乙醇或丁醇），或被转化为糖浆（例如高果 糖玉米糖浆）以及塑料，包括聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯）。其他考虑到的终产物包括乳酸， 可充当用于生产聚乳酸（PLA)以替代石油化学的包装材料（例如PET)的一种原料。
[0032] 半纤维素：如此处使用的，术语"半纤维素"是指生物质材料除了纤维素之外的一 种寡糖或多糖。半纤维素在化学上是异质的并包括通过氢键结合到该植物细胞壁中的纤维 素微纤维的呈复杂的异质的枝状和线性多糖或寡糖的多种聚合的糖，主要是D-戊糖，例如 木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、以及甘露聚糖，并且其中木糖通常呈最大量。半纤维素可 共价地附接到木质素，并通常氢键合到纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基 质，形成高度复杂结构。半纤维素材料包括任何形式的半纤维素，例如降解或水解为寡糖的 多糖。在此应理解的是，半纤维素可以是呈以下形式：木质纤维素的一个组分、包括木质素 的植物细胞壁材料、纤维素、以及混合基质中的半纤维素。
[0033] 成熟多肽：术语"成熟多肽"意指在翻译和任何翻译后修饰（如N末端加工、C末 端截短、糖基化、磷酸化等）之后呈其最终形式的一种多肽。在本领域中已知的是，宿主细 胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽（即，具有不同的C末端 和/或N末端氨基酸）的混合物。该成熟多肽可使用信号P(SignalP)程序（Nielsen等人， 1997,蛋白质工程（ProteinEngineering) 10:1-6)预测。
[0034] 成熟多肽编码序列：术语"成熟多肽编码序列"在此处被定义为编码具有生物活 性的成熟多肽的核苷酸序列。该成熟多肽编码序列可使用信号P(SignalP)程序（Nielsen等人，1997,上文）预测。
[0035] 预处理的玉米秸杆：术语"PCS"或"预处理的玉米秸杆"意指源自于玉米秸杆的已 被预处理（例如通过用热和稀硫酸处理）的一种纤维素材料。
[0036]序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数"序列 一致性"描述。
[0037] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件 (TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，赖斯（Rice)等人，2000,遗传 学趋势（TrendsGenet.) 16:276-277)(优选5. 0. 0版或更新版本）的Needle程序中所实 施的尼德尔曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德尔曼和翁施，1970,分子生物学杂志 (J.Mol.Biol.) 48:443-453)来测定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数 是空位开放罚分10、空位延伸罚分0. 5,以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩 阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出（使用-非简化选项获得）被用作百分比一致 性，并且如下计算：
[0038] (一致的残基X 100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0039] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件， 赖斯等人，2000,同上）（优选5. 0. 0版或更新版本）的尼德尔（Needle)程序中所实施的尼 德尔曼-翁施算法（尼德尔曼和翁施，1970,同上）来测定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的 序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0. 5以及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出（使用-非简化 选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0040] (一致的脱氧核糖核苷酸X100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0041] 固液分离：固液分离可以按任何方式来实现，包括使用螺旋压榨机、离心、压带机、 转鼓过滤器、水力旋流器和/或压滤机，或任何种类的能够处理固/液分离的装置，包括重 力进料系统或装置。
[0042] 变体：术语"变体"是指包括一个变更（即在一个或多个位置处取代、插入、和/或 删除一个或多个（例如若干个）氨基酸残基）的一个多肽（例如酶）。取代是指用不同的 氨基酸替换占据一个位置的氨基酸；删除是指除去占据一个位置的氨基酸；并且插入是指 添加与占据一个位置的氨基酸相邻的氨基酸。
[0043] 在此提及"约"一个数值或参数包括指向那个数值或参数本身的方面。例如，提及 "约X"的描述包括方面"X"。
[0044] 如在此和所附权利要求书中所使用，单数形式"一种/个"、"或"以及"该"包括复 数指示物，除非上下文以另外的方式清楚表明。应该理解的是在此描述的本发明的这些方 面包括"由方面组成"和/或"基本由方面组成"。
[0045] 除非另外定义或由背景清楚指示，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如 本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0046] 详细说明
[0047] 本发明涉及从预处理的纤维素材料生产糖和/或发酵产物的方法，该方法包括一 个固液分离步骤。与不添加酶的相同过程相比，根据本发明将预处理的纤维素材料分离为 一个固体级分和一个液体级分被改善。
[0048] 本发明人发现，在预调节过程中，或预调节后但水解前，或水解过程中，使预处理 的木质纤维素材料经受漆酶和半纤维素酶时，获得改善的固液分离。
[0049] 在第一方面，本发明涉及从预处理的纤维素材料生产发酵产物（例如尤其乙醇） 的方法，包括以下步骤：
[0050] (a)预调节预处理的纤维素材料；
[0051] (b)使用一种纤维素分解酶制剂水解该预处理的纤维素材料；
[0052] (c)用微生物发酵糖；
[0053] 其中进行得到一个固体级分和一个液体级分的一个固液分离步骤：
[0054] (i)在预调节后但在水解前；或
[0055] (ii)在水解后但在发酵前；
[0056] 其中存在或添加酚氧化酶和/或半纤维素酶：
[0057] -在预调节过程中；或
[0058] -在预调节后但在水解前；或
[0059] -在水解过程中。
[0060] 在一个优选实施例中，该预处理的纤维素材料是稀酸预处理的纤维素材料。在另 一个实施例中，该预处理的纤维素材料是自水解预处理的纤维素材料。
[0061] 该酚氧化酶可以是任何酚氧化酶。在一个优选实施例中，该酚氧化酶是漆酶。特 别考虑到的是嗜热毁丝霉漆酶（披露于W0 95/33836)(诺维信）。其他适合的漆酶在以下 的"漆酶"部分中提出。
[0062] 还可以使用其他酚氧化酶。在以下的"酚氧化酶"部分中给出实例。
[0063] 该半纤维素酶可以是任何半纤维素酶（例如真菌或细菌起源的）。在一个优选实 施例中，该半纤维素酶是木聚糖酶和/或木糖苷酶。特别地，半纤维素酶可以是一种木聚糖 酶（例如GH10木聚糖酶）（源自于棘孢曲霉（例如披露于W0 94/21785中的XylII))、或 烟曲霉（例如披露于W0 2006/078256中的一种）和/或一种0 -木糖苷酶（源自于烟曲 霉（例如披露于W0 2011/057140中的一种））。
[0064] 在以下"半纤维素酶"部分中列出了其他适合的半纤维素酶。
[0065] 在一个实施例中，该半纤维素酶是一种纤维素分解酶制剂中的成分。在这类实施 例中，该半纤维素酶可以是一种纤维素分解酶制剂（例如来自里氏木霉），该纤维素分解酶 制剂进一步包括一种外来半纤维素酶（即不源自于产生该纤维素分解酶制剂的生物），例 如一种木聚糖酶（例如棘孢曲霉或烟曲霉木聚糖酶）和/或木糖苷酶（例如烟曲霉木 糖苷酶）。
[0066] 可以使用任何适合的方法预处理该预处理的纤维素材料。在以下"预处理"部分 中列出了适合的预处理方法。在一个优选实施例中，该材料是稀酸预处理的或自水解的。 [0067] 在一个实施例中，该预处理的纤维素材料是未洗涤的和/或未解毒的。
[0068] 在一个实施例中，该预处理的材料是压榨的纤维素材料。
[0069] 根据本发明，该纤维素材料可以是未洗涤的预处理的玉米秸杆（PCS)、未洗涤的预 处理的玉米穗轴、未洗涤的预处理的麦秸、未洗涤的预处理的稻秸或未洗涤的预处理的柳 枝稷。在一个优选实施例中，该纤维素材料是未洗涤的稀酸预处理的玉米秸杆。
[0070] 考虑到的纤维素材料的其他实例可以在以下"纤维素材料"部分中找到。
[0071] 根据本发明，水解可以在 5-50(w/w) %TS，例如 10-40(w/w) %TS、15-35(w/w) % TS、以及20-30 (w/w) %TS进行。在一个优选实施例中，该纤维素材料可以是预处理的未洗 漆的玉米結杆（PCS)、玉米穗轴、麦結、稻結以及柳枝稷。
[0072] 在一个实施例中，预调节发生在5_50(w/w) %TS，例如10_40(w/w) %TS，例如 15-35(w/w) %TS，例如 20-30(w/w) %TS。
[0073] 在一个实施例中，该纤维素材料的预调节发生持续至少30分钟，例如至少1小时、 2小时、4小时、8小时、12小时、或24小时、或更长，或从30分钟到24小时。
[0074] 在一个实施例中，该纤维素材料的预调节发生在20°C-70°C之间，例如40和60°C 之间的温度下。
[0075] 在一个实施例中，该酚氧化酶装载（尤其漆酶）是1-500微克之间的酶蛋白（EP)/ g纤维素，例如5-100微克EP/g纤维素。
[0076] 在一个实施例中，该半纤维素酶装载是0.01和20mgEP/g纤维素之间，例如 0? 1-lmgEP/g纤维素。
[0077] 纤维素材料
[0078] 如此处使用的，术语"纤维素材料"是指包括纤维素（P-(l-4)-D-葡聚糖（包括 3 (1-4)连接的D-葡萄糖单元的聚合物）的一种化学上异质的寡糖或多糖）的任何木质 纤维素材料。尽管纤维素一般为多态的，但可发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的 不溶性晶体基质存在。纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮、以及穗轴，或树的叶、枝、 以及木材中。纤维素材料可以是，但不限于：草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体 废物、废纸、以及纸浆和造纸厂残余物（参见，例如，维色洛戈尔（Wiselogel)等人，1995， 于生物乙醇手册（HandbookonBioethanol)(查尔斯?E?怀曼（CharlesE.Wyman)编 辑），第105-118页，泰勒弗朗西斯出版集团（Taylor&Francis)，华盛顿特区（Washington D.C.);怀曼（Wyman)，1994,生物资源技术（BioresourceTechnology) 50:3-16; 林德（Lynd), 1990，应用生物化学与生物技术（AppliedBiochemistryand Biotechnology) 24/25:695-719 ;莫思尔（Mosier)等人，1999,木质纤维素的生物转化的 最近进展（RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics)，生物化学工 程/ 生物技术的进展（AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology)，T?谢 伯（T.Scheper)主编，第65卷，第23-40页，纽约斯普林格出版社（Springer-Verlag,New York)。纤维素材料包括任何形式的纤维素，例如降解或水解为寡糖的多糖。在此应理解的 是，纤维素可以是呈以下形式：木质纤维素的一个组分、包括木质素的植物细胞壁材料、纤 维素、以及混合基质中的半纤维素。
[0079] 在一方面，纤维素材料是草本材料（包括能源作物）。在另一个方面，纤维素材料 是农业残余物。在另一个方面中，纤维素材料是木材（包括林业残余物）。在另一个方面 中，该纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面中，纤维素材料是废纸。在另一个方面中， 纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。
[0080] 在另一个方面中，纤维素材料是玉米秸杆。在另一个方面中，纤维素材料是小麦秸 杆。在另一个方面中，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面中，纤维素材料是玉米芯。在另 一个方面中，纤维素材料是柳枝稷。在另一个方面中，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方 面中，纤维素材料是稻草。在另一个方面，纤维素材料是芒草。在另一个方面中，纤维素材料 是芦竹。在另一个方面中，纤维素材料是竹子。在另一个方面中，纤维素材料是橘皮。在另 一个方面中，纤维素材料是杨树。在另一个方面中，纤维素材料是松树。在另一个方面中， 纤维素材料是白杨。在另一个方面中，纤维素材料是冷杉。在另一个方面中，纤维素材料是 云杉。在另一个方面中，纤维素材料是柳树。在另一个方面中，纤维素材料是桉树。
[0081] 在另一个方面中，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是细菌 纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是海藻纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是棉短 绒。在另一个方面，纤维素材料是无定形磷酸处理的纤维素。在另一个方面中，纤维素材料 是滤纸。
[0082] 在另一个方面中，纤维素材料是一种水生生物质。如在此所用的，术语"水生生物 质（AquaticBiomass)"是指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。该水生生物 质可以是藻类、沉水植物、挺水植物、以及浮叶植物。
[0083] 本发明的方法
[0084] 本发明的方法从预处理的纤维素材料生产糖和/或发酵产物。该预处理可以是任 何预处理。适合的预处理的实例可以在下面的"预处理"部分中找到。本发明的方法通常 包括预调节预处理的纤维素材料；水解（优选使用纤维素分解酶制剂）该预调节的材料； 用微生物发酵所得的糖的步骤。本发明的方法包括一个固液分离步骤，得到一个固体级分 和一个液体级分。
[0085] 根据本发明，水解可以在10% -40%TS，例如15% -35%TS，例如20% -30%TS 进行。在一个优选实施例中，该纤维素材料可以是预处理的未洗涤的玉米秸杆（PCS)、玉米 穗轴、麦秸、稻秸以及柳枝稷。
[0086] 在一个实施例中，该固液分离是在预调节后但在水解前进行。
[0087] 在本发明的一个实施例中，预处理的纤维素材料是稀酸预处理的纤维素材料或类 似的一种预处理的材料，其中C5糖结束于从固液分离得到的液体级分中。在一个实施例中， 从该固液分离步骤所得到的固体级分被水解并且然后被发酵。从该固液分离步骤所得到的 液体级分也可被发酵。在一个实施例中，任选地回收来自该固体级分和/或液体级分发酵 的发酵产物。在一个实施例中，该液体级分在固液分离步骤之后被解毒。在一个实施例中， 该解毒的液体级分与该固体级分一起被水解并且然后被发酵（即与该水解的固体级分一 起）。在一个实施例中，从该固液分离步骤所得到的固体级分被水解并且然后与从该固液分 离步骤所得到的液体级分一起被发酵。
[0088] 在一个实施例中，该固液分离是在水解后但发酵前进行。在这个实施例中，从该固 液分离步骤所得到的液体级分可以被发酵并且任选地回收。该固体级分不包含显著量的 糖。
[0089] 在一个实施例中，该预处理的纤维素材料是自水解预处理的纤维素材料或类似 的，其中（：5糖结束于该固体级分中。在一个实施例中，该固液分离是在预调节后但水解前 进行。在一个实施例中，从该固液分离所得到的固体级分被水解并且然后被发酵。从该固 液分离所得到的液体级分在例如发酵中可被重用作水。
[0090] 在一个实施例中，该固液分离是在水解后但发酵前进行。在一个实施例中，从该固 液分离所得到的固体级分被发酵并且任选地回收。
[0091] 在一个实施例中，从本发明的预处理的纤维素材料生产发酵产物的方法，该方法 包括以下步骤：
[0092] -预调节预处理的纤维素材料；
[0093] -固液分离得到一个固体级分和一个液体级分：
[0094] -使用一种纤维素分解酶制剂水解该固体级分；
[0095] _用一种微生物对来自该水解的固体级分和/或任选地该液体级分的糖进行发 酵；
[0096] 其中存在或添加酚氧化酶和/或半纤维素酶：
[0097] -在预调节过程中；或
[0098] -在预调节后但在水解前；
[0099] -在水解过程中。
[0100] 在本发明的一个实施例中，该预处理的纤维素材料是稀酸预处理的纤维素材料。 在一个实施例中，该发酵的材料被回收，例如通过蒸馏。
[0101] 在本发明的另一个实施例中，该预处理的纤维素材料是自水解酸预处理的纤维素 材料。在一个实施例中，从该固液分离所得到的固体级分被水解并且然后被发酵。在一个 实施例中，从该固液分离所得到的液体级分在发酵中被重用作水。在一个实施例中，该发酵 的材料被回收，例如通过蒸馏。
[0102] 在一个实施例中，本发明涉及从预处理的纤维素材料生产发酵产物的方法，该方 法包括以下步骤：
[0103] -预调节预处理的纤维素材料；
[0104] -使用一种纤维素分解酶制剂水解该预处理的纤维素材料；
[0105] -固液分离；
[0106] _用一种微生物发酵来自该液体级分的糖；
[0107] 其中存在或添加酚氧化酶和/或半纤维素酶：
[0108] -在预调节过程中；或
[0109] -在预调节后但在水解前；
[0110] -在水解过程中。
[0111] 在一个实施例中，该预处理的纤维素材料是稀酸预处理的纤维素材料。
[0112] 在一个实施例中，该发酵的材料被回收，例如通过蒸馏。
[0113] 在一个实施例中，本发明涉及从预处理的纤维素材料生产发酵产物的方法，该方 法包括以下步骤：
[0114] -预调节预处理的纤维素材料；
[0115] -使用一种纤维素分解酶制剂水解该预处理的纤维素材料；
[0116] -固液分离；
[0117] _用一种微生物发酵来自该固体级分的糖；
[0118] 其中存在或添加酚氧化酶和/或半纤维素酶：
[0119] -在预调节过程中；或
[0120] -在预调节后但在水解前，
[0121] -在水解过程中。
[0122] 在一个实施例中，该预处理的纤维素材料是自水解预处理的纤维素材料。在一个 实施例中，该发酵的材料被回收，例如通过蒸馏。
[0123] 根据本发明的方法，其中水解和发酵是作为分开水解和发酵（SHF)、同时糖化和发 酵（SSF)、同时糖化和共发酵（SSCF)、杂合的水解和发酵（HHF)、分开水解和共发酵（SHCF)、 杂合的水解和共发酵（HHCF)、以及直接微生物转化（DMC)进行的。
[0124] 在一个优选实施例中，该发酵产物是一种醇（例如乙醇或丁醇）、一种有机酸、一 种酮、一种氨基酸、或一种气体。
[0125] 与当不存在或添加酚氧化酶和半纤维素酶时相比，本发明的方法导致改善的固液 分离。
[0126] 在本发明的一个方面，本发明涉及从预处理的纤维素材料生产糖的方法，该方法 包括以下步骤：
[0127] a)预调节预处理的纤维素材料；
[0128] b)使用一种纤维素分解酶制剂水解该预处理的纤维素材料；
[0129] 其中进行得到一个固体级分和一个液体级分的一个固液分离步骤：
[0130] i)在预调节后但在水解前；或
[0131] ii)在水解后；
[0132] 其中存在或添加酚氧化酶和/或半纤维素酶：
[0133] -在预调节过程中；或
[0134] -在预调节后但在水解前；
[0135] -在水解过程中。
[0136] 所使用的这种或这些酶可以与本发明的生产发酵产物的方法中的相同。根据本发 明生产的这些糖可被转化为多个末端产物，包括发酵产物（例如乙醇或丁醇），或被转化为 糖浆（例如高果糖玉米糖浆）以及塑料，包括聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯）。其他考虑到的终 产物包括乳酸，可充当用于生产聚乳酸（PLA)以替代石油化学的包装材料（例如PET)的一 种原料。
[0137] 预处理
[0138] 在本发明的方法中所使用的起始材料例如通过化学预处理、物理预处理、或化学 预处理和物理预处理而被预处理。下文描述了此类预处理的实例。在一方面，该预处理的 纤维素材料已通过一种化学的预处理被预处理。在另一方面，该预处理的纤维素材料已通 过物理的预处理被预处理。在另一方面，该预处理的纤维素材料已通过一种化学的预处理 和一种物理的预处理被预处理。
[0139] 可以使用本领域中已知的任何适合的预处理方法来破坏纤维素材料的植物细 胞壁组分（参见，例如钱德拉（Chandra)等人，2007,生化工程/生物技术进展（Adv. Biochem.Engin./Biotechnol.) 108:67-93;盖尔贝（Galbe)和赛琪（Zacchi)，2007,生化 工程/生物技术进展，108:41-65 ;亨德里克斯（Hendriks)和塞曼（Zeeman)，2009,生物资 源技术（BioresourceTechnol.) 100:10-18;莫西尔（Mosier)等人，2005,生物资源技术 96:673-686;泰和拉德（Taherzadeh)和卡里米（Karimi)，2008,分子科学国际杂志（Int. J.ofMol.Sci.)9:1621-1651 ;杨（Yang)和怀曼，2008,生物燃料，生物产品和生物精制 Biofpr.(BiofuelsBioproductsandBiorefining-Biofpr.) 2:26-40)〇
[0140] 纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行颗粒尺寸减缩、预 浸泡、润湿。
[0141] 常规预处理包括但不限于：蒸汽预处理（伴随或不伴随爆发）、稀酸预处理、热水 预处理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆发、氨纤维爆发、有机溶剂预处理、以及生物预 处理。另外的预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界co2、超临界4〇、臭氧、以及Y 辐射预处理。在一个优选实施例中，该纤维素材料（例如未洗涤的玉米秸杆）是稀酸预处 理的。
[0142] 在预调节、水解（糖化）和/或发酵之前对该纤维素材料进行预处理。
[0143]蒸汽预处理：在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏棺物细胞壁组分，包括木 质素、半纤维素、以及纤维素，以使酶可接触纤维素和其他级分，例如，半纤维素。使纤维 素材料经过或通过反应容器，其中注入蒸汽以将温度增加至所需的温度和压力，并且在 其中保持所希望的反应时间。蒸汽预处理可以在140°C-230°C，例如160°C_200°C、或 170°C-190°C下执行，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的任意添加。蒸汽预处理的停留 时间可以是1-15分钟，例如3-12分钟、或4-10分钟，其中最佳停留时间取决于温度范围和 化学催化剂的任意添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，这样使得纤维素材料在 预处理过程中通常仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的爆发放料组合，这被 称为蒸汽爆发，即，迅速急骤蒸发至大气压和材料湍流，以通过破碎增加可及的表面积（达 夫（Duff)和默里（Murray)，1996,生物资源技术855:1-33 ;盖博（Galbe)和小林（Zacchi)， 2002,应用微生物学与生物技术（Appl.Microbiol.Biotechnol.) 59:618-628 ;美国专利申 请号2002/0164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基被裂解，并且所得到的酸自催 化半纤维素部分地水解成变得更增溶的半纤维素单糖和半纤维素寡糖。仅在有限的程度上 去除木质素。所得的液体主要包含溶解的半纤维素材料（例如半纤维素单糖和半纤维素寡 糖），而余下的固体主要由纤维素材料组成。
[0144]经常在蒸汽预处理之前添加催化剂，如H2S04或S02 (典型地0? 3 %至3 %w/w)， 这降低时间和温度、增加回收率、并且改善酶水解（巴列斯特罗斯（Ballesteros)等人， 2006,应用生物化学与生物技术129-132:496-508 ;瓦尔加（Varga)等人，2004,应用生物化 学与生物技术113-116:509-523;萨斯那（Sassner)等人，2006,酶与微生物技术（Enzyme Microb.Technol.)39:756-762)〇
[0145] 化学预处理：术语"化学处理"是指能促讲纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离 和/或释放的任何化学预处理。适合的化学预处理方法的实例包括：（例如）稀酸预处理、 石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆发（AFEX)、氨渗滤（APR)、以及有机溶剂预处理。
[0146] 在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸（典型地H2S04)和水混合以形成浆料，通过 蒸汽加热至所希望的温度，并且在停留时间后急骤蒸发至大气压。可以用许多反应器设计 来进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器、或连续逆流收缩床反应器（达夫和 默里，1996,见上文，舍尔（Schell)等人，2004,生物资源技术91:179-188;李（Lee)等人， 1999,生物化学工程与生物技术的进展65:93-115)。
[0147] 还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱性预处理包括但不限于：石灰 预处理、湿氧化、氨渗滤（APR)、以及氨纤维/冷冻爆发（AFEX)。
[0148] 用碳酸钙、氢氧化钠、或氨，在85°C-150°C的低温下进行石灰预处理，并且停留时 间为从1小时到几天（怀曼等人，2005,生物资源技术96:1959-1966 ;莫热等人，2005,生 物资源技术 96:673-686)。W0 2006/110891、W0 2006/110899、W0 2006/110900、以及W0 2006/110901披露了使用氨的预处理方法。
[0149] 湿氧化是一种热预处理，其典型地在添加氧化剂（如过氧化氢或过压 氧）的情况下在180°C-200°C下持续5-15分钟进行（施密特（Schmidt)和汤姆森 (Thomsen)，1998,生物资源技术64:139-151 ;帕罗内（Palonen)等人，2004,应用生 物化学与生物技术117:1-17 ;瓦尔加等人，2004,生物技术与生物工程（Biotechnol. Bioeng.)88:567-574;马丁（Martin)等人，2006,化学技术与生物技术杂志（J.Chem. Technol.Biotechnol.) 81:1669-1677)。预处理优选以1 %至40 %干物质，更优选2 %至 30%干物质，并且最优选5%至20%干物质进行，并且经常通过添加碱如碳酸钠来增加初 始pH。
[0150] 被称为湿爆发（湿氧化和蒸汽爆发的组合）的湿氧化预处理方法的修改方案能够 处理高达30%的干物质。在湿爆发中，在某一停留时间后，在预处理期间引入氧化试剂。然 后通过急骤蒸发至大气压结束预处理（W0 2006/03228)。
[0151] 氨纤维爆发（AFEX)涉及在如90°C-100°C的中等温度和如17至20bar的高压下， 用液体或气态氨处理纤维素材料5至10分钟，其中干物质含量可以高达60% (格拉帕里 (Gollapalli)等人，2002,应用生物化学与生物技术98:23-35;俊达瓦特（Chundawat)等 人，2007,生物技术与生物工程（Biotechnol.Bioeng.)96:219-231 ;阿里扎德（Alizadeh) 等人，2005,应用生物化学与生物技术121:1133-1141 ;泰莫里（Teymouri)等人，2005,生物 资源技术96:2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素的解聚和半纤维素的部分水解。木质 素-碳水化合物复合物被裂解。
[0152] 有机溶剂预处理通过使用含水乙醇（40% -60%乙醇）在160°C_200°C下萃 取30-60分钟而将纤维素材料脱木质素（潘（Pan)等人，2005,生物技术与生物工程 90:473-481 ;潘等人，2006,生物技术与生物工程94:851-861 ;库拉比（Kurabi)等人，2005， 应用生物化学与生物技术121:219-230)。通常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理 中，大部分半纤维素被去除。
[0153] 适合的预处理方法的其他实例由谢尔等人，2003,应用生物化学与生物技术 105-108:69-85,和马塞尔等人，2005,生物资源技术96:673-686,以及美国专利申请 2002/0164730 进行描述。
[0154] 在一个方面中，化学预处理是作为酸处理进行，例如持续稀酸和/或弱酸处理。该 酸可以是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢、 或其混合物。弱酸和/或稀酸处理优选在1-5,更优选1-4,并且最优选1-3的pH范围内进 行。在一个方面，该酸浓度在优选从0.01至20wt. %酸，更优选0.05至10wt. %酸，甚至更 优选0. 1至5wt. %酸，并且最优选0.2至2.Owt. %酸的范围中。使酸与纤维素材料相接触， 并在优选160°C-220°C，并且更优选165°C_195°C范围内的温度下保持从几秒到几分钟，例 如1秒至60分钟范围内的时间。
[0155] 在另一个方面，预处理是作为氨纤维爆发步骤（AFEX预处理步骤）进行。
[0156] 在另一方面，预处理在水性浆料中进行。在一个方面，在预处理过程中纤维素材料 以优选在10_80wt. %之间，例如20-70wt. %之间或30-60wt. %之间，例如约50wt. %的量 存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或使用本领域已知的任何方法洗涤，例如，用水洗 涤。
[0157]自水解是用于纤维素材料的预处理的一种常用的方法。将纤维素材料用无化 学品和仅有水的介质在从典型地130°C-230°C的温度和从几秒到几个小时的预处理 时间下进行处理（卡佩克-梅纳德（Capek-M6nard)等人，1987,加拿大化学工程杂志 (CanadianJournalofChemicalEngineering) 65 (4): 689-692 和萨斯可（Saska)和 奥泽（0zer)，1995,生物技术与生物工程（Biotechnol.Bioeng.)45:517_523)。该过程 引起半纤维素解聚（主要转化为可溶性寡聚体，作为主要的反应产物）和木质素转化， 归因于高温，从而增加纤维素水解的潜力（卡贝尔（Kabel)等人，2007,生物资源技术BioresourceTechnol.) 98:2034 - 2042 和李（Lee)等人，2009,生物资源技术Bioresource Technol.) 100:6434 - 6441)。
[0158] 机械预处理或物理预处理：术语"机械预处理"或"物理预处理"是指促进颗粒尺 寸减缩的任何预处理。例如，这种预处理可以涉及各种类型的研磨或碾磨（例如，干磨、湿 磨、或振动球磨）。
[0159] 纤维素材料可以物理地（机械地）且化学地预处理。机械或物理预处理可以与 以下相结合：蒸汽/蒸汽爆发、水热解（hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处 理、辐射（例如微波福射）、或其组合。在一方面，高压意指在优选约100至约400psi，更优 选约150至约250psi范围中的压力。在另一方面，高温意指在约100至约300°C，优选约 140至约200°C范围中的温度。在一个优选方面，机械或物理预处理在分批过程中使用蒸汽 枪水解器系统，例如从顺智公司（SundsDefibratorAB)，瑞典（Sweden)可获得的Sunds水 解器（SundsHydrolyzer)来进行，该系统使用如上所定义的高压和高温。这些物理预处理 和化学预处理可以根据需要顺序地进行或同时进行。
[0160] 因此，在一个方面中，对纤维素材料进行物理（机械）或化学预处理或其任意组 合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
[0161] 牛物预处理：术语"牛物预处理"是指促讲纤维素、半纤维素、和/或木质素从木 质纤维素材料中分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木 质素的微生物（参见，例如，舒?T. -A. (Hsu,T. -A. )，1996,生物质的预处理（Pretreatment ofbiomass)，生物乙醇手册：生产和利用，怀曼?（：.￡.编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团，华 盛顿特区，179-212 ;高希（Ghosh)和辛格（Singh)，1993,应用微生物学进展（Adv.Appl. Microbiol. )39:295-333 ;麦克米兰?J.D. (McMillan,J.D. )，1994,预处理木质纤维素生 物质：综述（Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview)，用于燃料生产的生物质 的酶转化（EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction)，希默尔 贝克?J. 〇.、以及奥弗伦?R.P. (Overend，R.P.)编辑，美国化学学会讨论会系列566(ACS SymposiumSeries566)，美国化学学会（AmericanChemicalSociety)，华盛顿特区， 第 15 章；贡?C.S. (Gong,C.S.)、卡奥?N.J. (Cao,N.J.)、杜?J. (Du,J.)、以及曹-G. T. (Tsao，G.T. )，1999，由可再生资源生产乙醇（Ethanolproductionfromrenewable resources)，生物化学工程/生物技术的进展，舍佩尔?T.编辑，施普林格出版社德国海 德堡柏林（BerlinHeidelberg,Germany) ,65:207-241);奥尔森（Olsson)和哈恩-哈格 达尔（Hahn-Hagerdal)，1996,酶与微生物技术（Enz.Microb.Tech.) 18:312-331 ;以及瓦 蓝德（Vallander)和埃里克松（Eriksson) ,1990,由木质纤维素材料生产乙醇：技术现状 (Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart),生物化 学工程/生物技术的进展42:63-95)。
[0162] 在一个优选实施例中，该预处理的纤维素材料是稀酸预处理的纤维素材料。在另 一个实施例中，该预处理的纤维素材料是自水解预处理的纤维素材料。
[0163]发酵:
[0164] 从该纤维素材料的水解（糖化）获得的糖可以通过能够将这些糖直接或间接发酵 成所希望的发酵产物（例如乙醇）的一种或多种（若干种）发酵微生物进行发酵。
[0165] "发酵"是指任何发酵方法或包括发酵步骤的任何方法。发酵还包括用于消费性醇 工业（例如啤酒和葡萄酒）、乳品工业（例如发酵的乳制品）、皮革工业和烟草工业的发酵 方法。发酵条件取决于所希望的发酵产物和发酵生物，并且可以由本领域的技术人员容易 地确定。
[0166] 通过一种发酵生物（例如酵母）可将从预调节的未洗涤的预处理的纤维素材料的 水解（糖化）释放的糖发酵为一种产物，例如乙醇。水解（糖化）和发酵可以是分开的或 同时的，或如上所述的。
[0167] 分开或同时的水解（糖化）和发酵包括但不限于：分开水解（糖化）和发酵 (SHF)、同时糖化和发酵（SSF)、同时糖化和共发酵（SSCF)、杂合的水解和发酵（HHF)、分开 水解和共发酵（SHCF)、杂合的水解和共发酵（HHCF)，以及直接微生物转化（DMC)。SHF使 用单独的处理步骤以首先将纤维素材料水解（糖化）为可发酵糖，例如，葡萄糖、纤维二 糖、纤维三糖、以及戊糖，并且然后将这些可发酵糖发酵成乙醇。在SSF中，纤维素材料的 酶水解和糖发酵成乙醇被组合在一个步骤中（菲利皮迪斯*G.P. (Philippidis，G.P.), 1996,纤维素生物转化技术（Cellulosebioconversiontechnology),生物乙醇手册：生产 和利用(HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization),怀曼?C.E(Wyman,C. E.)编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团（Taylor&Francis),华盛顿特区（Washington,DC), 179-212))。SSCF涉及多种糖的共发酵（希恩（Sheehan)和希默尔（Himmel)，1999,生物 技术进展（Biotechnol.Prog.) 15:817-827)。HHF涉及一个分开的水解步骤，并且另外涉 及一个同时糖化和水解步骤，这些步骤可以在同一反应器中进行。HHF过程中的步骤可以 在不同的温度下进行，即高温酶糖化，接着在发酵菌株能够耐受的更低温度下进行SSF。 DMC将全部三个过程（酶生产、水解、和发酵）组合在一个或多个（若干个）步骤中，其 中使用了相同的生物来产生用于转化纤维素材料为可发酵糖并且用于转化可发酵糖为终 产物的酶（林德（Lynd)等人，2002,微生物学与分子生物学评论（Microbiol.Mol.Biol. Reviews) 66:506-577)。在此应理解的是，本领域中已知的包括预处理、酶水解（糖化）、发 酵、或其组合的任何方法，可以用于实施本发明的方法。
[0168] 发酵牛物
[0169] "发酵生物"是指适合在发酵过程中使用以产生所希望的发酵产物的任何微生物， 包括细菌生物和真菌生物。发酵生物可以是己糖（即c6)和/或戊糖（c5)发酵生物、或其组 合。己糖和戊糖发酵生物二者均是本领域中所熟知的。适合的发酵生物能够将糖（如葡萄 糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或寡糖）直接或间接地发酵（即， 转化）成所希望的发酵产物。
[0170] 产生乙醇的细菌和真菌发酵生物的实例由琳（Lin)等人，2006,应用微生物学与 生物技术69:627-642描述。
[0171] 能够发酵(：6糖的发酵微生物的实例包括细菌生物和真菌生物，如酵母。优选的酵 母包括酵母属菌株，优选酿酒酵母。
[0172] 能够发酵仏糖的发酵生物的实例包括细菌生物和真菌生物，如酵母。优选 的C5发酵酵母包括毕赤酵母属的菌株，优选树干毕赤酵母，例如树干毕赤酵母CBS 5773 ;假丝酵母属的菌株，优选博伊丁假丝酵母（Candidaboidinii)、芸薹假丝酵母 (Candidabrassicae)、迪丹斯假丝酵母（Candidadiddensii)、假热带假丝酵母（Candida pseudotropicalis)、休哈塔假丝酵母（Candidasheatae)、或产|元假丝酵母（Candida utilis)〇
[0173] 其他发酵生物包括发酵单胞菌属的菌株，例如运动发酵单胞菌；汉逊酵母 属，例如异常汉森酵母；克鲁维酵母属，例如马克斯克鲁维酵母（K.marxianus)、乳酸 克鲁维酵母（K.lactis)、耐热克鲁维酵母（K.thermotolerans)、以及脆壁克鲁维酵 母（K.fragilis);裂殖酵母属，例如粟酒裂殖酵母（S.pombe);大肠杆菌，尤其已被 遗传修饰以提高乙醇产率的大肠杆菌菌株；梭菌属，例如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌 (Chlostridiumthermocellum)、以及phytofermentans梭菌；土芽抱杆菌属（Geobacillus sp.);热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter)，例如解糖热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter saccharolyticum);以及芽孢杆菌属，例如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，例如萨纳瑞西斯假 丝酵母（C.sonorensis)、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母（C.diddensiae)、近平滑假 丝酵母（C.parapsilosis)、C.naedodendra、布朗克假丝酵母（C.blankii)、嗜虫假丝酵母 (C.entomophilia)、芸薹假丝酵母、假热带假丝酵母、博伊丁假丝酵母、产朊假丝酵母、以及 休哈塔假丝酵母；克雷伯氏菌属，例如产酸克雷伯氏菌（K.oxytoca)。
[0174] 在一方面，酵母是酵母属种。在另一方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选方面， 酵母是糖化酵母。在另一个更优选方面，酵母是葡萄汁酵母。在另一方面，酵母是克鲁维酵 母属。在另一方面，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另 一方面，酵母是假丝酵母。在另一方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一方面，酵母是芸薹假 丝酵母。在另一方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一方面，酵母是假热带假丝酵母。在另 一方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一方面，酵母是棒孢酵母属。在另一方面，酵母是葡萄 牙棒孢酵母（Clavisporalusitaniae)。在另一方面，酵母是仙人掌棒孢酵母（Clavispora opuntiae)。在另一方面，酵母是管囊酵母属。在另一方面，酵母是嗜鞋管囊酵母。在另一 方面，酵母是毕赤酵母属。在另一方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一方面，酵母是酒香酵 母属。在另一方面，酵母是克劳森酒香酵母（菲利皮迪斯（Philippidis)，1996,纤维素生物 转化技术（Cellulosebioconversiontechnology)，生物乙醇手册：生产和利用（Handbook onBioethanol:ProductionandUtilization)，怀曼 *C.E(Wyman,C.E.)编辑，泰勒-弗朗 西斯出版集团（Taylor&Francis)，华盛顿特区（Washington,DC)，179-212))。
[0175] 能够有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌、丙酮 丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum)、热纤维梭菌（Clostridiumthermocellum)、 Clostridiumphytofermentans、土芽抱杆菌属种、解糖热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter saccharolyticum)、以及凝结芽孢杆菌（菲利皮迪斯，1996,见上文）。
[0176] 在一方面,细菌是发酵单胞菌属。在一方面，细菌是运动发酵单胞菌。在另一方 面，细菌是梭菌属。在另一方面，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一方面，细菌是Clostridium phytofermentan。在另一方面，细菌是热纤维梭菌。在另一方面，细菌是土芽孢杆菌属种。 在另一方面，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一方面，细菌是凝结芽孢杆菌。
[0177] 适于乙醇生产的可商购的酵母包括，例如乙醇红酵母（ETHANOLRED?yeast) (可从富酶泰斯/乐斯富（Fermentis/Lesaffre),USA获得）、FALI?(可从弗莱施曼酵母 (Fleischmann'sYeast)，USA获得）、SUPERSTART? 和THERM0SACC? 新鲜酵母（可从乙醇技 术（EthanolTechnology)，WI，USA)、BI0FERM?AFT和XR(可从NABC-北美生物产品公司 (NorthAmericanBioproductsCorporation),GA，USA获得）、GERTSTRAND?(可从Gert StrandAB，瑞典获得）、以及FERMIOL?(可从帝斯曼食品配料部（DSMSpecialties)获得）。
[0178] 在一个方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用木糖 的微生物、利用阿拉伯糖的微生物、以及共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
[0179] 将异源基因克隆到多种发酵微生物中已经构建出能够将己糖和戊糖转化成乙醇 (共发酵）的生物（陈（Chen)和霍（Ho)，1993,应用生物化学与生物技术仏?？1.81〇(*6111. Biotechnol.) 39-40:135-147 ;霍等人，1998,应用与环境微生物学 64:1852-1859 ;科 特（Kotter)和西拉塞（Ciriacy)，1993,应用微生物学与生物技术（Appl.Microbiol. Biotechnol.) 38:776-783 ;维尔福森（Walfridsson)等人，1995,应用与环境微生物 学61:4184-4190;凯珀（Kuyper)等人，2004,欧洲微生物学会联合会酵母研究（FEMS YeastResearch)4:655_664;比尔（Beall)等人，1991，生物技术与生物工程（Biotech. Bioeng.) 38:296-303 ;英格拉姆（Ingram)等人，1998,生物技术与生物工程58:204-214 ;张 (Zhang)等人，1995,科学（Science) 267:240-243 ;狄安妲（Deanda)等人，1996,应用与环境 微生物学 62:4465-4470 ;W0 2003/062430,木糖异构酶）。
[0180] 在一方面，遗传修饰的发酵生物是酿酒酵母。在另一方面，遗传修饰的发酵生物是 运动发酵单胞菌。在另一方面，遗传修饰的发酵生物是大肠杆菌。在另一方面，遗传修饰的 发酵生物是产酸克雷伯氏菌。在另一方面，遗传修饰的发酵生物是克鲁维酵母属。
[0181] 本领域中熟知的是，以上所描述的生物还可以用于产生其他物质，如在此所描述。
[0182] 典型地向降解的纤维素材料或水解物中添加发酵生物，并且进行发酵持续约8至 约96小时，例如约24至约60小时。温度典型地在约26°C至约60°C之间，具体地约32°C或 50°C，并且在约pH3至约pH8,例如pH4至5、6、或7左右。
[0183] 在一方面，可以对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种生物，并且进行发酵 持续约12小时至约96小时，例如24至60小时。在一方面，温度在约20°C至约60°C之间， 例如约25°C至约50°C、或约32°C至约50°C，并且pH通常是从约pH3至约pH7,例如pH 4-7左右，例如约pH5。然而，一些发酵生物（例如细菌）具有更高的最适发酵温度。酵母 或另一种微生物优选以每mL发酵液约105至1012,例如从约107至10 1(1，特别是约2X108个 活细胞计数的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指南可以见于例如"醇教材"("The AlcoholTextbook"）（K?雅克（K.Jacques)、T.P?里昂（T.P.Lyons)以及D.R.凯尔索 尔（D.R.Kelsall)编辑，诺丁汉大学出版社（NottinghamUniversityPress),联合王国 (UnitedKingdom) 1999)，其通过引用结合在此。
[0184] 对于乙醇生产，在发酵之后，可蒸馏发酵的浆料以萃取乙醇。根据本发明的工艺获 得的乙醇可用作例如燃料乙醇、饮用乙醇，即可饮用的酒精，或工业乙醇。
[0185] 发酵刺激剂
[0186] 发酵刺激剂可以用在在此所描述的过程中，以进一步改进发酵，并且特别是改进 发酵生物的性能，例如速率增加和产物产率（例如乙醇产率）。"发酵刺激剂"是指用于发酵 生物（特别是酵母）生长的刺激剂。用于生长的优选发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维 生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇、硫胺、吡哆醇、对氨基苯酸、 叶酸、核黄素、以及维生素A、B、C、D和E，例如参见阿尔弗雷多（Alfenore)等人，通过在进 料分批方法过程中的一种维生素进料策略改进乙醇产生和酿酒酵母的存活力（Improving ethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiabyavitamin feedingstrategyduringfed-batchprocess),施普林格（2002)，其通过引用结合在此。 矿物质的实例包括可以供应包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu营养素的矿物质和矿物盐。
[0187] 发酵产物
[0188] 根据本发明，（所希望的）发酵产物可以是由发酵得到的任何物质。该发酵产物可 以是（不限制）一种醇（例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、丙三醇（glycerol)、甲醇、1,3-丙 二醇、山梨醇、以及木糖醇）；一种有机酸（例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、 2, 5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙 酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、丁二酸、以及木糖酸）；一种酮（例 如，丙酮）；一种氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸）； 一种烷烃（例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷）；一种环烷烃 (例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷）；一种烯烃（例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛 烯）；以及一种气体（例如，甲烷、氢气（H2)、二氧化碳（C02)、以及一氧化碳（C0))。发酵产 物还可以是作为高价值产物的蛋白。
[0189] 在一方面，发酵产物是一种醇。应理解的是，术语"醇"涵盖包含一个或多个羟基 部分的物质。在一方面，该醇是阿拉伯糖醇。在另一方面，该醇是丁醇。在另一方面，该醇 是乙醇。在另一方面，该醇是甘油。在另一方面，该醇是甲醇。在另一方面，该醇是1，3-丙 二醇。在另一方面，该醇是山梨糖醇。在另一方面，该醇是木糖醇。参见例如，宫（Gong)， 曹（Cao)，N.J?，杜（Du)，J.，以及察奥（Tsao)，G.T.，1999,由可再生资源生产乙醇（Ethanol productionfromrenewableresources)，在生化工程/生物技术进展中，斯卡皮尔，T.， 编辑，施普林格出版社柏林海德堡，德国，65:207-241 ;西尔维拉（Silveira)和乔纳斯 (Jonas)，2002,应用微生物学与生物技术（Appl.Microbiol.Biotechnol.) 59:400-408 ;尼 加姆（Nigam)和辛格，1995,加工生物化学（ProcessBiochemistry) 30 (2): 117-124;埃塞 吉（Ezeji)等人，2003,微生物与生物技术世界杂志（WorldJournalofMicrobiologyand Biotechnology)19(6):595-603。
[0190] 在另一方面，发酵产物是有机酸。在一方面，该有机酸是乙酸。在另一方面，该有 机酸是醋酮酸。在另一方面，该有机酸是己二酸。在另一方面，该有机酸是抗坏血酸。在另 一方面，该有机酸是朽 1檬酸。在另一方面，该有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一方面， 该有机酸是甲酸。在另一方面，该有机酸是富马酸。在另一方面，该有机酸是葡糖二酸。在 另一方面，该有机酸是葡糖酸。在另一方面，该有机酸是葡糖醛酸。在另一方面，该有机酸 是戊二酸。在另一方面，该有机酸是3-轻基丙酸。在另一方面，该有机酸是衣康酸。在另 一方面，该有机酸是乳酸。在另一方面，该有机酸是苹果酸。在另一方面，该有机酸是丙二 酸。在另一方面，该有机酸是草酸。在另一方面，该有机酸是丙酸。在另一方面，该有机酸 是琥珀酸。在另一方面，该有机酸是木糖酸。参见，例如，陈（Chen)和李（Lee)，1997,生物 化学与生物技术（Biochem.Biotechnol.) 63-65:435-448。
[0191] 在另一方面，发酵产物是一种酮。应理解的是，术语"酮"涵盖包含一个或多个酮 部分的物质。在另一方面，该酮是丙酮。参见，例如，库雷希和布拉舍克，2003,见上文。
[0192] 在另一方面，发酵产物是一种氨基酸。在一方面，该氨基酸是天冬氨酸。在另一 方面，该氨基酸是谷氨酸。在另一方面，该氨基酸是甘氨酸。在另一方面，该氨基酸是赖 氨酸。在另一方面，该氨基酸是丝氨酸。在另一方面，该氨基酸是苏氨酸。参见例如理查 德（Richard)和马加里蒂（Margaritis)，2004,生物技术和生物工程（Biotechnologyand Bioengineering)87(4):501-515。
[0193] 在另一方面，发酵产物是一种烷烃。该烷烃可以是非支链或支链烷烃。在另一方 面，该烧煙是戊烧。在另一方面，该烧煙是己烧。在另一方面，该烧煙是庚烧。在另一方面， 该烷烃是辛烷。在另一方面，该烷烃是壬烷。在另一方面，该烷烃是癸烷。在另一方面，该 烷烃是十一烷。在另一方面，该烷烃是十二烷。
[0194] 在另一方面，发酵产物是一种环烷烃。在另一方面，该环烷烃是环戊烷。在另一方 面，该环烷烃是环己烷。在另一方面，该环烷烃是环庚烷。在另一方面，该环烷烃是环辛烷。
[0195] 在另一方面，发酵产物是一种烯烃。该烯烃可以是非支链或支链烯烃。在另一方 面，该烯烃是戊烯。在另一方面，该烯烃是己烯。在另一方面，该烯烃是庚烯。在另一方面， 该烯烃是辛烯。
[0196] 在另一方面，发酵产物是异戊二烯。在另一方面，发酵产物是聚酮化合物。
[0197] 在另一方面，发酵产物是一种气体。在另一方面，该气体是甲烷。在另一方面，该气 体是H2。在另一方面，该气体是C02。在另一方面，该气体是C0。参见例如，片R(Kataoka) 等人，1997,水科学与技术（WaterScienceandTechnology)36(6-7):41_47;以及古纳森 兰（Gunaseelan)，1997,生物质与生物能源（BiomassandBioenergy) 13(1-2) :83_114。
[0198] 通並：
[0199] 可以使用本领域已知的任何方法，任选地在发酵之后回收发酵产物，这些方法包 括但不限于：色谱法、电泳程序、差别溶解度、蒸馏、或萃取。例如，通过常规蒸馏方法从发 酵的甘蔗废物中分离和纯化醇。例如，可以获得纯度高达约96体积％的乙醇，其可以用作 (例如）燃料乙醇、饮用乙醇，即，饮用中性酒、或工业乙醇。
[0200] 塵
[0201] 以下部分说明了可以根据本发明的方法使用的多肽和酶。
[0202] 酚氣化酶
[0203] 根据本发明所使用的酚氧化酶可以是任何酚氧化酶。该酚氧化酶可以是任何起源 的，但优选真菌或细菌起源的。
[0204] 这一种或多种酚氧化酶可属于以下EC类中的任一种，该EC类包括：漆酶（EC 1. 10. 3. 2)、儿茶酚氧化酶（EC1. 10. 3. 1)、〇-氨基酚氧化酶（1. 10. 3. 4)、以及单酚单加氧 酶（1. 14. 18. 1)。漆酶是优选的。
[0205] 漆酶
[0206] 漆酶（EC1. 10. 3. 2.)是含多拷贝的酶，该酶催化酚类化合物的氧化。漆酶是由 植物、细菌以及广泛多样的真菌产生，这些真菌包括子囊菌纲，例如曲霉属、脉孢菌属、以及 柄孢壳菌属；半知菌纲，包括葡萄孢属；以及担子菌纲，例如金钱菌属、层孔菌属、香菇属、 侧耳属、栓菌属、以及完全形式的丝核菌属。已经分离了多种真菌漆酶。例如，崔（Choi) 等人（分子植物-微生物相互作用（Mol.Plant-MicrobeInteractions) 5:119-128， 1992)说明了栗疫病真菌的编码漆酶的基因的分子特性和克隆。小岛（Kojima)等人 (生物化学杂志（J.Biol.Chem.) 265:15224-15230,1990;JP2-238885)提供 了白腐 担子菌毛革盖菌的两种等位基因形式的漆酶。杰曼（Germann)和勒奇（Lerch)(经验 (Experientia)41:801(1985);PNASUSA83:8854-8858(1986))已报道了粗糙脉孢菌漆 酶基因的克隆和部分测序。萨洛黑莫（Saloheimo)等人（应用微生物学杂志（J.Gen. Microbiol.) 137:1537-1544(1985) ;W0 92/01046)已披露来自真菌射脉菌的漆酶基因的 结构分析。
[0207] 尤其考虑到的漆酶包括源自于以下的一种菌株的那些：多孔菌属，优选匹斯特斯 多孔菌（Polyporuspinsitus);白丝菌属（Melanocarpus)，优选热白丝菌（Melanocarpus albomyces);蚀丝霉属，优选嗜热丝霉（Myceliophtorathermophila);鬼伞属，优选灰盖 鬼伞；丝核菌属，优选立枯丝核菌或草地丝核菌（Rhizoctoniapraticola);革节孢属，优 选嗜热革节孢（Scytalidiumthermophilum);梨孢属，优选稻梨孢。
[0208]在一个实施例中，该漆酶源自于漆树（吉田（Yoshida)，1883,漆的化学 (ChemistryofLacquer(Urushi))第 1 部分.化学学会会刊（J.Chem.Soc.)43:472_486。
[0209] 在另一个实施例中，该漆酶源自于匹斯特斯多孔菌，例如W0 96/00290(诺维信） 中所述的一种。
[0210] 强森（Jdnsson)等人，1998,应用微生物学和生物技术如卩1.]\1；[01'013；[01. Biotechnol.)49,691-697也披露了一种源自于云芝的适合的漆酶。
[0211] 其他漆酶包括例如穆拉利克里希纳（Muralikrishna)等人，1995,应用与环境微 生物学（Appl.Environ.Microbiol. )61 (12)4374-4377中关注的源自于稻梨孢的一种，或 披露于美国化学学会论文第209卷，第1-2期（1995)的摘要中的源自于嗜热革节孢的漆 酶。
[0212] 该漆酶还可以是一种源自于灰盖鬼伞的漆酶，例如施耐德（Schneider)等人， 1999,酶与微生物技术（EnzymeandMicrobialTechnology)25:502_508 中关注的那种。
[0213] 其他适合的漆酶包括在威尔伊司内尔（Waleithner)等人，1996,当代遗传学 (Curr.Genet. )29 :395-403中关注的源自于立枯丝核菌的、或纪斯基内恩（Kiiskinen)等 人，2004,微生物学（Microbiology) 150:3065-3074中关注的源自于热白丝菌的那些。
[0214] 适合的细菌漆酶包括源自于天蓝色链霉菌的那些，例如由马赫印斯基 (Machczynski)等人，2004,蛋白质科学（ProteinScience) 13:2388-2397 披露的。
[0215] 在一个优选实施例中，该漆酶源自于嗜热毁丝霉，例如W0 95/33836 (诺维信）中 所述的那种。
[0216] 考虑到的漆酶还包括含与W0 95/33836中披露的嗜热毁丝霉漆酶或以上提到的 漆酶中的任一种具有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 % -致 性，至少97%、至少98%、至少99% -致性的氨基酸序列的那些。
[0217] 半纤维素酶
[0218] 用在本发明的方法中的半纤维素酶可以是任何半纤维素酶。该半纤维素酶可以是 任何起源的，但优选真菌或细菌起源的。
[0219] 术语"半纤维素酶"或"半纤维素分解酶"意指一种或多种（若干种）水解 半纤维素材料的酶。参见例如沙勒姆（Shallom)和肖汉姆（Shoham)，2003，微生物 半纤维素酶（Microbialhemicellulases)?医学病毒学评论（CurrentOpinionIn Microbiology) 6 (3) :219-228中所述的。半纤维素酶是在植物生物质的降解中的关键组 分。半纤维素酶的实例包括但不限于：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖 酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸 酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。半纤维素酶的催化模块是水解 糖苷键的糖苷水解酶（GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键的碳水化合物酯酶（CE)。 这些催化模块基于它们一级序列的同源性，可以通过数字进行标记而被分配到GH和CE 家族中。具有总体相似的折叠的一些家族可以进一步被分组为以字母标记的氏族（例 如，GH-A)。这些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分类可在碳水化合物 活性酶（Carbohydrate-ActiveEnzymes) (CAZy)数据库中获得。可以根据高斯和比萨拉 (Bisaria)，1987,纯粹与应用化学（Pure&AppI.Chem.) 59:1739-1752测量半纤维素分解酶 活性。
[0220] 木聚糖酶
[0221] 在一个优选实施例中，该半纤维素酶是一种"木聚糖酶"。术语"木聚糖酶"意指 1，4-0-D-木聚糖-木糖水解酶（E.C. 3. 2. 1. 8)，其催化木聚糖中的1，4-0-D-木糖苷键的 内切水解。出于本发明的目的，在37°C下在0. 01%TRITON?X-100和200mM磷酸钠缓 冲液（pH6)中用0.2%AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来测定木聚糖酶活性。一个单 位的木聚糖酶活性定义为在37°C、pH6下在200mM磷酸钠（pH6)缓冲液中从作为底物的 0. 2%AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1. 0微摩尔天青蛋白。
[0222] 特别考虑到的木聚糖酶的实例包括GH10木聚糖酶，例如源自于曲霉属的菌株的 一种，例如来自烟曲霉的菌株的，例如在W0 2006/078256中披露为XylIII的一种，或来自 棘孢曲霉的菌株的，例如在W0 94/21785中披露为SEQIDN0:5(XylII)的一种。
[0223] 根据本发明用于预调节的木聚糖酶可包括在一种纤维素分解酶制剂（其进一步 包括一种木聚糖酶）中。在一个实施例中，半纤维素酶是一种纤维素分解酶制剂，该制剂进 一步包括一种木聚糖酶，优选一种GH10木聚糖酶，例如源自于曲霉属的菌株的一种，例如 来自烟曲霉的菌株的，例如在W0 2006/078256中披露为XylIII的那种，或来自棘孢曲霉 的菌株的，例如在W0 94/21785中披露为SEQIDN0:5(XylII)的那种。
[0224] 考虑到的木聚糖酶还包括含与W0 2006/078256中的烟曲霉XylIII、或W0 94/21785中披露为SEQIDN0:5(XylII)的棘孢曲霉木聚糖酶具有至少60%、至少70%、 至少80%、至少85%、至少90%、至少95%-致性，至少97%、至少98%、至少99%-致性 的氨基酸序列的那些。
[0225] P-木糖苷酶
[0226] 在一个优选实施例中，用在本发明的方法或工艺中的半纤维素酶是一种" 木 糖苷酶"。术语" 0 -木糖苷酶"意指一种0 -D-木糖苷木糖水解酶（E.C. 3. 2. 1. 37)，其催 化短0 (1 - 4)-木寡糖的外水解，以从非还原性末端去除连续的D-木糖残基。出于本发 明的目的，一个单位的木糖苷酶定义为在40°C、pH5下在含有0.01%TWEEN? 20 的100mM柠檬酸钠中从作为底物的ImM对硝基苯基-P-D-木糖苷每分钟产生1. 0微摩尔 的对硝基苯酚阴离子。
[0227] 特别考虑到的木糖苷酶的实例包括源自于曲霉属的菌株的那种，例如烟曲霉 的菌株，例如在美国临时申请号61/577, 609 (实例16和17-SEQIDN0:15 [DNA序列]和 SEQIDN0:16 [推导的氨基酸序列])中披露的那种，或源自于木霉属的菌株，例如里氏木霉 的菌株，例如在W0 2011/057140中为SEQIDN0:58的成熟多肽。
[0228] 在预调节过程中使用的3 _木糖苷酶可包括在一种纤维素分解酶制剂中。在一个 实施例中，该半纤维素酶是一种纤维素分解酶制剂，该制剂进一步包括一种木糖苷酶， 例如源自于曲霉属的菌株的一种，例如烟曲霉的菌株（例如披露于W0 2011/057140中的一 种），例如在美国临时申请号61/526, 833和61/577, 609 (实例16和17-SEQIDNO: 15[DNA 序列]和SEQIDN0:16[推导的氨基酸序列])中披露的那些，或源自于木霉属的菌株，例 如里氏木霉的菌株，例如在W0 2011/057140中SEQIDN0:58的成熟多肽。
[0229] 考虑到的木糖苷酶还包括含与W0 2011/057140中披露为SEQIDN0:206的 烟曲霉木糖苷酶或此处提到的木糖苷酶中的任一种具有至少60%、至少70%、至 少80%、至少85%、至少90%、至少95%-致性，至少97%、至少98%、至少99% -致性的 氨基酸序列的那些。
[0230] 用于预调节的半纤维素酶是或可包括一种商业半纤维素酶产品。商业半纤维素 酶产品的实例包括：例如SHEARZYME?(诺维信A/S)、CELLIC?HTec(诺维信A/S)、CELLIC? HTec2 (诺维信A/S)、CELLIC?HTec3 (诺维信A/S)、VISCOZYME'? (诺维信A/S)、 ULTRAFLO? (诺维信A/S)、PULPZYME?HC(诺维信A/S)、MULTIFECT?木聚糖酶（杰能科）、￡〇3?1；1^|^1乂-20(^仏8酶仏8￡1^711168))、邯？ 6000木聚糖酶 (帝斯曼〇)SM))、DEP0L?333P(生物催化剂有限公司（BiocatalystsLimit)，英国威尔士 (Wales,UK))、DEP0L?740L。（生物催化剂有限公司，英国威尔士）以及DEP0L?762P(生物 催化剂有限公司，英国威尔士）。
[0231] 纤维素分解酶制剂
[0232] 纤维素分解酶制剂是包含水解纤维素材料的一种或多种（例如若干种）酶的一种 制剂。此类酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤 维素分解活性的两种基本方法包括：（1)测量总纤维素分解活性，以及（2)测量单独的纤维 素分解活性（内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及葡糖苷酶），如在张（Zhang)等人， 纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略（Outlookforcellulaseimprovement:Screening andselectionstrategies)，2006,生物技术进展（BiotechnologyAdvances) 24:452-481 中所综述的。通常使用不溶底物，包括沃特曼（Whatman)N2 1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维 素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解活性。最常用的总纤维 素分解活性测定是使用沃特曼（Whatman)N2 1滤纸作为底物的滤纸测定。该测定法是由 国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC)建立的（高斯（Ghose)，1987,纯粹与应用化学（Pure Appl.Chem.) 59 :257_68)。
[0233] 出于本发明的目的，通过在以下条件下测量由一种或多种纤维素分解酶进行的纤 维素材料水解的增加来确定例如针对一种纤维素分解酶制剂的纤维素分解酶活性 ：l_5〇mg 的纤维素分解酶蛋白/g于PCS中的纤维素（或其他预处理的纤维素材料），在适合的温度 (例如50°C、55°C、60°C、或65°C)下持续3-7天，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相 比。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶性固体，50mM乙酸钠（pH5)，lmM MnS04, 50°C、55°C、60°C、或 65°C，72 小时，通过AMINEX?HPX-87H柱（伯乐实验室有限 公司，美国加州赫拉克勒斯）进行糖分析。
[0234] 如以上所述的在本发明的一种工艺中用于糖化（水解）的一种纤维素分解酶制剂 典型地包括一种或多种内切葡聚糖酶、纤维素生物质水解酶（cellubiohydrolase)和/或 葡糖苷酶。
[0235] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂源自于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌 株；腐质霉属的菌株，例如特异腐质霉的菌株，和/或金孢子菌属的菌株，例如拉克淖金孢 子菌（Chrysosporiumlucknowense)的菌株。在一个优选实施例中，该纤维素分解酶制剂 源自于里氏木霉的菌株。
[0236] 该纤维素分解酶制剂可进一步包括以下多肽（例如酶）中的一种或多种：具有纤 维素分解增强活性的GH61多肽、0 -葡糖苷酶、木聚糖酶、0 -木糖苷酶、CBHI、CBHII，或其 两种、三种、四种、五种或六种的混合物。
[0237] 该另外的一种或多种多肽（例如GH61多肽）和/或一种或多种酶（例如3-葡 糖苷酶、木聚糖酶、3-木糖苷酶、CBH1和/或CBH ii)对于该纤维素分解酶制剂生产生物 (例如里氏木霉）可以是外来的。
[0238] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61 多肽和一种葡糖苷酶。
[0239] 在另一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种具有纤维素分解增强活性的 GH61多肽、一种0 -葡糖苷酶、以及一种CBHI。
[0240] 在另一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种具有纤维素分解增强活性的 GH61多肽、一种0 -葡糖苷酶、一种CBHI以及一种CBHII。
[0241] 其他酶（例如内切葡聚糖酶）还可包括在该纤维素分解酶制剂中。P_葡糖苷酶
[0242]术语" 0 -葡糖苷酶"意指一种0 -D-葡糖苷葡糖水解酶（E.C. 3. 2. 1. 21)，其催化 末端非还原性P-D-葡萄糖残基的水解，并释放P-D-葡萄糖。出于本发明的目的，根据 文丘里（Venturi)等人，2002,基础微生物学杂志（J.BasicMicrobiol.) 42:55-66的基本 程序确定0 -葡糖苷酶活性。一个单位的0 -葡糖苷酶定义为在25°C、pH 4. 8下，在含有 0. 01%TWEEN? 20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的ImM对硝基苯基-D-吡喃葡萄 糖苷每分钟产生1. 〇微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
[0243] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂可包括一种或多种（例如若干种）葡糖 苷酶。在一个实施例中，该葡糖苷酶可以是源自于曲霉属（例如米曲霉）的一种，例如 TO2002/095014中披露的那种或具有葡糖苷酶活性的披露于W0 2008/057637中的融 合蛋白，或源自于烟曲霉，例如披露于W0 2005/047499中的一种或烟曲霉葡糖苷酶变 体，例如W02012/044915(通过引用结合在此）中披露的一种，例如具有以下取代中的一个 或多个（优选全部）：F100D、S283G、N456E、F512Y。
[0244] 在另一个实施例中，该葡糖苷酶源自于青霉属的菌株，例如披露于W0 2007/019442中的巴西青霉（Penicilliumbrasilianum)的菌株，或木霉属的菌株，例如里 氏木霉的菌株。
[0245] 考虑到的3 -葡糖苷酶包括含与W0 2002/095014中披露的米曲霉或TO 2008/057637中披露的具有0 -葡糖苷酶活性的融合蛋白具有至少60%、至少70%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%-致性，至少97%、至少98%、至少99%-致性的氨 基酸序列的那些。
[0246] 考虑到的葡糖苷酶还包括含与W0 2005/047499中披露为SEQIDN0:2的氨 基酸20至863的烟曲霉葡糖苷酶（通过引用结合在此）或以上提到的葡糖苷酶 中的任一种具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95% -致性， 至少97%、至少98%、至少99% -致性的氨基酸序列的那些。
[0247] 具有纤维素分解增强活性的多肽
[0248] 术语"具有纤维素分解增强活性的多肽"意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤 维素材料的水解的增强的GH61多肽。
[0249] 出于本发明的目的，通过测量在以下条件下来自由纤维素分解酶水解纤维素材料 的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性：在PCS中 l-50mg总蛋白/g纤维素，其中总蛋白包括50-99. 5%w/w的纤维素分解酶蛋白和0. 5-50% w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白，在合适的温度（例如50°C、55°C或 60°C)下，持续1-7天，与不具有纤维素分解增强活性、具有相等总蛋白装载的对照水解 (在PCS中，l-50mg纤维素分解蛋白/g纤维素）相比较。在一个优选方面，使用在总蛋白 质重量的2%-3%的米曲霉葡糖苷酶（根据W0 02/95014在米曲霉中重组产生）或总 蛋白质重量的2%-3%的烟曲霉葡糖苷酶（如W0 02/95014中所描述在米曲霉中重组 产生）的纤维素酶蛋白负载量存在的情况下CELLUCLAST⑧1.5L(诺维信A/S)，丹麦 巴格斯瓦尔德（Bagsvaerd,Denmark))的混合物作为纤维素分解活性的来源。
[0250] 术语"家族 61 糖苷水解酶（Family61GlycosideHydrolase) " 或"家族GH61" 或"GH61"是指属于根据亨利萨塔（Henrissat)，1991，生物化学期刊（Biochem.J. )280 : 309-316,以及亨利萨塔和巴洛赫（Bairoch)，1996,生物化学期刊，316 :695-696的糖苷水 解酶家族61的一种多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中测量到的非常弱的 内切-1，4-0 -D葡聚糖酶活性而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式必定 是不规范的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于它们在与一种纤维素分解酶结 合使用时增强纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
[0251] 具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维 素分解酶的量降低优选至少1. 01倍、更优选至少1. 05倍、更优选至少1. 10倍、更优选至少 1. 25倍、更优选至少1. 5倍、更优选至少2倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至 少5倍、甚至更优选至少10倍、以及最优选至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶 催化的纤维素材料的水解。
[0252] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂可包括一种或多种具有纤维素分解增强活 性的GH61多肽。在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种具有纤维素分解增强活 性的GH61多肽，例如源自于嗜热子嚢菌属的一种，例如橙色嗜热子囊菌的菌株，例如在W0 2005/074656描述为SEQIDN0:2的那种；或源自于梭孢壳菌属的一种，例如太瑞斯梭孢壳 霉的菌株，例如在W0 2005/074647描述为SEQIDN0:8那种；或源自于曲霉属的菌株的一 种，例如烟曲霉的菌株，例如在W0 2010/138754描述为SEQIDN0:2的那种；或源自于源于 青霉属的菌株的一种，例如埃默森青霉菌的菌株，例如W0 2011/041397中披露的那种。
[0253] 考虑到的GH61多肽还包括含与W0 2005/074656中披露为SEQIDN0:2的橙色嗜 热子囊菌GH61多肽、W0 2005/074647中披露为SEQIDN0:8的太瑞斯梭孢壳霉GH61多肽、 或TO2011/041397中披露的埃默森青霉菌GH61多肽具有至少60%、至少70%、至少80%、 至少85 %、至少90 %、至少95 % -致性，至少97 %、至少98 %、至少99 % -致性的氨基酸序 列的那些（所有参考文献通过引用结合在此）。
[0254] 纤维二糖水解酶
[0255] 术语"纤维二糖水解酶"意指一种1，4-0 -D-葡聚糖纤维二糖水解酶 (E.C. 3. 2. 1. 91)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含有0 -1，4-连接葡萄糖的聚合物中 的1，4-0 -D-糖苷键的水解，从而从链的还原性或非还原性末端释放纤维二糖（泰里 (Teeri)，1997,生物技术趋势（TrendsinBiotechnology) 15:160-167;泰里等人，1998,生 物化学学会会刊（Biochem.Soc.Trans.) 26:173-178)。根据里弗（Lever)等人，1972,分析 生物化学（Anal.Biochem.)47:273_279 ;范?帝伯赫（vanTilbeurgh)等人，1982,欧洲生 化学会联合会快报（FEBSLetters)，149:152-156 ;范?帝伯赫和克莱森斯（Claeyssens)， 1985,欧洲生化学会联合会快报，187:283-288 ;以及汤美（Tomme)等人，1988,欧洲生物化 学杂志（Eur.J.Biochem.) 170:575-581所描述的程序来测定纤维二糖水解酶活性。在本发 明中，汤美等人的方法可以用于测定纤维二糖水解酶活性。
[0256] CBH I
[0257] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂可包括一种或多种CBH I (纤维二糖水解酶 I)。在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种纤维二糖水解酶I (CBH I)，例如源自于 曲霉属的菌株的一种，例如烟曲霉的菌株，例如在W0 2011/057140中披露为SEQIDN0:2 的Ce 17A CBHI，或源自于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。
[0258] 考虑到的CBHI酶还包括含与来自烟曲霉的在W0 2011/057140(通过引用结合在 此）中被披露为3￡〇10勵:2的〇617六08111具有至少60%、至少70%、至少80%、至少 85%、至少90%、至少95%-致性，至少97%、至少98%、至少99% -致性的氨基酸序列的 那些。
[0259] CBH II
[0260] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂可包括一种或多种CBHII(纤维二糖水解 酶II)。在一个实施例中，该纤维二糖水解酶II(CBHII)，例如源自于曲霉属的菌株的一种， 例如烟曲霉的菌株；或木霉属的菌株，例如里氏木霉，或梭孢壳菌属的菌株，例如太瑞斯梭 孢壳霉的菌株，例如来自太瑞斯梭孢壳霉的纤维二糖水解酶IICEL6A。
[0261] 考虑到的CBH II酶还包括含与源自于烟曲霉的在共同未决的美国临时申请号 61/577,609(通过引用结合在此）中被披露为SEQ ID N0:3[DNA序列]和SEQ ID N0:4(推 导的氨基酸序列）的CBH II具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至 少95%-致性，至少97%、至少98%、至少99% -致性的氨基酸序列的那些。
[0262] 内切葡聚糖酶
[0263] 术语"内切葡聚糖酶"意指一种内切-1，4- (1，3 ; 1，4) - @ -D-葡聚糖4-葡聚糖水 解酶（E.C. 3. 2. 1. 4)，其催化纤维素、纤维素衍生物（如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素）、 地衣多糖中的1，4- 0 -D-糖苷键和混合的0 -1，3葡聚糖如谷类0 -D-葡聚糖或木葡聚糖 以及含有纤维素组分的其他植物材料中的0-1，4键的内切水解。可以通过测量底物粘度 的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性（张等人， 2006,生物技术进展24:452-481)。为了本发明的目的，使用羧甲基纤维素（CMC)作为底物， 根据在Ghose，1987,纯粹与应用化学（PureandAppl.Chem.) 59 :257-268中所述的过程， 在pH5、40°C下，确定内切葡聚糖酶的活性。
[0264] 如以上提到的，该纤维素分解酶制剂可包括多种不同的多肽，包括酶。
[0265] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种里氏木霉纤维分解制剂，该里氏 木霉纤维分解制剂进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽（W0 2005/074656)、以及米曲霉0 -葡糖苷酶融合蛋白（W0 2008/057637)。
[0266] 在另一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种里氏木霉纤维素分解酶制 齐U，该里氏木霉纤维素分解酶制剂进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子 囊菌GH61A多肽（W0 2005/074656中的SEQIDN0:2)、以及烟曲霉葡糖苷酶（W0 2005/047499 的SEQIDN0:2)。
[0267] 在另一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种里氏木霉纤维素分解酶制剂， 该里氏木霉纤维素分解酶制剂进一步包括披露于W0 2011/041397中的具有纤维素分解增 强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、以及烟曲霉葡糖苷酶（W0 2005/047499的SEQID NO:2)〇
[0268] 在另一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种里氏木霉纤维素分解酶制 齐U，该里氏木霉纤维素分解酶制剂进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉 菌GH61A多肽（披露于W0 2011/041397)，以及烟曲霉葡糖苷酶变体（披露于TO 2012/044915 (通过引用结合在此）），具有以下取代：F100D、S283G、N456E、F512Y。
[0269] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂还包括一种木聚糖酶（例如源自于棘孢曲 霉或烟曲霉）和/或一种0-木糖苷酶（例如源自于烟曲霉）。
[0270] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种里氏木霉纤维分解制剂，该里氏 木霉纤维分解制剂进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽（W0 2005/074656)、米曲霉葡糖苷酶融合蛋白（W0 2008/057637)、以及棘孢曲霉木聚糖酶 (W0 94/21785 中的XylII)。
[0271] 在另一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种里氏木霉纤维分解制剂，该里 氏木霉纤维分解制剂进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽 (W0 2005/074656 中的SEQIDN0:2)、烟曲霉 葡糖苷酶（TO2005/047499 中的SEQID N0:2)、以及棘孢曲霉木聚糖酶（披露于W0 94/21785中的XylII)。
[0272] 在另一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种里氏木霉纤维分解制剂，该里 氏木霉纤维分解制剂进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽 (W0 2005/074656 中的SEQIDN0:2)、烟曲霉 葡糖苷酶（TO2005/047499 中的SEQID N0:2)、以及棘孢曲霉木聚糖酶（披露于W0 94/21785中的XylII)。
[0273] 在另一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种里氏木霉纤维分解制剂，该里 氏木霉纤维分解制剂进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽（披 露于TO2011/041397 中）、烟曲霉 葡糖苷酶（TO2005/047499 中的SEQIDN0:2)、以 及烟曲霉木聚糖酶（W0 2006/078256中的XylIII)。
[0274] 在另一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种里氏木霉纤维分解制剂，该里 氏木霉纤维分解制剂进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽（披 露于W0 2011/041397 中）、烟曲霉 葡糖苷酶（W0 2005/047499 中的SEQIDN0:2)、烟 曲霉木聚糖酶（W0 2006/078256中的XylIII)以及在W0 2011/057140中被披露为SEQID N0:2的来自烟曲霉的Cel7ACBHI。
[0275] 在另一个实施例中，该纤维素分解制剂包括一种里氏木霉纤维素分解制剂，该里 氏木霉纤维素分解制剂进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽 (W0 2011/041397 中披露的）、烟曲霉 葡糖苷酶（W0 2005/047499 的SEQIDN0:2)、 烟曲霉木聚糖酶（WO2006/078256中的XylIII)、Cel7ACBHI(来自烟曲霉，在TO 2011/057140中被披露为SEQIDN0:2)、以及CBHII(源自于烟曲霉，在共同未决的美国临 时#61/577,609被披露为5￡〇10勵:3〇)嫩序列]和5￡〇10勵 :4(推导的氨基酸序列））。
[0276] 在另一个实施例中，该纤维素分解制剂包括一种里氏木霉纤维素分解制剂，该里 氏木霉纤维素分解制剂进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽 (W0 2011/041397中披露的）、烟曲霉葡糖苷酶变体（披露于共同未决的美国临时申请 #61/388, 997 (通过引用结合在此），具有以下取代：F100D、S283G、N456E、F512Y)、烟曲霉木 聚糖酶（W0 2006/078256 中的 Xyl III)、Cel7A CBH I (来自烟曲霉，在TO2011/057140 中 被披露为SEQ ID N0:2)、以及CBH II (源自于烟曲霉，在美国临时申请号61/577, 609被披 露为SEQ ID N0:3[DNA序列]和SEQ ID N0:4(推导的氨基酸序列））。
[0277] 也考虑到披露于美国临时申请号61/577, 609的所有纤维素分解酶制剂并通过引 用结合在此。
[0278] 该纤维素分解酶制剂包括或可进一步包括选自下组的一种或多种（若干种）蛋白 质，该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、 苹果菌素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
[0279] 在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂是或包括一种商业纤维素分解酶制剂。
[0280] 适用于在本发明中使用的商业化纤维素分解酶制剂的实例包括例如 CELLIC?CTec(诺维信A/S)、CELLIC?Ctec2 (诺维信A/S)、CELLIC?Ctec3 (诺维 信A/S)、CELLUCLAST?(诺维信A/S)、N0V0ZYM?188 (诺维信A/S)、CELLUZYME?(诺维 信A/S)、CEREFL0?(诺维信A/S)、以及ULTRAFL0?(诺维信A/S)、ACCELERASE?(杰 能科公司（GenencorInt.))、LAMINEX?(杰能科公司）、SPEZYME?CP(杰能科公 司）、R0HAMENT?7069W(罗姆公司（R6hmGmbH))、FIBREZYME'?LDI(并矢国 际公司OyadicInternational，Inc. ))、FIBREZYME?LBR(并矢国际公司）、或 VISCOSTAR? 150L(并矢国际公司）。
[0281]在糖化期间可以按从约0. 001至约5.Owt. %的固体（TS)，更优选从约0. 025至约 4.Owt. %的固体，最优选从约0. 005至约2.Owt. %的固体（TS)的有效量添加该纤维素分解 酶制剂。
[0282] 通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
[0283] 材料&方法
[0284]材料:
[0285] 漆酶A:漆酶源自于披露于W0 95/33836中的嗜热毁丝霉。
[0286] 半纤维素酶A:来自里氏木霉的纤维素分解酶制剂，包括源自于棘孢曲霉的木聚 糖酶（披露于W0 94/21785中的XylII)。
[0287] 纤维素分解酶制剂A:纤维素分解酶制剂，来自里氏木霉，进一步包括具有纤维素 分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽（W0 2005/074656中的SEQIDN0:2)、以及烟 曲霉 0 -葡糖苷酶（WO2005/047499 的SEQIDNO:2)。
[0288] TAPPI标准方法：水分保留值（WRV) ;TAPPI:UM256 ;在1991之前发布；评审并保 留于UMSET-2011 ;?. 2011TAPPI。
[0289] 实例 1
[0290] 未洗涤的稀酸预处理的玉米秸杆（uwPCS)。将uwPCS的pH值用50%NaOH溶液调 节至5.1。用水分分析器对总固体（TS)含量进行测定。将预设量的经pH调节的uwPCS添 加到罐式反应器中。添加初始的水、青霉素溶液和预调节酶--漆酶（即漆酶A，25微克酶 蛋白/g纤维素）和/或半纤维素酶（即半纤维素酶A，250微克酶蛋白/g纤维素）溶液。 用于预调节的TS是22%。在50°C下预调节过夜。在预调节之后，检验pH并且如果需要调 节到5.0。在pH调节之后，添加水解酶（纤维素分解酶制剂A)和补给水。用于水解的最 终TS是20%。在50°C下酶水解5天。在酶水解之后，取出100g水解产物，并用TAPPI标 准方法（UM256,对于水分保留值）从固体中分离液体，将全部浆体在900g离心30min。所 分离的液体的结果显示在表1中。液体产率分别从72. 8%被提高到77. 6% (仅半纤维素 酶）和81. 6% (漆酶/半纤维素酶组合）。
[0291] 表1-来自酶水解产物的液体产率
[0292]
【权利要求】
1. 一种从预处理的纤维素材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤： i) .预调节预处理的纤维素材料； ii) 使用一种纤维素分解酶制剂进行水解； iii) 用微生物发酵糖； 其中进行得到一个固体级分和一个液体级分的一个固液分离步骤： a) 在预调节后但在水解前；或 b) 在水解后但在发酵前； 其中存在或添加一种酚氧化酶和/或一种半纤维素酶： -在预调节过程中；或 -在预调节后但在水解前；或 -在水解过程中。
2. 如权利要求1所述的方法，其中存在或添加一种酚氧化酶： -在预调节过程中；或 -在预调节后但在水解前；或 -在水解过程中。
3. 如权利要求1所述的方法，其中存在或添加一种半纤维素酶： -在预调节过程中；或 -在预调节后但在水解前；或 -在水解过程中。
4. 如权利要求1所述的方法，其中存在或添加一种酚氧化酶和一种半纤维素酶： -在预调节过程中；或 -在预调节后但在水解前；或 -在水解过程中。
5. 如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该酚氧化酶是一种漆酶。
6. 如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该半纤维素酶选自一种木聚糖酶（例如 一种棘孢曲霉或烟曲霉木聚糖酶）以及一种木糖苷酶（例如烟曲霉β-木糖苷酶）。
7. 如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该纤维素材料是未解毒的。
8. 如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该纤维素材料是未洗涤的。
9. 如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该固液分离是在预调节后但在水解前进 行。
10. 如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该预处理的纤维素材料是稀酸预处理 的纤维素材料。
11. 如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中从该固液分离步骤所得到的固体级分 被水解并且然后被发酵。
12. 如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中从该固液分离步骤所得到的液体级分 被发酵。
13. 如权利要求1-12的任一项所述方法，其中任选地回收来自该固体级分和/或该液 体级分发酵的发酵产物。
14. 如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中在固液分离后该液体级分被解毒。
15. 如权利要求14所述的方法，其中该解毒的液体级分与该固体级分一起被水解并且 然后被发酵。
16. 如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中从该固液分离步骤所得到的固体级分 被水解并且然后与从该固液分离步骤所得到的液体级分一起被发酵。
17. 如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中该固液分离是在水解后但在发酵前进 行。
18. 如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中从该固液分离步骤所得到的液体级分 被发酵并任选地被回收。
19. 如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中该预处理的纤维素材料是自水解的预 处理的纤维素材料。
20. 如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中固液分离是在预调节后但在水解前进 行。
【文档编号】C12P19/00GK104271755SQ201380024641
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2013年5月29日 优先权日:2012年5月29日
【发明者】李鑫, M·T·史密斯, B·埃姆, L·帕特南 申请人:诺维信公司, 诺维信北美公司