靶向b-细胞成熟抗原的嵌合抗原受体的制作方法

靶向b-细胞成熟抗原的嵌合抗原受体的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种分离的且纯化的核酸序列，其编码针对B-细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)。本发明还提供了表达CAR的宿主细胞，诸如T-细胞或自然杀伤(NK)细胞，和用于破坏多发性骨髓瘤细胞的方法。
【专利说明】靶向B-细胞成熟抗原的嵌合抗原受体
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本专利申请要求2012年4月11日提交的美国临时专利申请号61/622,600的权 益，其通过引用整体并入本文。
[0003] 电子递夺的材料通讨引用并入
[0004] 通过引用整体并入本文的是，与本文一起提交并如下标识的计算机可读的核苷酸 /氨基酸序列表：一个42, 589字节的ASCII (文本）文件，名称为"712361_ST25. TXT"，创建 于2013年3月14日。
[0005] 发明背景
[0006] 多发性骨髓瘤（MM)是以克隆浆细胞的积累为特征的恶性肿瘤（参见，例如， Palumbo 等人，New England J. Med.，364 (11) : 1046-1060 (2011)，和 Lonial 等人，Clinical Cancer Res. ,17(6): 1264-1277 (2011))。MM的当前疗法经常造成缓解，但是几乎所有 的患者最终会复发和死亡（参见，例如，Lonial等人，出处同上，和Rajkumar, Nature Rev.Clinical 0ncol.，8(8):479_491(2011))。已经证实，同种异体造血干细胞移植 会诱导免疫介导的骨髓瘤细胞的消除；但是，该方案的毒性较高，且鲜有患者被治愈 (参见，例如，Lonial 等人，出处同上，和 Salit 等人，Clin. Lymphoma, Myeloma, and Leukemia, 11 (3) :247-252 (2011))。当前，MM尚不存在临床上有效的、FDA批准的单克隆抗 体或自体 T-细胞疗法（参见，例如，Richardson 等人，British J. Haematology, 154 (6): 7 45-754(2011)，和 Yi, Cancer Journal, 15(6):502-510(2009))。
[0007] 经过遗传修饰以识别恶性肿瘤相关抗原的T-细胞的过继转移正在显示出作为 治疗癌症的新方案的希望（参见，例如，Morgan等人，Science, 314(5796) : 126-129(200 6) ;Brenner 等人，Current Opinion in Immunology, 22 (2) : 251-257 (2010) ；Rosenberg 等人，Nature Reviews Cancer, 8(4):299-308(2008) ,Kershaw 等人，Nature Reviews Immunology, 5 (12) : 928-940 (2005);和 Pule 等人，Nature Medicine, 14 (I I) : 1264-1270 (2 008))。可以将T-细胞遗传修饰成表达嵌合抗原受体（CAR)，所述嵌合抗原受体是包含抗原 识别部分和T-细胞活化结构域的融合蛋白（参见，例如，Kershaw等人，出处同上，Eshhar 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (2) : 720-724 (1993)，和 Sadelain 等人，Curr. Opin. Immunol.，21 (2):215-223(2009))。
[0008] 就B-细胞谱系恶性肿瘤而言，在开发利用抗-⑶19CAR的过继性T-细 胞方案中已经取得了广泛的进展（参见，例如，Jensen等人，Biology of Blood and Marrow Transplantation, 16 : 1245-1256 (2010) ；Kochenderf er 等 人，Blood, 116(20):4099-4102(2010) ;Porter 等人，The New England Journal of Medicine, 365(8):725-733(2011) ;Savoldo 等人，Journal of Clinical Investigatio n，121 (5):1822-1826(2011), Cooper 等人，Blood, 101(4):1637-1644(2003) ;Brentjens 等人，Nature Medicine，9(3):279_286(2003);和 Kalos 等人，Science Translational Medicine, 3 (95) :95ra73 (2011))。过继转移的、抗-CD19-CAR转导的T-细胞已经治 愈了小鼠中的白血病和淋巴瘤（参见，例如，Cheadle等人，Journal of Immunolog y，184(4):1885-1896(2010) ;Brentjens 等人，Clinical Cancer Research, 13(18Pt I) : 5426-5435 (2007);和 Kochenderfer 等人，Blood, 116 (19) : 3875-3886 (2010))。在早期 临床试验中，过继转移的、用抗-CD 19CAR转导的T-细胞会根除白血病和淋巴瘤患者中的 正常和恶性 B-细胞（参见，例如，Kochenderfer 等人，Blood, 116(20) :4099-4102(2010); Porter 等人，出处同上，Brentjens 等人，Blood, 118(18):4817-4828(2011);和 Kochenderfer等人，Blood, 2011年12月8日（印刷之前的电子出版物（2012))。但是，CD19 仅罕见地在多发性骨髓瘤的恶性浆细胞上表达（参见，例如，Gupta等人，Amer. J. Clin. Pathology, 132(5) :728-732(2009);和 Lin 等人，Amer. J. Clin. Pathology, 121(4) :482-48 8(2004))。
[0009] 因而，仍然需要可以用在治疗多发性骨髓瘤的方法中的组合物。本发明提供了这 样的组合物和方法。


【发明内容】

[0010]
[0011] 本发明提供了一种分离的或纯化的编码嵌合抗原受体（CAR)的核酸序列，其中所 述CAR包含抗原识别部分和T-细胞活化部分，且其中所述抗原识别部分是针对B-细胞成 熟抗原（BCMA)。

【专利附图】

【附图说明】
[0012] 图IA和IB的图描绘的实验数据解释了跨多种人细胞类型的BCM的表达模式，如 使用定量PCR所确定的。将结果表示为每IO 5肌动蛋白cDNA拷贝的BCM cDNA拷贝的数 目。
[0013] 图2A-2L的图描绘的实验数据解释了，细胞表面BCM表达在多发性骨髓瘤细胞系 上检测到，但是没有在其它类型的细胞上检测到，如在实施例1中所述。对于所有图，实线 代表用抗-BCM抗体染色，且虚线代表用同种型匹配的对照抗体染色。所有图均为在活细 胞上门控的。
[0014] 图3A的简图描绘了一种编码抗-BCM CAR的核酸构建体。从N-端至C-端， 抗-BCM CAR包括：抗-BCM scFv、⑶8 α分子的铰链和跨膜区域、⑶28分子的细胞质部分 和⑶3 ζ分子的细胞质部分。
[0015] 图3B-3D的图描绘的实验数据解释了，抗-bcmalCAR、抗-bcma2CAR和SP6CAR(在 实施例2中描述）在T-细胞的表面上表达。在未转导的（UT)细胞上发生微小抗-Fab染 色。所述图为在CD3+淋巴细胞上门控的。图上的数字是每个象限中的细胞的百分比。
[0016] 图4A-4C的图描绘的实验数据解释了，表达抗-BCM CAR的T-细胞以BCM-特异 性的方式将T-细胞脱粒，如在实施例3中所述。所述图为在活CD3+淋巴细胞上门控的。图 上的数字是每个象限中的细胞的百分比。
[0017] 图5A-?的图描绘的实验数据解释了，表达抗-BCM CAR的T-细胞以BCM-特异 性的方式将T-细胞脱粒，如在实施例3中所述。所述图为在活CD3+淋巴细胞上门控的。图 上的数字是每个象限中的细胞的百分比。
[0018] 图6A-6C的图描绘的实验数据解释了，表达抗-BCM CAR的T-细胞以BCM-特异 性的方式产生细胞因子IFN γ、IL-2和TNF，如在实施例3中所述。所述图为在活⑶3+淋巴 细胞上门控的。图上的数字是每个象限中的细胞的百分比。
[0019] 图7A的图描绘的实验数据解释了，表达抗-bcma2CAR的T-细胞特异性地响应于 BCM而增殖。图6B的图描绘的实验数据解释了，表达SP6CAR的T-细胞没有特异性地响应 于BCM而增殖。
[0020] 图7C和7D的图描绘的实验数据解释了，得自供体A的表达抗-bcma2CAR的T-细 胞在4小时细胞毒性测定中在不同的效应物：靶细胞比率下特异性地杀死了多发性骨髓瘤 细胞系H929 (图6C)和RPMI8226 (图6D)。用阴性对照SP6CAR转导的T-细胞在所有效应 物：靶标比率下诱导了低得多的细胞毒性水平。对于所有效应物：靶标比率，一式两份地 确定细胞毒性，并将结果表示为平均值土平均值标准误差。
[0021] 图8A的图描绘的实验数据解释了，BCM在得自骨髓瘤患者3的原发性骨髓多发 性骨髓瘤细胞的表面上表达，如在实施例5中所述。该图为在CD38 SCD56+浆细胞（它们构 成骨髓细胞的40% )上门控的。
[0022] 图8B的图描绘的实验数据解释了，得自供体C的用抗-bcma2CAR转导的同种异体 T-细胞在与骨髓瘤患者3的未操作的骨髓细胞共培养以后产生IFN γ，如在实施例5中所 述。图7B也表明，得自同一同种异体供体的、表达抗-bcma2CAR的T-细胞当与得自骨髓瘤 患者3的外周血单核细胞（PBMC) -起培养时产生了少得多的IFNy。另外，得自供体C的、 表达SP6CAR的T-细胞没有特异性地识别骨髓瘤患者3的骨髓。
[0023] 图8C的图描绘的实验数据解释了，从骨髓瘤患者1切除的浆细胞瘤含有93%的浆 细胞，且这些原代浆细胞表达BCMA，如通过针对BCM的流式细胞计量术（实线）和同种型 匹配的对照染色（虚线）揭示的。该图为在浆细胞上门控的。
[0024] 图8D的图描绘的实验数据解释了，得自骨髓瘤患者1的、表达抗-bcma2CAR的 T-细胞特异性地响应于自体浆细胞瘤细胞而产生IFN γ。
[0025] 图8E的图描绘的实验数据解释了，得自骨髓瘤患者1的、表达抗-bcma2CAR的 T-细胞在低效应物：靶标比率下特异性地杀死了自体浆细胞瘤细胞。相反，得自骨髓瘤患 者1的、表达SP6CAR的T-细胞表现出对自体浆细胞瘤细胞的低细胞毒性水平。对于所有 的效应物：靶标比率，一式两份地确定细胞毒性，并将结果表示为平均值土平均值标准误 差。
[0026] 图9A的图描绘的实验数据解释了，用抗_bcma2CAR转导的T-细胞可以破坏在小 鼠中建立的多发性骨髓瘤肿瘤。图9B的图描绘了用表达抗-bcma2CAR的T-细胞治疗的荷 瘤小鼠相对于对照的存活。
[0027] 发明的详细描沭
[0028] 本发明提供了一种分离的或纯化的编码嵌合抗原受体（CAR)的核酸序列，其中所 述CAR包含抗原识别部分和T-细胞活化部分。嵌合抗原受体（CAR)是人工构建的杂合蛋 白或多肽，其含有与T-细胞信号传导或T-细胞活化结构域连接的抗体（例如，单链可变片 段（scFv))的抗原结合结构域。CAR具有利用单克隆抗体的抗原结合性质以非-MHC限制 的方式将T-细胞特异性和反应性重新指向选定靶标的能力。非-MHC限制的抗原识别会给 表达CAR的T-细胞提供不依赖于抗原加工而识别抗原的能力，由此绕过肿瘤逃逸的主要机 制。此外，当在T-细胞中表达时，CAR有利地不会与内源性T-细胞受体（TCR) α和β链 二聚化。
[0029] "核酸序列"意图包括DNA或RNA的聚合物（即，多核苷酸），其可以是单链的或双 链的，且其可以含有非天然的或改变的核苷酸。本文中使用的术语"核酸"和"多核苷酸"表 示任意长度的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸（RNA)还是脱氧核糖核苷酸（DNA)。这 些术语表示分子的一级结构，且因而包括双链和单链DNA、以及双链和单链RNA。该术语包 括作为等同物的、从核苷酸类似物和经修饰的多核苷酸（例如、但不限于甲基化的和/或加 帽的多核苷酸）产生的RNA或DNA的类似物。
[0030] "分离的"是指从其天然环境取出核酸。"纯化的"是指，给定的核酸的纯度已经增 力口，其中"纯度"是相对术语，而不是"绝对纯度"，所述给定的核酸是已经从自然界中取出的 核酸（包括基因组DNA和mRNA)或在实验室条件下合成的（包括cDNA)和/或扩增的核酸。 但是，应当理解，核酸和蛋白可以用稀释剂或佐剂配制，且仍然为了实用目的而分离。例如， 当用于引入细胞中时，通常将核酸与可接受的载体或稀释剂混合。
[0031] 本发明核酸序列编码这样的CAR:其包含针对B-细胞成熟抗原（BCMA，也被称 作CD269)的抗原识别部分。BCM是肿瘤坏死因子受体超家族的一个成员（参见，例 如，Thompson 等人，J.Exp. Medicine, 192(1) :129-135(2000),和 Mackay 等人，Annu. Rev. Immunol. ,21:231-264(2003))。BCMA 结合 B-细胞活化因子（BAFF)和诱导增殖的 配体（APRIL)(参见，例如，Mackay等人，出处同上，和Kalled等人，Immunological Reviews, 204:43-54(2005))。在非恶性细胞中，已经报道BCMA主要在浆细胞和成熟 B-细胞的子集中表达（参见，例如，Laabi等人，EMBO J.，11(11) :3897-3904(1992); Laabi 等人，Nucleic Acids Res. ,22(7) :1147-1154(1994) ;Kalled 等人，出 处同上；O'Connor 等人，J.Exp. Medicine，199 (I) :91-97 (2004);和 Ng 等人，J. Immunol. ,173(2) :807-817 (2004))。BCMA缺陷型小鼠是健康的，且具有正常数目的 B-细胞，但是长寿浆细胞的存活是受损的（参见，例如，0' Connor等人，出处同上； Xu 等人，Mol.Cell. Biol. ,21(12) :4067-4074(2001);和 Schiemann 等人，Science，2 93(5537) :2111-2114(2001))。几个研究人员已经在多发性骨髓瘤细胞中普遍地检测 出BCMA RNA，且已经在得自多发性骨髓瘤患者的浆细胞的表面上检测出BCMA蛋白（参 见，例如，Novak 等人，Blood, 103(2) :689-694(2004) ;Neri 等人，Clinical Cancer Research, 13(19) :5903-5909(2007) ;Bellucci 等人，Blood, 105(10) :3945-3950(2005); 和 Moreaux 等人，Blood, 103 (8) : 3148-3157 (2004))。
[0032] 本发明核酸序列编码包含抗原识别部分的CAR，所述抗原识别部分含有针对BCM 的单克隆抗体或其抗原结合部分。本文中使用的术语"单克隆抗体"表示这样的抗体：其由 B-细胞的单一克隆产生，并结合相同表位。相比之下，"多克隆抗体"表示这样的抗体群：其 由不同的B-细胞产生，且结合相同抗原的不同表位。由本发明核酸序列编码的CAR的抗原 识别部分可以是完整抗体或抗体片段。完整抗体通常由4条多肽组成：两条相同的重（H) 链多肽拷贝和两条相同的轻（L)链多肽拷贝。每条重链含有一个N端可变（V h)区和三个C 端恒定（CHp CHjPCH3)区，并且每条轻链含有一个N端可变（VJ区和一个C端恒定（Q) 区。每对轻链和重链的可变区形成抗体的抗原结合位点。V 1^P'区具有相同的基本结构， 每个区域包含四个框架区，所述框架区的序列是相对保守的。所述框架区通过三个互补性 决定区（⑶R)相连。所述三个⑶R(被称作⑶RlXDR2和⑶R3)形成抗体的"高变区"，其负 责抗原结合。
[0033] 术语"抗体的片段"、"抗体片段"、"抗体的功能片段"和"抗原结合部分"在本文 中互换地用于表示抗体的一个或多个片段或部分，其保留特异性地结合抗原的能力（通 常，参见，Holliger 等人，Nat. Biotech.，23(9) :1126-1129(2005))。由本发明核酸序列 编码的CAR的抗原识别部分可以含有任意结合BCM的抗体片段。所述抗体片段理想地包 含例如一个或多个CDR、可变区（或其部分）、恒定区（或其部分）或它们的组合。抗体 片段的例子包括，但不限于：（i) Fab片段，其是由'、Vh、（^和CH1结构域组成的单价片段； (ii)F(ab'） 2片段，其是包含两个在铰链区通过二硫键连接的Fab片段的二价片段；（iii) Fv片段，其由抗体的单个臂的' 和Vh结构域组成；（iv)单链Fv(scFv)，其是由Fv片段 的两个结构域（即，'和Vh)通过合成接头连接组成的单价分子，所述合成接头能够使所 述两个结构域合成为单条多肽链（参见，例如，Bird等人，Science, 242:423-426 (1988); Huston 等人，Proc.Natl. Acad. Sci.USA，85:5879-5883 (1988);和 Osbourn 等人，Nat. Biotechnol.，16:778(1998));和（V)双体，其为多肽链的二聚体，其中每条多肽链包含通 过肽接头连接至 '的Vh，所述肽接头因为太短而不允许在同一多肽链上的Vh与' 之间配 对，由此驱动在不同Vh-'多肽链上的互补结构域之间配对，以产生具有两个功能性抗原结 合位点的二聚体分子。抗体片段是本领域已知的，且更详细地描述在例如美国专利申请公 开2009/0093024A1中。在优选的实施方案中，由本发明核酸序列编码的CAR的抗原识别部 分包含抗 -BCMA单链Fv (scFv)。
[0034] 单克隆抗体的抗原结合部分或片段可以是任意大小，只要该部分会结合BCMA。在 这方面，针对BCM的单克隆抗体（在本文中也被称作"抗-BCM单克隆抗体"）的抗原结合 部分或片段理想地包含约5至18 (例如，约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或前 述值中的任意2个限定的范围）个氨基酸。
[0035] 在一个实施方案中，本发明核酸序列编码这样的抗原识别部分：其包含抗-BCMA 单克隆抗体的可变区。在这方面，所述抗原识别部分包含抗-BCM单克隆抗体的轻链可变 区、重链可变区、或轻链可变区和重链可变区二者。优选地，由本发明核酸序列编码的CAR 的抗原识别部分包含抗-BCM单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区。结合BCM的重链 和轻链单克隆抗体氨基酸序列公开在例如国际专利申请公开W02010/104949中。
[0036] 在另一个实施方案中，本发明核酸序列编码包含信号序列的CAR。所述信号序列可 以位于抗原识别部分的氨基端（例如，抗-BCM抗体的可变区）。所述信号序列可以包含任 意合适的信号序列。在一个实施方案中，所述信号序列是人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因 子（GM-CSF)受体序列或CD8a信号序列。
[0037] 在另一个实施方案中，所述CAR包含铰链序列。本领域普通技术人员会明 白，铰链序列是促进抗体柔性的短氨基酸序列（参见，例如，Woof等人，Nat. Rev. Immunol.，4(2) :89-99(2004))。所述铰链序列可以位于抗原识别部分（例如，抗-BCMA scFv)和T-细胞活化部分之间。所述铰链序列可以是从任意合适的分子衍生出或得到的任 意合适的序列。在一个实施方案中，例如，所述铰链序列源自人CDSa分子或CD28分子。
[0038] 本发明核酸序列编码包含T-细胞活化部分的CAR。T-细胞活化部分可以是从任 意合适分子衍生出或得到的任意合适部分。例如，在一个实施方案中，所述T-细胞活化部 分包含跨膜结构域。所述跨膜结构域可以是从本领域已知的任意分子衍生出或得到的任意 跨膜结构域。例如，所述跨膜结构域可以从CDSa分子或CD28分子得到或衍生出。CD8是 充当T-细胞受体（TCR)的共受体的跨膜糖蛋白，并且主要在细胞毒性T-细胞的表面上表 达。⑶8的最常见形式作为由⑶8 α和⑶8 β链组成的二聚体存在。⑶28在T-细胞上表 达，并提供T-细胞活化所需的共刺激性信号。CD28是CD80 (Β7. 1)和CD86 (Β7. 2)的受体。 在优选的实施方案中，所述⑶8 α和⑶28是人的。
[0039] 除了跨膜结构域以外，所述T-细胞活化部分还包含细胞内的（S卩，细胞质的） T-细胞信号传导结构域。细胞内T-细胞信号传导结构域可以得自或源自CD28分子、 ⑶3 ζ ( ζ )分子或其修饰形式、人Fc受体γ (FcR γ )链、⑶27分子、0X40分子、4-1ΒΒ分子 或本领域已知的其它细胞内信号传导分子。如以上所讨论的，CD28是在T-细胞共刺激中 至关重要的T-细胞标志物。⑶3 ζ与TCR结合以产生信号，且含有基于免疫受体酪氨酸的 活化基序（ITAMs)。4-1ΒΒ (也被称作CD137)将有效的共刺激信号传送至T-细胞，从而促 进T淋巴细胞的分化和增强其长期存活。在优选的实施方案中，所述⑶28、⑶3 ζ、4-1ΒΒ、 0X40和CD27是人的。
[0040] 由本发明核酸序列编码的CAR的T-细胞活化结构域可以包含前述跨膜结构域中 的任一个与前述细胞间T-细胞信号传导结构域中的任意一个或多个的任意组合。例如， 本发明核酸序列可以编码这样的CAR :其包含⑶28跨膜结构域以及⑶28和⑶3 ζ的细胞 内T-细胞信号传导结构域。可替换地，例如，本发明核酸序列可以编码这样的CAR :其包含 ⑶8 α跨膜结构域以及⑶28、⑶3 ζ、Fc受体γ (FcR γ )链和/或4-1BB的细胞内T-细胞 信号传导结构域。
[0041] 在一个实施方案中，本发明核酸序列编码这样的CAR:从5'至3'，其包含粒细 胞-巨噬细胞集落刺激因子受体（GM-CSF受体）信号序列、抗-BCM scFv、人⑶8 α分子 的铰链和跨膜区域、人CD28分子的细胞质T-细胞信号传导结构域和人CD3 ζ分子的T-细 胞信号传导结构域。在另一个实施方案中，本发明核酸序列编码这样的CAR :从5'至3'，其 包含人⑶8 α信号序列、抗-BCM scFv、人⑶8 α分子的铰链和跨膜区域、人⑶28分子的 细胞质T-细胞信号传导结构域和人CD3(分子的T-细胞信号传导结构域。在另一个实施 方案中，本发明核酸序列编码这样的CAR:从5'至3'，其包含人⑶8 α信号序列、抗-BCM scFv、人CD8 α分子的铰链和跨膜区域、人4-1ΒΒ分子的细胞质T-细胞信号传导结构域和/ 或人0X40分子的细胞质T-细胞信号传导结构域和人CD3 ζ分子的T-细胞信号传导结构 域。例如，本发明核酸序列包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核酸序列或 由其组成。
[0042] 本发明还提供了分离的或纯化的由本发明核酸序列编码的嵌合抗原受体（CAR)。
[0043] 本发明核酸序列可以编码任意长度的CAR，即，所述CAR可以包含任意数目的氨基 酸，前提条件是，所述CAR保留它的生物学活性，例如，特异性地结合抗原、检测哺乳动物中 的患病细胞、或治疗或预防哺乳动物中的疾病等的能力。例如，所述CAR可以包含50或更 多（例如，60或更多、100或更多或500或更多）个氨基酸，但是小于1,000(例如，900或更 少、800或更少、700或更少或600或更少）个氨基酸。优选地，所述CAR是约50至约700 个氨基酸（例如，约70个、约80个、约90个、约150个、约200个、约300个、约400个、约 550个或约650个氨基酸）、约100个至约500个氨基酸（例如，约125个、约175个、约225 个、约250个、约275个、约325个、约350个、约375个、约425个、约450个或约475个氨 基酸）、或由前述值中的任意两个限定的范围。
[0044] 在本发明的范围内包括编码本文中描述的CAR的功能部分的核酸序列。当结合 CAR使用时，术语"功能部分"表示本发明的CAR的任何部分或片段，所述部分或片段保留其 来源CAR(亲本CAR)的生物学活性。功能部分包括，例如，这样的CAR部分：其保留识别靶 细胞或者检测、治疗或预防疾病的能力，达到与亲本CAR相似的程度、相同的程度或更高的 程度。关于编码亲本CAR的核酸序列，编码CAR的功能部分的核酸序列可以编码这样的蛋 白：其包含亲本CAR的例如约10%、25%、30%、50%、68%、80%、90%、95%或更多。
[0045] 本发明核酸序列可以编码这样的CAR功能部分：其含有位于所述部分的氨基或羧 基端或者两端的额外氨基酸，所述额外氨基酸不存在于亲本CAR的氨基酸序列中。理想地， 所述额外氨基酸不干扰所述功能部分的生物学功能，例如，识别靶细胞、检测癌症、治疗或 预防癌症等。更理想的是，与亲本CAR的生物学活性相比，所述额外氨基酸增强所述CAR的 生物学活性。
[0046] 本发明还提供了编码前述CAR的功能变体的核酸序列。本文中使用的术语"功能 变体"表示与由本发明核酸序列编码的CAR具有基本或显著序列同一性或相似性的CAR、多 肽或蛋白，所述功能变体保留所述功能变体作为其变体的CAR的生物学活性。功能变体包 括，例如，这样的本文所述的CAR(亲本CAR)的变体：所述变体保留识别靶细胞的能力，达到 与亲本CAR相似的程度、相同的程度或更高的程度。关于编码亲本CAR的核酸序列，编码所 述CAR的功能变体的核酸序列可以与编码亲本CAR的核酸序列具有例如约10%同一性、约 25%同一 1丨生、约30%同一1丨生、约50%同一1丨生、约65%同一1丨生、约80%同一 1丨生、约90%同一1丨生、 约95%同一性、或约99%同一性。
[0047] 功能变体可以，例如，包含由本发明核酸序列编码的CAR的氨基酸序列，其具有 至少一个保守的氨基酸置换。短语"保守氨基酸置换"或"保守突变"表示，将一个氨基酸 替换为另一个具有共同性质的氨基酸。定义各个氨基酸之间的共同性质的一种有用方式 是，分析同源生物的对应蛋白之间的归一化氨基酸变化频率（Schulz, G.E.和Schirmer, R. H. , Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)) 〇 根据这样的 分析，可以定义氨基酸组，其中在组内的氨基酸优先彼此交换，且因此在它们对总蛋白结构 的影响方面彼此最相似（Schulz，G.E.和Schirmer，R.H.，出处同上）。保守突变的例子包 括在上述亚组内的氨基酸的氨基酸置换，例如，用赖氨酸置换精氨酸，反之亦然，使得可以 维持正电荷；用谷氨酸置换天冬氨酸，反之亦然，使得可以维持负电荷；用丝氨酸置换苏氨 酸，使得可以维持游离-OH ;和用谷氨酰胺置换天冬酰胺，使得可以维持游离-NH2。
[0048] 可替换地或额外地，所述功能变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸置换的亲 本CAR的氨基酸序列。"非保守突变"涉及不同组之间的氨基酸置换，例如，用赖氨酸置换色 氨酸，或用苯丙氨酸置换丝氨酸等。在该情况下，优选的是，所述非保守氨基酸置换不会干 扰或抑制所述功能变体的生物学活性。所述非保守氨基酸置换可能增强所述功能变体的生 物学活性，使得所述功能变体的生物学活性与亲本CAR相比增加。
[0049] 本发明核酸序列可以编码这样的CAR(包括其功能部分和功能变体）：其包含合成 的氨基酸以替代一个或多个天然存在的氨基酸。这样的合成的氨基酸是本领域已知的，且 包括，例如，氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰基氨基甲基-半 胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、 4-羧基苯丙氨酸、β -苯基丝氨酸β -羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α -萘基丙氨酸、环己基 丙氨酸、环己基甘氨酸、吲哚啉-2-甲酸、1，2, 3, 4-四氢异喹啉-3-甲酸、氨基丙二酸、氨基 丙二酸单酰胺、Ν' -苄基-Ν' -甲基-赖氨酸、Ν'，Ν' -二苄基-赖氨酸、6-羟赖氨酸、鸟氨 酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰 烷）_甲酸、α， Υ-二氨基丁酸、α，β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
[0050] 本发明核酸序列可以编码这样的CAR(包括其功能部分和功能变体）：其被糖基 化、酰胺化、羧酸酯化、磷酸化、酯化、N-酰化、环化（例如经由二硫键），或转化成酸加成盐， 和/或任选地二聚化或聚合、或缀合。
[0051] 在优选的实施方案中，本发明核酸序列编码这样的CAR :其包含SEQ ID NO:4、SEQ IDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11*SEQ ID NO: 12的氨基酸序列或者由所述氨基酸序列组成。
[0052] 使用本领域已知的方法，可以制备本发明核酸序列。例如，使用标准重组DNA 方法，可以重组产生核酸序列、多肽和蛋白（参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版,Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001 ;和 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates andjohn Wiley&Sons, NY, 1994)。此外，可以从诸如植物、细菌、昆 虫或哺乳动物（例如，大鼠、人等）等来源分离和/或纯化合成制备的编码CAR的核酸序列。 分离和纯化的方法是本领域众所周知的。可替换地，可以商业地合成本文描述的核酸序列。 在这方面，本发明核酸序列可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。
[0053] 本发明还提供了一种载体，其包含编码本发明的CAR的核酸序列。所述载体可以 是，例如，质粒、粘粒、病毒载体（例如，逆转录病毒或腺病毒）或噬菌体。合适的载体和载体 制备方法是本领域众所周知的（参见，例如，Sambrook等人，出处同上，和Ausubel等人， 出处同上）。
[0054] 除了编码CAR的本发明核酸序列以外，所述载体优选地包含表达控制序列，诸如 启动子、增强子、聚腺苷酰化信号、转录终止子、内核糖体进入位点（IRES)等，其提供所述 核酸序列在宿主细胞中的表达。示例性的表达控制序列是本领域已知的，且描述在，例如， Goeddel, Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,第 185 卷，Academic Press, San Diego, Calif. (1990)中
[0055] 得自多种不同来源的大量启动子（包括组成型、诱导型和阻抑型启动子）是本领 域众所周知的。启动子的代表性来源包括，例如病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌，并 且得自这些来源的合适启动子是容易得到的，或者可以基于公众可得到的序列（例如从保 藏机构诸如ATCC以及其它商业或个体来源）合成地制备。启动子可以是单向的（即，在一 个方向起始转录）或双向的（即，在3'或5'方向起始转录）。启动子的非限制性例子包 括例如T7细菌表达系统、pBAD(araA)细菌表达系统、巨细胞病毒（CMV)启动子、SV40启动 子和RSV启动子。诱导型启动子包括例如Tet系统（美国专利5, 464, 758和5, 814, 618)、 蜕皮激素可诱导的系统（No 等人，Proc. Natl. Acad. Sci.，93:3346-3351 (1996))、T-REX? 系 统（Invitrogen, Carlsbad, CA)、LACSWITCH? 系统（Stratagene, San Diego, CA)和 Cre-ERT 他莫昔芬可诱导的重组酶系统（Indra等人，Nuc. Acid. Res.，27:4324-4327(1999) ;Nuc. Acid. Res.，28: e99 (2000);美国专利 7, 112, 715 ;和 Kramer&Fussenegger, Methods Mol. Biol.，308:123-144(2005))。
[0056] 本文中使用的术语"增强子"表示这样的DNA序列：其增加例如它所可操作地连接 的核酸序列的转录。增强子可以位于核酸序列编码区的数千碱基以外，并且可以介导调控 因子的结合、DNA甲基化的类型、或DNA结构的改变。得自多种不同来源的大量增强子是本 领域众所周知的，且可以作为克隆的多核苷酸得到或在克隆的多核苷酸内（得自，例如保 藏机构诸如ATCC以及其它商业或个体来源）。许多包含启动子（如常用的CMV启动子）的 多核苷酸也包含增强子序列。增强子可以位于编码序列的上游、内部或下游。术语"Ig增 强子"表示从位于免疫球蛋白（Ig)基因座内的增强子区域衍生出的增强子元件（这样的 增强子包括例如重链（mu) 5'增强子、轻链（κ) 5'增强子、κ和mu内含子增强子和3'增 强子）（通常参见 Paul W. E.(编），Fundamental Immunology,第 3 版，Raven Press, New York(1993)，第 353-363 页；和美国专利 5, 885, 827)。
[0057] 载体还可以包含"选择性标记基因"。本文中使用的术语"选择性标记基因"表示 这样的核酸序列：其在有对应选择剂存在下允许表达所述核酸序列的细胞被特异性选择 或抑制。合适的选择性标记基因是本领域已知的，且描述于，例如，国际专利申请公开WO 1992/08796 和 WO 1994/28143 ;Wigler 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:3567 (1980); O' Hare 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527(1981) ;Mulligan&Berg，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072(1981) ;Colberre-Garapin 等人，J.Mol.Biol·，150:1 (1981); Santerre 等人，Gene, 30:147(1984) ;Kent 等人，Science, 237:901-903(1987); Wigler 等人，Cell, 11:223 (1977) ;Szybalska&Szybalski，Proc.Natl. Acad. Sci. USA，48:2026(1962);Lowy 等人，Cell, 22:817(1980);和美国专利 5, 122,464 和 5, 770, 359。
[0058] 在某些实施方案中，所述载体是"附加型表达载体"或"附加体"，其在有适当的选 择压力存在下能够在宿主细胞中复制，并且作为染色体外DNA片段存在于宿主细胞中（参 见，例如，Conese等人，Gene Therapy, 11:1735-1742(2004))。代表性的商购可得的附加 型表达载体包括、但不限于：利用爱泼斯坦-巴尔核抗原I(EBNAl)和爱泼斯坦-巴尔病 毒（EBV)复制起点（oriP)的附加型质粒。得自Invitrogen (Carlsbad, CA)的载体pREP4、 pCEP4、pREP7 和 pcDNA3. 1 以及得自 Stratagene (La Jolla, CA)的 pBK-CMV 代表使用 T-抗 原和SV40复制起点替代EBNAl和oriP的附加型载体的非限制性例子。
[0059] 其它合适的载体包括整合表达载体，其可以随机整合进宿主细胞的DNA中，或者 可能包括能够实现表达载体与宿主细胞的染色体之间的特异性重组的重组位点。这样的整 合表达载体可以利用宿主细胞染色体的内源性表达控制序列来实现期望蛋白的表达。以 位点特异性方式整合的载体的例子包括，例如，得自Invitrogen(Carlsbad, CA)的flp-in 系统的组件（例如，pcDNA?5/FRT)，或cre-lox系统，诸如可见于得自Stratagene(La Jolla，CA)的pExchange-6核心载体。随机整合进宿主细胞染色体中的载体的例子包括， 例如得自Invitrogen(Carlsbad, CA)的pcDNA3.1(在没有T-抗原存在下引入）和得自 Promega(Madison, WI)的 pCI 或 pFNIOA(ACT)FLEXI?。
[0060] 还可以使用病毒载体。代表性的病毒表达载体包括，但不限于，基于腺病毒的载体 (例如，基于腺病毒的Per. C6系统，其可得自Crucell, Inc. (Leiden,荷兰），基于慢病毒的 载体（例如，基于慢病毒的pLPl，其得自Life Technologies (Carlsbad, CA))，和逆转录病 毒载体（例如，得自Stratagene (La Jolla, CA)的pFB-ERV和pCFB-EGSH)。在优选的实施 方案中，所述病毒载体是慢病毒载体。
[0061] 可以将包含编码CAR的本发明核酸的载体引入能够表达由其编码的CAR的宿主细 胞中，所述宿主细胞包括任意合适的原核或真核细胞。优选的宿主细胞是这样的宿主细胞： 其可以容易地且稳定地生长，具有相当快速的生长速率，具有确定地表征的表达系统，并且 可以被容易地和有效地转化或转染。
[0062] 本文中使用的术语"宿主细胞"表示可以含有表达载体的任何类型的细胞。所述宿 主细胞可以是真核细胞，例如，植物、动物、真菌或藻类，或者可以是原核细胞，例如，细菌或 原生动物。所述宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即，直接分离自生物体（例如人） 的细胞。所述宿主细胞可以是粘附细胞或悬浮细胞，即，在混悬液中生长的细胞。合适的宿 主细胞是本领域已知的，并且包括，例如，DH5a大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO 细胞、COS细胞、HEK293细胞等。为了扩增或复制重组表达载体的目的，所述宿主细胞可以 是原核细胞，例如，DH5a细胞。为了制备重组CAR的目的，所述宿主细胞可以是哺乳动物 细胞。所述宿主细胞优选地是人细胞。所述宿主细胞可以是任何细胞类型，可以源自任何 类型的组织，并且可以处于任何发育阶段。在一个实施方案中，所述宿主细胞可以是外周血 淋巴细胞（PBL)、外周血单核细胞（PBMC)或自然杀伤（NK)细胞。优选地，所述宿主细胞是 自然杀伤（NK)细胞。更优选地，所述宿主细胞是T-细胞。用于选择合适的哺乳动物宿主 细胞的方法和用于转化、培养、繁殖、筛选和纯化细胞的方法是本领域已知的。
[0063] 本发明提供了一种分离的宿主细胞，其表达编码本文描述的CAR的本发明核酸序 列。在一个实施方案中，所述宿主细胞是T-细胞。本发明的T-细胞可以是任意T-细胞， 诸如培养的T-细胞，例如，原代T-细胞，或者得自培养的T-细胞系的T-细胞，或得自哺乳 动物的T-细胞。如果得自哺乳动物，T-细胞可以得自众多来源，包括、但不限于血液、骨髓、 淋巴结、胸腺或其它组织或流体。T-细胞也可以被富集或纯化。T-细胞优选地是人T-细 胞（例如，分离自人）。T-细胞可以处于任何发育阶段，包括、但不限于，CD4+/CD8+双阳性的 T-细胞、⑶4+辅助性T-细胞，例如，Th1和Th2细胞、⑶8+T-细胞（例如，细胞毒性的T-细 胞）、肿瘤浸润细胞、记忆T-细胞、原初T-细胞等。在一个实施方案中，T-细胞是CD8+T-细 胞或⑶4+T-细胞。T-细胞系可得自，例如，美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC,马纳萨斯，VA)和德国微生物和细胞培养物保藏中心（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ)，且包括，例如，Jurkat 细胞 (ATCC TIB-152)、Sup-Tl 细胞（ATCC CRL-1942)、RPMI 8402 细胞（DSMZ ACC-290)、Karpas 45细胞（DSMZ ACC-545)、及其衍生物。
[0064] 在另一个实施方案中，所述宿主细胞是自然杀伤（NK)细胞。NK细胞是在先天 性免疫系统中起作用的一类细胞毒性的淋巴细胞。NK细胞被定义为大颗粒淋巴细胞，且 构成从共同淋巴祖细胞（其也产生B和T淋巴细胞）分化成的第三类细胞（参见，例如， Immunobiology,第 5版，Janeway 等人，eds·，Garland Publishing, New York, NY (2001)) 〇 NK细胞在骨髓、淋巴结、脾、扁桃体和胸腺中分化并成熟。成熟以后，NK细胞作为具有特征 性的细胞毒性颗粒的大淋巴细胞进入循环中。NK细胞能够识别和杀死一些异常细胞，例如， 一些肿瘤细胞和病毒感染的细胞，并且被认为在对抗细胞内病原体的先天性免疫防御中是 重要的。如上面结合T-细胞所述，NK细胞可以是任意NK细胞，诸如培养的NK细胞，例如， 原代NK细胞，或得自培养的NK细胞系的NK细胞，或得自哺乳动物的NK细胞。如果得自哺 乳动物，NK细胞可以得自众多来源，包括、但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或 流体。NK细胞也可以被富集或纯化。NK细胞优选地是人NK细胞（例如，分离自人）。NK 细胞系可得自，例如，美国典型培养物保藏中心（ATCC，马纳萨斯，VA)，且包括，例如，NK-92 细胞（ATCC CRL-2407)、NK92MI 细胞（ATCC CRL-2408)、及其衍生物。
[0065] 通过"转染"、"转化"或"转导"，可以将编码CAR的本发明核酸序列引入细胞中。本 文中使用的"转染"、"转化"或"转导"表示，使用物理或化学方法，将一个或多个外源多核苷 酸引入宿主细胞中。许多转染技术是本领域已知的，且包括，例如，磷酸钙DNA共沉淀（参 见，例如，Murray E.J.(编），Methods in Molecular Biology,第7卷，Gene Transfer and Expression Protocols，Humana Press(1991)) ;DEAE_ 葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导 的转染；钨颗粒促进的微粒轰击（J〇hnston，Nature，346:776-777(1990));和磷酸锶DNA共 沉淀（Brash等人，Mol. Cell Biol. ,7:2031-2034(1987))。使传染性颗粒在合适的包装细 胞（其中的许多是商购可得的）中生长以后，可以将噬菌体或病毒载体引入宿主细胞中。 [0066] 不受特定理论或机制的约束，据信，通过引起针对BCMA的抗原特异性的应答，由 本发明核酸序列编码的CAR会提供下述一项或多项：靶向和破坏表达BCM的癌细胞，减少 或消除癌细胞，促进免疫细胞向肿瘤部位的渗透，和增强/延长抗癌应答。因而，本发明提 供了一种破坏多发性骨髓瘤细胞的方法，所述方法包括：使一个或多个前述分离的T-细胞 或自然杀伤细胞与表达BCM的多发性骨髓瘤细胞群体接触，由此产生CAR，其结合多发性 骨髓瘤细胞上的BCMA，并且破坏所述多发性骨髓瘤细胞。如本文所讨论的，多发性骨髓瘤 (也被称作浆细胞性骨髓瘤或卡勒氏病）是浆细胞的癌症，其为通常引起抗体产生的白血 细胞类型（Raab等人，Lancet, 374:324-329 (2009))。多发性骨髓瘤每年影响1-4/100,000 的人。该疾病在男性中更常见，并且由于仍然未知的原因，在非洲裔美国人中的发病率是在 高加索美国人中的2倍。多发性骨髓瘤是最少见的血液学恶性肿瘤（14%)，占所有癌症的 1% (Raab等人，出处同上）。多发性骨髓瘤的治疗通常涉及高剂量化学疗法和随后的造血 干细胞移植（同种异体的或自体的）；但是，高复发率在已经接受这样的治疗的多发性骨髓 瘤患者中是常见的。如以上所讨论的，多发性骨髓瘤细胞高度表达BCMA (参见，例如，Novak 等人，出处同上；Neri等人，出处同上；Bellucci等人，出处同上；和Moreaux等人，出 处同上）。
[0067] 可以使一个或多个分离的T-细胞（其表达编码本文描述的抗-BCMCAR的本 发明核酸序列）离体、在体内或在体外与表达BCM的多发性骨髓瘤细胞群体接触。"离 体"表示在生物体以外的人工环境中在细胞或组织内部或表面上进行的方法，所述人工 环境具有天然条件的最小改变。相反，术语"体内"表示在活生物体内部进行的方法，所 述活生物体处于它们的正常完整状态，而"体外"方法使用生物体的组分进行，所述组分 已经从它的通常生物学背景中分离。本发明的方法优选地涉及离体和体内组分。在这 点上，例如，可以将上述的分离的T-细胞在表达编码抗-BCMA CAR的本发明核酸序列的 条件下离体培养，然后直接转移进受多发性骨髓瘤影响的哺乳动物（优选人）中。这样 的细胞转移方法在本领域中被称作"过继性细胞转移（ACT) "，其中免疫衍生的细胞被动 地转移进新受体宿主中，以将供体免疫衍生的细胞的功能性转移给新宿主。用于治疗不 同类型的癌症（包括血液学癌症诸如骨髓瘤）的过继性细胞转移方法是本领域已知的， 且公开在，例如，Gattinoni 等人，Nat. Rev. Tmmunol. , 6 (5) : 383-393 (2006) ； June, CH, J. Clin. Invest.，117(6) :1466-76(2007) ;Rapoport 等人，Blood, 117(3) :788-797(2011);和 Barber 等人，Gene Therapy, 18:509-516(2011))中。
[0068] 本发明还提供了一种破坏霍奇金淋巴瘤细胞的方法。霍奇金淋巴瘤（以前被 称作霍奇金病）是一种免疫系统的癌症，其特征在于被称作Reed-Sternberg细胞的多 核细胞类型的存在。霍奇金淋巴瘤的2种主要类型包括经典的霍奇金淋巴瘤和结节 性淋巴细胞占优势的霍奇金淋巴瘤。目前用辐射疗法、化学疗法或造血干细胞移植来 治疗霍奇金淋巴瘤，治疗的选择取决于患者的年龄和性别，以及疾病的阶段、体积和组 织学亚型。已经在霍奇金淋巴瘤细胞的表面上检测到BCMA表达（参见，例如，Chiu等 人，Blood, 109 (2) : 729-739 (2007))。
[0069] 当将T-细胞或NK细胞施用给哺乳动物时，所述细胞对于所述哺乳动物而言可以 是同种异体的或自体的。在"自体"施用方法中，将细胞（例如，形成血液的干细胞或淋巴 细胞）从哺乳动物取出，储存（并任选地修饰），并返回该相同哺乳动物。在"同种异体"施 用方法中，哺乳动物从遗传上类似的、但是不同的供体接受细胞（例如，形成血液的干细胞 或淋巴细胞）。优选地，所述细胞对于所述哺乳动物而言是自体的。
[0070] 理想地将T-细胞或NK细胞以组合物（诸如药物组合物）的形式施用给人。可替 换地，可以将编码CAR的本发明核酸序列或包含编码CAR的核酸序列的载体配制在组合物 (诸如药物组合物）中，并施用给人。本发明的药物组合物可以包含表达本发明的CAR的 T-细胞或NK细胞的群体。除了本发明核酸序列或表达本发明的CAR的宿主细胞以外，所 述药物组合物可以包含其它药学活性剂或药物，诸如化学治疗剂，例如，天门冬酰胺酶、白 消安、卡钼、顺钼、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利 妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在优选的实施方案中，所述药物组合物包含表达本发明的 CAR的分离的T-细胞或NK细胞，更优选表达本发明的CAR的T-细胞或NK细胞的群体。
[0071] 本发明的T-细胞或NK细胞可以以盐（例如，药学上可接受的盐）的形式提供。 合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸（诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸 和硫酸）和有机酸（诸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、羟乙酸、葡糖 酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如，对甲苯磺酸）的那些盐。
[0072] 载体的选择将部分地取决于特定的本发明核酸序列、载体或表达CAR的宿主细 胞、以及用于施用本发明核酸序列、载体或表达CAR的宿主细胞的特定方法。因此，存在本 发明的药物组合物的多种合适制剂。例如，所述药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐 齐阿以包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。可以任选 地使用2种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物的约0. 0001重 量％至约2重量％的量存在。
[0073] 另外，在所述组合物中可以使用缓冲剂。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸、柠檬酸 钠、磷酸、磷酸钾、和多种其它酸和盐。可以任选地使用2种或更多种缓冲剂的混合物。所 述缓冲剂或其混合物通常以总组合物的约〇. 001重量％至约4重量％的量存在。
[0074] 用于制备可施用的（例如，可胃肠外施用的）组合物的方法是本领域技术 人员已知的，且更详细地描述在，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams&Wilkins ;第 21 版（2005 年 5 月 I 日）。
[0075] 可以将组合物（其包含编码CAR的本发明核酸序列或表达CAR的宿主细胞）配 制为包合络合物（诸如环糊精包合络合物）或脂质体。脂质体可以用于将宿主细胞（例 如，T-细胞或NK细胞）或本发明核酸序列靶向特定组织。脂质体也可以用于增加本发 明核酸序列的半衰期。许多方法可用于制备脂质体，诸如在例如下述文献中描述的那些： Szoka等人，Ann. Rev. Biophys. Bioeng.，9:467(1980)，和美国专利 4, 235, 871、4, 501，728、 4, 837, 028 和 5, 019, 369。
[0076] 所述组合物可以采用限时释放、延迟释放和持续释放递送系统，使得本发明的组 合物的递送提前发生，且具有足够的时间以造成要治疗的部位的致敏。许多类型的释放递 送系统是本领域普通技术人员可得到的和已知的。这样的系统可以避免所述组合物的重复 施用，由此增加受试者和医师的便利，且可以特别适合用于本发明的某些组合物实施方案。
[0077] 所述组合物理想地包含可有效地治疗或预防多发性骨髓瘤或霍奇金淋巴瘤的量 的表达编码CAR的本发明核酸序列的宿主细胞、或包含本发明核酸序列的载体。本文中使 用的术语"治疗"等表示，获得期望的药理学和/或生理学效应。优选地，所述效应是治疗 性的，即所述效应部分地或完全地治愈疾病和/或可归因于疾病的不利症状。为此目的，本 发明的方法包括施用"治疗有效量"的组合物，所述组合物包含表达编码CAR的本发明核酸 序列的宿主细胞、或包含本发明核酸序列的载体。"治疗有效量"表示在必要的剂量和时间 段内有效地达到期望治疗结果的量。治疗有效量可以根据诸如以下因素而变化：个体的疾 病状态、年龄、性别和重量，以及CAR在个体中引起期望应答的能力。例如，本发明的CAR的 治疗有效量是结合多发性骨髓瘤细胞上的BCM并破坏它们的量。
[0078] 可替换地，所述药理学和/或生理学效应可以是预防性的，即该效应完全地或部 分地预防疾病或其症状。在这方面，本发明的方法包括：给易患多发性骨髓瘤或霍奇金淋巴 瘤的哺乳动物施用"预防有效量"的组合物，所述组合物包含表达编码CAR的本发明核酸序 列的宿主细胞、或包含本发明核酸序列的载体。"预防有效量"表示在必要的剂量和时间段 内有效地达到期望预防结果（例如，预防疾病发作）的量。
[0079] 施用给哺乳动物（例如，人）的宿主细胞的典型量可以是，例如，在100万至1000 亿个细胞的范围内；但是，低于或高于该示例性范围的量是在本发明范围内。例如，本发明 的宿主细胞的每日剂量可以是约100万至约500亿个细胞（例如，约500万个细胞、约2500 万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细 胞、约400亿个细胞、或由前述值中的任意两个限定的范围），优选约1000万至约1000亿个 细胞（例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约 7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约 500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞、或由前述值中的任意两个限定的范围）， 更优选约1亿个细胞至约500亿个细胞（例如，约1. 2亿个细胞、约2. 5亿个细胞、约3. 5亿 个细胞、约4. 5亿个细胞、约6. 5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、 约300亿个细胞、约450亿个细胞、或由前述值中的任意两个限定的范围）。
[0080] 通过定期评估接受治疗的患者，可以监测治疗或预防效力。对于持续若干天或更 久的重复给药而言，根据情况，重复所述治疗直至疾病症状得到期望的抑制。但是，其它剂 量方案可能是有用的，且在本发明的范围内。通过所述组合物的单次推注施用，通过所述组 合物的多次推注施用，或通过所述组合物的连续输注施用，可以递送期望的剂量。
[0081] 使用标准施用技术，可以给哺乳动物施用所述组合物，所述组合物包含表达本发 明的编码CAR的核酸序列的宿主细胞、或包含本发明的编码CAR的核酸序列的载体，所述标 准施用技术包括口服的、静脉内的、腹膜内的、皮下的、肺的、透皮的、肌肉内的、鼻内的、含 服的、舌下的、或栓剂施用。所述组合物优选地适合于胃肠外施用。本文中使用的术语"胃 肠外"包括静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。更优选地，通过静脉内、腹膜内 或皮下注射，利用外周全身递送将所述组合物施用给哺乳动物。
[0082] 可以将所述组合物（其包含表达本发明的编码CAR的核酸序列的宿主细胞、或包 含本发明的编码CAR的核酸序列的载体）与一种或多种其它治疗剂一起施用，所述其它治 疗剂可以共同施用给哺乳动物。"共同施用"是指，在时间上足够接近地施用一种或多种其 它治疗剂以及包含本发明的宿主细胞或本发明的载体的组合物，使得本发明的CAR可以增 强一种或多种其它治疗剂的作用，或反之亦然。在这点上，可以首先施用包含本发明的宿主 细胞或本发明的载体的组合物，然后可以施用一种或多种其它治疗剂，或反之亦然。可替换 地，可以同时施用包含本发明的宿主细胞或本发明的载体的组合物以及一种或多种其它治 疗剂。可以与包含本发明的宿主细胞或本发明的载体的组合物共同施用的治疗剂的一个例 子是IL-2。
[0083] 将所述组合物（其包含表达本发明的编码CAR的核酸序列的宿主细胞、或包含本 发明的编码CAR的核酸序列的载体）施用给哺乳动物（例如，人）以后，通过本领域已知的 任意合适方法，可以测量CAR的生物学活性。根据本发明的方法，所述CAR结合多发性骨髓 瘤细胞上的BCMA，并破坏所述多发性骨髓瘤细胞。使用本领域已知的任意合适方法，包括例 如ELISA和流式细胞计量术，可以测定所述CAR与多发性骨髓瘤细胞的表面上的BCMA的结 合。使用本领域已知的任意合适方法，诸如在例如以下文献中描述的细胞毒性测定，可以测 量CAR的破坏多发性骨髓瘤细胞的能力：Kochenderfer等人，J. Immunotherapy, 32(7) : 689 -702 (2009)，和 Herman 等人· J. Immunological Methods, 285 (1) : 25-40 (2004)。通过测定 某些细胞因子（诸如⑶107a、IFN γ、IL-2和TNF)的表达，也可以测量CAR的生物学活性。 [0084] 本领域普通技术人员会容易地认识到，可以以任意数目的方式修饰本发明的编码 CAR的核酸序列，从而通过所述修饰增加 CAR的治疗或预防效力。例如，可以将CAR直接地或 通过接头间接地缀合至靶向部分。将化合物（例如，CAR)与靶向部分缀合的实践是本领域 已知的。参见，例如，Wadwa 等人，J. Drug Targeting 3:111(1995)和美国专利 5, 087, 616。
[0085] 下述实施例进一步举例说明本发明，但是，当然不应该解释为以任何方式限制本 发明的范围。
[0086] 实施例1
[0087] 本实施例证实了 BCMA在人细胞中的表达模式。
[0088] 使用BCMA-特异性的引物和探针集合（Life Technologies, Carlsbad, CA)，对 一组cDNA样品进行定量聚合酶链式反应（qPCR)，所述cDNA样品得自人主要组织qPCR Panel II (Origine Technologies, Rockville, MD)中所含的宽范围的正常组织。分析得 自浆细胞瘤的细胞的cDNA作为阳性对照，所述浆细胞瘤从患有晚期多发性骨髓瘤的患者 切除。用RNeasy微型试剂盒（Qiagen, Inc. ,Valencia, CA)从楽细胞瘤细胞提取RNA，并 使用标准方法合成cDNA。通过在载体DNA中稀释编码全长BCMA cDNA的质粒（Origine Technologies, Rockville, MD)，建立BCMA qPCR的标准曲线。所述qPCR准确地检测每 个反应IO2-IO9个BCM拷贝的拷贝数。用TaqmanP-肌动蛋白引物和探针试剂盒（Life Technologies, Carlsbad, CA)，定量相同组织中的β -肌动蛋白cDNA拷贝的数目。通过扩增 β-肌动蛋白质粒的系列稀释物，建立β-肌动蛋白标准曲线。在Roche LightCycler480 机器（Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN)上进行所有 qPCR 反应。
[0089] qPCR分析的结果显示在图IA和IB中。如通过流式细胞计量术确定的，93%的得 自浆细胞瘤样品的细胞为浆细胞。浆细胞瘤样品中的BCM表达显著高于任意其它组织中 的BCMA表达。在几种血液学组织（诸如外周血单核细胞（PBMC)、骨髓、脾、淋巴结和扁桃 体）中检测到BCM cDNA。在大多数胃肠器官（诸如十二指肠、直肠和胃）中检测到低水平 的BCMA cDNA。胃肠器官中的BCMA表达可能是存在于肠相关的淋巴样组织（诸如固有层和 派伊尔斑）中的楽细胞和B-细胞的结果（参见，例如，Brandtzaeg, Immunological Invest igations，39(4-5) :303-355(2010))。也在睾丸和气管中检测到低水平的BCMA cDNA。在气 管中检测到的低水平的BCM cDNA可能是由于浆细胞在气管固有层中的存在（参见，例如， Soutar，Thorax, 31(2):158-166(1976))。
[0090] 使用流式细胞计量术（参见图2A-2L)进一步表征了 BCM在不同细胞类型的表面 上的表达，所述细胞类型包括多发性骨髓瘤细胞系H929、U266和RPMI8226。多发性骨髓瘤 细胞系H929、U266和RPMI8226都表达细胞表面BCMA。相反，肉瘤细胞系TC71、T-细胞白 血病系CCRF-CEM和肾细胞系293T-17不表达细胞表面BCMA。原代⑶34+造血细胞、原代小 气道上皮细胞、原代支气管上皮细胞和原代肠上皮细胞都缺乏细胞表面BCMA表达。
[0091] 本实施例的结果证实，BCMA在多发性骨髓瘤细胞的表面上表达，并且它在正常组 织中具有受限的表达模式。
[0092] 实施例2
[0093] 本实施例描述了编码抗-BCM嵌合抗原受体（CAR)的本发明核酸序列的构建。
[0094] 从国际专利申请公开WO 2010/104949 (Kalled等人）得到被命名为"C12A3. 2"和 "C11D5. 3"的2种小鼠-抗-人-BCM抗体的抗体序列。使用这些抗体的重链可变区和轻 链可变区的氨基酸序列，设计具有下述通式结构的单链可变片段（scFv):
[0095] 轻链可变区-接头-重链可变区。
[0096] 所述接头具有下述氨基酸序列：GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID N0:7)(参见，例如， Cooper 等人，Blood, 101 (4) : 1637-1644 (2003))。
[0097] 设计了编码2种嵌合抗原受体的DNA序列，其中的每一种从5'至3'含有下述元 件：⑶8 α信号序列、前述抗-BCM scFv、人⑶8 α分子的铰链和跨膜区域、⑶28分子的细 胞质部分和CD3 ζ分子的细胞质部分。这些编码CAR的核酸序列的示意图描绘在图3Α中。 并入得自C12A3. 2和C11D5. 3的可变区的CAR分别被命名为抗-bcmal和抗-bcma2。
[0098] 设计了编码5种其它嵌合抗原受体（基于上述的抗_bcma2CAR)的DNA序列，其中 的每一种含有不同的信号序列和T-细胞活化结构域。在这方面，8ss-抗-bcma2CAR从5' 至3'含有下述元件：⑶8 α信号序列、scFv、人⑶8 α分子的铰链和跨膜区域、⑶28分子 的细胞质部分和⑶3 ζ分子的细胞质部分。G-抗-bcma2CAR从5'至3'含有下述元件：人 GM-CSF受体信号序列、scFv、人⑶8 α分子的铰链和跨膜区域、⑶28分子的细胞质部分和 ⑶3 ζ分子的细胞质部分。抗-bcma2-BB CAR从5'至3'含有下述元件：⑶8 α信号序列、 scFv、人⑶8 α分子的铰链和跨膜区域、4-1ΒΒ分子的细胞质部分和C'D3^分子的细胞质部 分。抗-bcma2-0X40CAR从5'至3'含有下述元件：CD8 α信号序列、scFv、人CD8 α分子的 铰链和跨膜区域、0X40分子的细胞质部分（参见，例如，Latza等人，European Journal of Immunology, 24:677-683(1994))和 0)3ζ 分子的细胞质部分。抗-bcma2-BB0X40 从 5' 至 3'含有下述元件：⑶8 α信号序列、scFv、人⑶8 α分子的铰链和跨膜区域、4-1BB分子的细 胞质部分、0X40分子的细胞质区域和CD3(分子的细胞质部分。在表1描绘了存在于7种 CAR序列中的每一种内的元件。
[0099] 表 1
[0100]

【权利要求】
1. 分离的或纯化的编码嵌合抗原受体（CAR)的核酸序列，其中所述CAR包含抗原识别 部分和T-细胞活化部分，且其中所述抗原识别部分针对B-细胞成熟抗原（BCMA)。
2. 根据权利要求1所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述抗原识别部分包含针对 BCMA的单克隆抗体或其抗原结合部分。
3. 根据权利要求2所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述抗原识别部分包含针对 BCMA的单克隆抗体的可变区。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述T-细胞活 化部分包含下述蛋白中的任一种的T-细胞信号传导结构域：人CD8-a蛋白、人CD28蛋白、 人⑶3-(蛋白、人FcRy蛋白、⑶27蛋白、0X40蛋白、人4-1BB蛋白、前述任一种的修饰形 式或前述的任意组合。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的分离的或纯化的核酸序列，其包含SEQIDN0:1、 SEQIDN0:2 或SEQIDN0:3 的核酸序列。
6. 分离的或纯化的CAR，其由权利要求1-5中任一项所述的核酸序列编码。
7. 根据权利要求6所述的分离的或纯化的CAR，其包含SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQ IDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO: 10、SEQIDNO: 11 或SEQIDNO: 12 的氨 基酸序列。
8. 载体，其包含权利要求1-5中任一项所述的分离的或纯化的核酸序列。
9. 分离的宿主细胞，其表达权利要求1-5中任一项所述的核酸序列。
10. 根据权利要求9所述的分离的宿主细胞，其表达包含SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、 SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO: 10、SEQIDNO: 11 或SEQIDNO: 12 的氨基酸序列的CAR。
11. 根据权利要求9或权利要求10所述的分离的宿主细胞，其为T-细胞。
12. 根据权利要求9或权利要求10所述的分离的宿主细胞，其为自然杀伤（NK)细胞。
13. 破坏多发性骨髓瘤细胞的方法，所述方法包括：使表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞 与权利要求1-5中任一项所述的分离的或纯化的核酸序列接触，由此产生CAR，且所述CAR 结合所述多发性骨髓瘤细胞上的BCMA，并破坏所述多发性骨髓瘤细胞。
14. 破坏多发性骨髓瘤细胞的方法，所述方法包括：使表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞 与权利要求8所述的载体接触，由此产生CAR，且所述CAR结合所述多发性骨髓瘤细胞上的 BCMA，并破坏所述多发性骨髓瘤细胞。
15. 破坏多发性骨髓瘤细胞的方法，所述方法包括：使表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞 与一个或多个权利要求11所述的分离的T-细胞接触，由此产生CAR，且所述CAR结合所述 多发性骨髓瘤细胞上的BCMA，并破坏所述多发性骨髓瘤细胞。
16. 破坏多发性骨髓瘤细胞的方法，所述方法包括：使表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞 与一个或多个权利要求12所述的分离的NK细胞接触，由此产生CAR，且所述CAR结合所述 多发性骨髓瘤细胞上的BCMA，并破坏所述多发性骨髓瘤细胞。
17. 根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中所述多发性骨髓瘤细胞在人体中。
18. 根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中所述多发性骨髓瘤细胞在体外。
【文档编号】C12N15/62GK104379179SQ201380027676
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年3月15日 优先权日:2012年4月11日
【发明者】詹姆斯·诺布尔·科亨德费尔 申请人:美国卫生和人力服务部