选择性核酸片段回收的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于核酸纯化以及片段选择与回收的方法和试剂盒。通过调节结合缓冲液的盐浓度和/或pH，只有具有所需尺寸范围的核酸片段能够在某些盐浓度和/或pH条件下可逆地并且非特异性地结合到固体表面，并且可以随后在水和/或低盐洗脱缓冲液中从所述固体表面洗脱和/或回收。
【专利说明】选择性核酸片段回收
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年6月1日提交的美国临时申请序列号61/689,221的优先权， 这个临时申请以其全文引用的方式并入本文中。
【技术领域】
[0003] 本发明涉及用于核酸纯化以及片段尺寸选择与回收的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 许多分子生物学应用，如毛细管电泳、核苷酸测序，需要分离高质量的核酸制剂。 质量是用于所有测序方法以及用于基因治疗方案的毛细管电泳的特别重要的因素。数量也 是用于一些应用的同等重要的考虑因素，例如，大规模基因组作图和测序计划，其需要产生 成千上万个高质量的DNA模板。
[0006] 如下一代测序（Next Generation Sequencing ;NGS)的新型技术的出现需要在 DNA片段的某些群组的精确尺寸控制下的高质量的DNA样品制备。在DNA片段化或剪切之 后，用于下一代测序的文库构建过程主要需要与平台无关的片段选择。片段选择后获得高 回收率正成为用于减小测序偏差的重要的贡献因素。举例来说，为了制备用于Illumina NGS平台的DNA文库，在150-500bp范围内的DNA片段的回收对于较好的测序结果来说是关 键的。其它NGS平台需要范围介于300-700bp之间的DNA片段。
[0007] 存在两种常用方法来进行尺寸选择以用于NGS文库制备。一种方法是将片段化的 DNA运行到琼脂糖凝胶中，然后切割具有所选的DNA尺寸的凝胶，然后从凝胶回收DNA片段。 这种方法是精密的，但非常缓慢并且是劳动密集型的。
[0008] 用来准备片段化的DNA的尺寸选择的另一种通常使用的方法是通过调节聚乙二 醇（PEG)和盐的浓度使DNA结合于涂布有官能团（如羧基）的磁性小珠上。参看美国专利 号6, 534, 262。这种方法有效地使DNA片段化并且可以在自动化平台中容易地适应以一次 性处理大量样品。然而，当DNA片段大于400bp时，这种方法不会很好地工作以使DNA片段 化。不需要的大DNA片段降低了后续NGS结果的数据质量并且浪费了仪器的能力。对于需 要大DNA片段的NGS平台，例如用于Roche 454 Genome Sequencer的NGS平台，这种方法 并不适合。
[0009] 美国专利号5, 234, 809描述了一种使用固相粒子以在离液盐存在下特异性地和/ 或非特异性地结合来自样品的核酸的方法，这些离液盐如胍盐、碘化钠和碘化钾。然而，这 种方法并未提供对核酸片段的任何尺寸控制。
[0010] 因此，下一代测序（NGS)的不断增长的应用需要新的核酸纯化与片段尺寸选择方 法，这些方法提供了高的核酸回收率和精确的片段尺寸控制。 发明概要
[0011] 本发明提供了用于核酸纯化与片段尺寸选择的方法和试剂盒。在某些实施方案 中，本发明提供了一种选择性地回收核酸片段的方法，其包括：a)将目标核酸与具有选定 pH和盐浓度的结合缓冲液混合以允许具有所需尺寸范围的核酸片段结合到固体表面；b) 将来自步骤a)的混合物施加到固体表面以使得只有具有所需尺寸范围的核酸片段可逆地 并且非特异性地结合到固体表面；以及c)通过用洗脱缓冲液从固体表面洗脱结合的核酸 片段来选择性地回收具有所需尺寸范围的结合的核酸片段。
[0012] 在某些实施方案中，本发明方法中所用的结合缓冲液包含离液盐。离液盐的实例 包括（但不限于）盐酸胍（GHCl)、硫氰酸胍（GITC)、碘化钠（NaI)和高氯酸钠，以及其混合 物。在某些实施方案中，结合缓冲液的离液盐的浓度经过调节以使得只有具有所需尺寸范 围的某些核酸片段能够可逆地并且非特异性地结合到固体表面，并且随后用洗脱缓冲液从 固体表面洗脱。在某些实施方案中，盐酸胍（GHCl)或硫氰酸胍（GITC)的浓度介于0. 8-5. OM 之间；碘化钠（NaI)的浓度介于0. 8-7. OM之间；并且高氯酸钠的浓度介于I. 0-7. OM之间。 在某些实施方案中，结合缓冲液中的离液盐浓度是通过用水稀释结合缓冲液来调节。
[0013] 本发明提供了，通过调节结合缓冲液中的离液盐浓度，只有具有所需尺寸范围的 某些核酸片段能够结合到固体表面，不需要的核酸片段与结合缓冲液一起保留在样品混合 物中，并且在离心后被弃去。在某些实施方案中，固体表面包括（但不限于）二氧化硅膜滤 柱或二氧化硅涂布的磁性微粒（小珠）。在某些实施方案中，核酸片段包括（但不限于）DNA 片段、RNA片段或PNA片段。
[0014] 在某些实施方案中，本发明提供了一种从二氧化硅膜滤柱选择性地回收具有小于 或等于100bp、小于或等于200bp或小于或等于300bp的所需尺寸范围的DNA片段的方法。 本发明方法包括将目标DNA样品（例如，100 μ 1)与包含4M硫氰酸胍（GITC，pH 7.0)的结 合缓冲液（例如，100 μ 1)混合，其中在将每种混合物独立地施加到二氧化硅膜柱中之前， 用200 μ 1、300 μ 1或400 μ 1水进一步稀释每种DNA样品混合物（总共200 μ 1)。只有小于 或等于IOObp的DNA片段当用200 μ 1水稀释时在约I. OM的GITC的最终浓度下、小于或等 于200bp的DNA片段当用300 μ 1水稀释时在约0. 8Μ的GITC的最终浓度下、以及小于或等 于300bp的DNA片段当用400 μ 1水稀释时在约0. 7Μ的GITC的最终浓度下，能够结合到二 氧化硅膜柱，并且随后从二氧化硅膜柱洗脱并在水和/或含有低盐的洗脱缓冲液中回收。 每种混合物的PH为约7. 0并且由于与DNA样品混合的结合缓冲液而可能稍有变化。
[0015] 在其它实施方案中，本发明提供了一种从二氧化硅涂布的微粒选择性地回收具有 小于或等于200bp、小于或等于300bp或小于或等于400bp的所需尺寸范围的DNA片段的方 法。本发明方法包括将目标DNA样品与包含4M硫氰酸胍（GITC)的结合缓冲液混合，其中 在将每种混合物进一步与二氧化硅涂布的微粒组合之前，用200 μ 1、300 μ 1或400 μ 1水进 一步稀释每种DNA样品混合物。只有小于或等于200bp的DNA片段当用200 μ 1水稀释时 在约I. OM的GITC的最终浓度下、小于或等于300bp的DNA片段当用300 μ 1水稀释时在约 0. 8Μ的GITC的最终浓度下、以及小于或等于400bp的DNA片段当用400 μ 1水稀释时在约 0. 7Μ的GITC的最终浓度下，能够结合到二氧化硅涂布的微粒，并且随后从微粒洗脱并在水 和/或含有低盐的洗脱缓冲液中回收。类似地，每种混合物的PH为约7. 0并且由于与DNA 样品混合的结合缓冲液而可能稍有变化。
[0016] 本发明进一步提供了一种通过调节过程中所用的结合缓冲液的盐浓度或pH或两 者来选择性地回收具有所需尺寸范围的核酸片段的方法。在某些实施方案中，本发明提供 了一种选择性地回收具有所需尺寸范围的核酸片段，例如150bp-700bp DNA片段的方法。本 发明方法包括以下步骤：a)通过将目标核酸与第一结合缓冲液混合来提供第一样品混合 物，其中所述第一结合缓冲液的盐浓度或PH经过调节以只允许较大的核酸片段，例如大于 700bp的DNA片段结合到固体表面；b)将来自步骤a)的所述第一样品混合物施加到第一固 体表面；c)收集从第一固体表面与第一样品混合物离心而得的流通溶液；d)通过将流通溶 液与第二结合缓冲液混合来提供第二样品混合物，其中所述第二结合缓冲液的盐浓度或pH 经过调节以只允许具有较小的所需尺寸范围的核酸片段，例如150bp-700bp DNA片段结合 到固体表面；e)将来自步骤d)的第二样品混合物施加到第二固体表面；以及e)通过从所 述第二固体表面洗脱结合的核酸片段并在水和/或包含低盐的洗脱缓冲液中将其回收来 选择性地洗脱并回收具有较小的所需尺寸范围的核酸片段，例如150bp-700bp DNA片段。
[0017] 本发明提供了，DNA结合能力随着结合缓冲液中的离液盐浓度与pH的组合而变 化。在某些实施方案中，当结合缓冲液含有最终浓度为约I. OM的GITC时，在约5. 33的pH 下，具有500bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约4. 92的pH下，具有 400bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约3. 44的pH下，具有300bp或更 高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约2. 57的pH下，具有250bp或更高的大多数 DNA片段能够结合到固体表面（参看下表的说明）。
[0018] 在其它实施方案中，当结合缓冲液含有最终浓度为约2. 5M的GITC时，在约5. 67 的pH下，具有IOObp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约5. 75的pH下，具 有IlObp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约5. 83的pH下，具有120bp或 更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约5. 90的pH下，具有130bp或更高的大多 数DNA片段能够结合到固体表面；在约5. 96的pH下，具有HObp或更高的大多数DNA片段 能够结合到固体表面；并且在约6. 02的pH下，具有150bp或更高的大多数DNA片段能够结 合到固体表面（参看下表的说明）。
[0019]
【权利要求】
1. 一种选择性地回收具有所需尺寸范围的核酸片段的方法，其包括： a) 将目标核酸与具有选定pH和盐浓度的结合缓冲液混合以允许具有所述所需尺寸范 围的所述核酸片段结合到固体表面； b) 将来自步骤a)的混合物施加到所述固体表面以使得具有所述所需尺寸范围的所述 核酸片段可逆地并且非特异性地结合到所述固体表面；以及 c) 通过用洗脱缓冲液从所述固体表面洗脱所述结合的核酸片段来选择性地回收具有 所述所需尺寸范围的所述核酸片段。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述结合缓冲液包含选自由以下组成的群组的离液 盐：浓度介于〇. 8-5. 0M之间的盐酸胍（GHC1)、浓度介于0. 8-5. 0M之间的硫氰酸胍（GITC)、 浓度介于〇. 8-7. 0M之间的碘化钠（Nal)、浓度介于1. 0-7. 0M之间的高氯酸钠，以及其混合 物。
3. 如权利要求2所述的方法，其中所述结合缓冲液的所述离液盐浓度是用一定量的水 来调节，这允许具有所述所需尺寸范围的所述核酸片段结合到所述固体表面并且随后从所 述固体表面洗脱。
4. 如权利要求3所述的方法，其中所述固体表面是二氧化硅膜滤柱或二氧化硅涂布的 磁性微粒。
5. 如权利要求4所述的方法，其中所述核酸片段是DNA片段、RNA片段或PNA片段。
6. 如权利要求5所述的方法，其中当所述结合缓冲液中GITC的最终浓度为约1. 0M时， 具有小于或等于l〇〇bp的所需尺寸范围的DNA片段结合到二氧化硅膜滤柱并且随后从二氧 化硅膜滤柱洗脱。
7. 如权利要求5所述的方法，其中当所述结合缓冲液中GITC的最终浓度为约0. 8M时， 具有小于或等于200bp的所需尺寸范围的DNA片段结合到二氧化硅膜滤柱并且随后从二氧 化硅膜滤柱洗脱。
8. 如权利要求5所述的方法，其中当GITC的最终浓度为约0. 7M时，具有小于或等于 300bp的所需尺寸范围的DNA片段结合到二氧化硅膜滤柱并且随后从二氧化硅膜滤柱洗 脱。
9. 一种选择性地回收具有所需尺寸范围的核酸片段的方法，其包括： a) 通过将目标核酸与第一结合缓冲液混合来提供第一样品混合物，其中所述第一结合 缓冲液的盐浓度或pH经过调节以允许较大的核酸片段结合到固体表面； b) 将来自步骤a)的所述第一样品混合物施加到第一固体表面； c) 收集从所述第一固体表面与所述第一样品混合物离心而得的流通溶液； d) 通过将所述流通溶液与第二结合缓冲液混合来提供第二样品混合物，其中所述第二 结合缓冲液的盐浓度或pH经过调节以允许具有较小的所需尺寸范围的核酸片段结合到固 体表面； e) 将来自步骤d)的所述第二样品混合物施加到第二固体表面；以及 f) 通过用洗脱缓冲液从所述第二固体表面独立地洗脱所述结合的核酸片段来选择性 地回收具有所述较小的所需尺寸范围的所述核酸片段。
10. 如权利要求9所述的方法，其中所述第一或第二结合缓冲液包含选自由以下组成 的群组的离液盐：浓度介于0. 8-5. 0M之间的盐酸胍（GHC1)、浓度介于0. 8-5. 0M之间的硫 氰酸胍（GITC)、浓度介于0. 8-7. 0M之间的碘化钠（Nal)，以及浓度介于1. 0-7. 0M之间的高 氯酸钠。
11. 如权利要求9所述的方法，其中所述第一结合缓冲液包含酸或其酸性盐，以降低所 述结合缓冲液的pH以便促进较大的核酸片段结合到所述固体表面。
12. 如权利要求9所述的方法，其中所述第二结合缓冲液包含碱或其碱性盐，以提高所 述结合缓冲液的pH以便去除较小的核酸片段。
13. 如权利要求9所述的方法，其中具有较小的所需尺寸范围的所述核酸片段介于 150bp 与 700bp 之间。
14. 如权利要求9所述的方法，其中所述结合缓冲液的pH范围介于5. 5与7. 5之间。
15. -种用于核酸片段选择与回收的试剂盒，其包含： a) 用于核酸片段选择性地结合到固相的一种或多种结合缓冲液； b) 涂布有官能团的一种或多种固相； c) 用于核酸纯化与回收的其它试剂；以及 d) 提供用于核酸片段选择与回收的方案的说明书。
16. 如权利要求15所述的试剂盒，其中所述固相是二氧化硅膜滤柱或二氧化硅涂布的 磁性微粒。
17. 如权利要求15所述的试剂盒，其中所述用于核酸纯化与回收的试剂包含洗涤缓冲 液、洗脱缓冲液或水。
【文档编号】C12N15/10GK104350152SQ201380030305
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年6月3日 优先权日:2012年6月1日
【发明者】奇·郭 申请人:欧米伽生物技术公司