有助于选择被特定免疫球蛋白基因重组牛痘病毒感染的细胞的融合蛋白的制作方法

有助于选择被特定免疫球蛋白基因重组牛痘病毒感染的细胞的融合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及在真核细胞中表达免疫球蛋白分子的高效方法。本发明进一步涉及生产用于在真核细胞中表达的免疫球蛋白重链和轻链文库的方法，特别是使用三分子重组方法。本发明进一步提供了选择和筛选抗原特异性免疫球蛋白分子及其抗原特异性片段的方法。本发明还提供了用于生产、筛选和选择抗原特异性免疫球蛋白分子的试剂盒。最后，本发明提供了通过本文中提供的方法产生的免疫球蛋白分子及其抗原特异性片段。
【专利说明】有助于选择被特定免疫球蛋白基因重组牛痘病毒感染的细 胞的融合蛋白
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2012年4月26日提交的美国临时申请No. 61/639, 046, 2012年12 月3日提交的美国临时申请N〇.61/732,776和2013年3月15日提交的美国非临时申请 No. 13/844, 388的优先权权益，在此各申请的全部内容按引用并入。
[0003] 对电子提交的序列表的引用
[0004]随本文提交的 ASCII 文本文件（名称："1843_071PC02_SequenceListing_ascii? tXt" ； 大小 ：30, 863 字节； 以及生成日期 ：2013 年 4 月 25 日） 中电子提交的序列表的内容 全部按引用并入本文。
[0005]发明背景 发明领域
[0006] 本发明涉及在牛痘病毒颗粒（例如，EEV病毒粒）和/或宿主细胞上表达免疫球 蛋白分子的高效方法、生产用于在牛痘病毒颗粒（例如，EEV病毒粒）和/或真核细胞中表 达的免疫球蛋白重链和轻链文库的方法、分离结合特定抗原的免疫球蛋白的方法和通过这 些方法中的任一种产生的免疫球蛋白。本发明还涉及用于在牛痘病毒颗粒（例如，EEV病 毒粒）或宿主细胞上表达免疫球蛋白分子的融合蛋白。
[0007] 相关领域
[0008] 免疫球蛋白产生
[0009] 具有限定的特异性的抗体正用于数量日益增加的多种多样治疗应用中。多种方法 已经用于获得对于人的治疗用途有用的抗体。这些包括嵌合抗体和人源化抗体，以及选自 文库（例如，噬菌体展示文库）或来自转基因动物的完全人抗体。可以从天然或特意免疫 的个体的抗体生产细胞得到在噬菌体中构建的免疫球蛋白文库，并且原则上可以包括新的 和多样的人免疫球蛋白重链和轻链配对。尽管这种策略没有受到内在抗体谱（repertoire) 的限制，但它需要在细菌细胞中合成所表达的免疫球蛋白片段的互补决定区（CDR)并正确 折叠。然而，许多抗原结合区域难以在细菌细胞中正确装配成融合蛋白。此外，蛋白质将不 会经历正常的真核生物的翻译后修饰。因此，这种方法对可以获得的抗体特异性强加了不 同的选择性过滤。或者，可以在真核系统中从文库（例如，酵母展示、逆转录病毒展示或DNA 病毒（如，痘病毒）中的表达）分离完全人抗体。参见，例如，美国专利No. 7, 858, 559,将其 全部按引用并入本文中。
[0010] 本发明使得能够在牛痘病毒（一种包膜哺乳动物病毒）的表面上有效表达完全人 抗体的文库。与噬菌体展示相似，利用其中每种牛痘病毒粒在其表面表达单一免疫球蛋白 (例如，抗体或SCFV)的条件。
[0011] 然而，在本发明中，已经研发了各种淘选和基于磁珠的方法来筛选牛痘-MAb病毒 粒的文库，以选择编码特定抗体的重组病毒。在哺乳动物细胞感染时，抗体不仅结合至新产 生的病毒中，其还在宿主细胞表面上展示。这实现了有效的选择策略：其结合了在无细胞淘 选系统中选择牛痘-MAb病毒粒接着对高特异性的基于细胞的筛选和抗体优化的益处。
[0012] 这不同于该领域中表达单一 scFV但不表达文库的其他技术。此外，设计了其他技 术来重新指引通过scFv的牛痘感染以用于基因治疗并且没有用于抗体发现。另外，本发明 的技术通过使用EEV而不是IMV及通过使用不同的融合蛋白（例如，A56R)而不同于之前 的技术。
[0013] 发明概述
[0014] 在特定的方面中，本公开内容涉及融合蛋白，其包含（a)包含重链CH1结构域的第 一多肽区段和（b)包含牛痘胞外包膜病毒（EEV)特异性膜蛋白的跨膜结构域的第二多肽区 段。
[0015] 在一些实施方案中，融合蛋白进一步包含第三多肽区段，其包含免疫球蛋白重链 可变区或其片段。在另一个实施方案中，牛痘EEV-特异性膜蛋白是A56R。
[0016] 在特定的方面中，本公开内容涉及编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含 (a)包含人重链CH1结构域的第一多肽区段和（b)包含牛痘胞外包膜病毒（EEV)特异性膜 蛋白的跨膜结构域的第二多肽区段。在特定的实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID N0:10的 核苷酸，其编码来自Western Reserve牛痘病毒株的A56R的氨基酸108至314。在特定的 实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID N0:11的氨基酸215至421。在特定的实施方案中，多核 苷酸包含SEQ ID N0:10的核苷酸，其编码SEQ ID N0:11的氨基酸215至421。
[0017] 在特定的方面中，本公开内容涉及包含编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白 包含（a)包含人重链CH1结构域的第一多肽区段和（b)包含牛痘胞外包膜病毒（EEV)特异 性膜蛋白的跨膜结构域的第二多肽区段。
[0018] 在特定的方面中，本公开内容涉及包含编码融合蛋白的多核苷酸的重组牛痘病 毒，所述融合蛋白包含（a)包含人重链CH1结构域的第一多肽区段和（b)包含牛痘胞外包 膜病毒（EEV)特异性膜蛋白的跨膜结构域的第二多肽区段。在另一个方面中，本公开内容 涉及重组牛痘病毒感染的宿主细胞。
[0019] 在另一个方面中，本公开内容涉及重组牛痘文库，其包含在编码多个免疫球蛋白 融合多肽的牛痘病毒载体中构建的第一多核苷酸文库，其中牛痘病毒载体包含（a)编码包 含重链CH1结构域的第一多肽区段的第一多核苷酸，（b)编码包含位于CH1结构域下游的牛 痘病毒EEV特异性膜蛋白的跨膜结构域的第二多肽区段的第二多核苷酸，和（c)编码位于 CH1结构域上游的免疫球蛋白重链可变区或其片段的第三多核苷酸。在一个实施方案中， 第一文库进一步包含用于促进EEV表面上的融合多肽表达的信号肽。在另一个实施方案 中，EEV特异性膜蛋白是A56R。在另一个实施方案中，牛痘EEV特异性膜蛋白是A56R。在另 一个实施方案中，第二多肽区段进一步包含EEV特异性膜蛋白的胞外结构域或其一部分。 在另一个实施方案中，第二多肽区段进一步包含EEV特异性膜蛋白的胞内结构域或其一部 分。在特定的实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID N0:11的氨基酸，其对应于来自Western Reserve牛痘病毒株的A56R的多肽序列氨基酸108至314。在特定的实施方案中，融合蛋 白包含SEQ ID N0:11的氨基酸215至421。在特定的实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 11的氨基酸215至421，其是来自Western Reserve牛痘病毒株的A56R的多肽序列氨 基酸108至314。
[0020] 在另一个方面中，本公开内容涉及用于选择编码抗原特异性免疫球蛋白重链可变 区或其抗原结合片段的多核苷酸的方法，包括：(a)将权利要求13至18任一项的编码免 疫球蛋白融合蛋白的第一文库引入允许牛痘病毒感染的宿主细胞群体中；(b)将一个或多 个编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸引入宿主细胞群体中，其中免疫球蛋白融合蛋白能够 与免疫球蛋白轻链结合以形成免疫球蛋白分子的抗原结合结构域；（c)允许胞外包膜病毒 (EEV)从宿主细胞释放；（d)从上清液收集释放的EEV ; (e)将释放的EEV接触抗原；和（f) 回收第一文库的多核苷酸，其编码在EEV的膜表面上表达的并且是抗原特异性的免疫球蛋 白融合多肽。
[0021] 在一个实施方案中，对于用于选择编码抗原特异性免疫球蛋白重链可变区或其抗 原结合片段的多核苷酸的方法，其进一步包括：（g)将（f)中回收的多核苷酸引入允许牛痘 病毒感染的第二宿主细胞群体中；(h)将一个或多个编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸引入 宿主细胞群体中；（i)允许胞外包膜病毒（EEV)从宿主细胞释放；（j)从上清液收集释放的 EEV;(k)将释放的EEV接触抗原；和（1)回收第一文库的多核苷酸，其编码在EEV的膜表面 上表达的并且是抗原特异性的免疫球蛋白融合多肽。
[0022] 在特定的实施方案中，将步骤（g)-(l)重复一次或多次，由此富集第一文库的编 码作为特异性结合抗原的免疫球蛋白融合多肽的部分的免疫球蛋白重链可变区或其抗原 特异性片段的多核苷酸。
[0023] 在特定的实施方案中，分离从第一文库回收的多核苷酸。
[0024] 在另一个方面中，本公开内容涉及一种用于选择编码抗原特异性免疫球蛋白分子 或其抗原特异性片段的多核苷酸的方法，其包括：(a)将第一文库引入允许牛痘病毒感染 的宿主细胞群体中；(b)将第二文库引入宿主细胞群体中，其中在第二文库中，包含多个编 码免疫球蛋白轻链的多核苷酸，其中免疫球蛋白融合多肽能够结合免疫球蛋白轻链以形成 免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段；(c)允许从宿主细胞表达免疫球蛋白融合多肽；（d) 从宿主细胞收集免疫球蛋白融合多肽；（e)将收集的免疫融合多肽与抗原接触；和（f)回收 第一文库的多核苷酸，其编码对于抗原特异性的免疫球蛋白融合多肽。
[0025] 在一个实施方案中，用于选择编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片 段的多核苷酸的方法进一步包括：（g)将（f)中回收的多核苷酸引入允许牛痘病毒感染的 第二宿主细胞群体中；(h)将第二多核苷酸文库引入第二宿主细胞群体中；（i)允许从宿主 细胞表达免疫球蛋白融合多肽；（j)从宿主细胞收集免疫球蛋白融合多肽；(k)将收集的免 疫球蛋白融合多肽与抗原接触；和（1)回收第一文库的多核苷酸，其编码对于抗原特异性 的免疫球蛋白融合多肽。
[0026] 在特定的实施方案中，将步骤（g)-(l)重复一次或多次，由此富集第一文库的编 码作为特异性结合抗原的免疫球蛋白融合多肽的部分的免疫球蛋白重链可变区或其抗原 特异性片段的多核苷酸。
[0027] 在一个实施方案中，用于选择编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片 段的多核苷酸的方法进一步包括分离从第一文库回收的第三多核苷酸。
[0028] 附图简述
[0029] 图1.显示了 pJEMl质粒元件及其各自的序列（SEQ ID NO: 1)。
[0030] 图2.显示了使用重组牛痘病毒进行文库选择的一般策略的说明。
[0031] 图3A-C?显示了与野生型（WT)感染细胞（A)相比，用表达H2124-A56R+L517(B) 或2408-A56R-scFv(C)的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的C35染色和CD100染色的 荧光激活细胞分选（FACS)分析数据。
[0032]图4A-B.显示了使用C35/抗-VacHRP(A)和C35/抗-Fab(B)，含有C35特异性融 合蛋白（标记的"A56REEV"）、对照（"L517+G7000-A56REEV"）和标准膜结合IgGl形式 的C35特异性抗体的EEV的ELISA结合结果。
[0033] 图5A-D.显示了 2小时（A)和过夜⑶后C35结合以及2小时（C)和过夜⑶后 VEGF结合的噬斑试验平板结果。
[0034] 图6?显示了⑶100抗体选择策略的说明。
[0035] 图7.显示了CD100克隆C20的VH序列（SEQIDN0:19)和通过重组牛痘文库选 择鉴定的相同VH克隆的比对。
[0036] 图8.显示了具有轻链L48、L116和L9021的Her2. 3. 2和Her2. 3. 3选择的流式细 胞术C35和Her2染色结果。
[0037] 图9.显示了Her2抗体选择策略的说明。
[0038]图 10?显示了对于Her2. 3. 2 和Her2. 3. 3 选择的C35+ 抗-His和Her2+ 抗-His 的流式细胞分析结果。
[0039] 图11.显示了Her2克隆B10的VH序列（SEQIDN0:20)和通过重组牛痘文库选 择鉴定的相同VH克隆的比对。
[0040] 图12.显示了 "Fab"、"TR"和"IgGl重链"构建体的图解。
[0041] 图13.显示了用表达8000-FabL8000的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的 C35染色和Her2染色的荧光激活细胞分选（FACS)分析数据。
[0042]图 14?显示了表达（A)8000-IgGL8000 和（B)8000-TRL8000 的EEV重组牛痘病 毒感染的HeLa细胞的C35染色和Her2染色的荧光激活细胞分选（FACS)分析数据。
[0043] 图15?显示了表达（A)H2124-IgG和（B)H2124-TRL517的EEV重组牛痘病毒感染 的HeLa细胞的C35染色和Her2染色的荧光激活细胞分选（FACS)分析数据。
[0044] 图16.显示了CD100Lib10. 3FLOW分析的对照。表达⑷2368和⑶8000的 EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的Her2染色和⑶100染色的荧光激活细胞分选（FACS) 分析数据。
[0045] 图17.显示了甲苯磺酰基（Tosyl)选择的⑶100Lib10. 3FLOW分析的结果。表达 (A) L223、（B)L151和（C)L9021的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的Her2染色和CD100 染色的荧光激活细胞分选（FACS)分析数据。
[0046] 图18.显示了甲苯磺酰基选择的⑶100Lib10. 3FLOW分析的结果。表达（A)L48、 (B) L7110和（C)L122的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的Her2染色和CD100染色的荧 光激活细胞分选（FACS)分析数据。
[0047] 图19.显示了甲苯磺酰基选择的⑶100Lib10.3FLOW分析的结果。表达（A) L116、（B)L214和（C)L3-1的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的Her2染色和⑶100染 色的荧光激活细胞分选（FACS)分析数据。
[0048]图 20.显示了ProG选择的CD100Lib10. 3FLOW分析的结果。表达（A)L223、（B) L151和（C)L9021的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的Her2染色和CD100染色的荧光 激活细胞分选（FACS)分析数据。
[0049] 图21.显示了ProG选择的CD100Lib10. 3FLOW分析的结果。表达⑷L48、（B) L7110和（C)L122的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的Her2染色和CD100染色的荧光 激活细胞分选（FACS)分析数据。
[0050]图 22.显示了ProG选择的CD100Lib10. 3FLOW分析的结果。表达（A)L116、（B) L214和（C)L3-1的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的Her2染色和⑶100染色的荧光激 活细胞分选（FACS)分析数据。
[0051]图 23.显示了CD100Lib10. 3/L3-1FLOW分析的对照。表达⑷ 8000 和（B)2368 的EEV重组牛痘病毒感染的HeLa细胞的前复合物（Precomplex)Her2染色、2步CD100染色 和前复合物CD100染色的荧光激活细胞分选（FACS)分析数据。
[0052]图 24.显示了CD100Lib10. 3Tosyl/L3-lFLOW分析的结果。表达（A)CD100Lib 10. 3预分选的甲苯磺酰基选择的和（B)⑶100Lib10. 3分选的甲苯磺酰基选择的EEV重组 牛痘病毒感染的HeLa细胞的前复合物Her2染色、2步CD100染色和前复合物CD100染色的 荧光激活细胞分选（FACS)分析数据。
[0053] 图 25.显示了CD100Lib10. 3ProtG/L3-lFLOW分析的结果。表达（A)CD100Lib 10. 3预分选的ProtG选择的和（B)CDlOOLib10. 3分选的ProtG选择的EEV重组牛痘病毒 感染的HeLa细胞的前复合物Her2染色、2步CD100染色和前复合物CD100染色的荧光激活 细胞分选（FACS)分析数据。
[0054] 图26.显示了流式细胞分析结果，显示出mAb2050、2063和2110的对Juekat细 胞（⑶100+)和BxPC3细胞上的⑶100的特异性。
[0055] 图27.显示了与阳性对照和阴性对照相比，用三种⑶100特异性抗体（Mab2050、 MabC2063 和MabC2110)的（A)huCD100-His涂覆的和（B)Hemoglobin涂覆的平板的ELISA 结果。
[0056] 图28.显示了用于在牛痘展示方法后鉴定特定的Ig-H/Ig-L的示意图。
[0057] 图29.表达Her2特异性克隆（A)D5、（B)D8和（C)H2的EEV重组牛痘感染的HeLa 细胞的C35和Her2染色的荧光激活细胞分选（FACS)分析数据。
[0058]图30?显示了三种Her2特异性抗体（Mab8287、Mab8290和Mab9298)的ELISA结 果。
[0059] 图31.显示了流式细胞分析结果，显示出Mab8289、Mab8293和Mab8297的对SKBR3 细胞（Her2+++)上Her2的特异性。
[0060] 发明详述
[0061] 本发明宽泛地涉及在胞外包膜牛痘病毒（EEV)的表面上展示的真核系统中鉴定 和/或生产作为与包含EEV特异性膜蛋白的跨膜结构域的多肽区段的融合体的功能性抗原 特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段（即，抗原结合片段）的方法。此外，本发明涉 及从编码此类作为与包含EEV特异性膜蛋白的跨膜结构域的多肽区段的融合体的免疫球 蛋白分子或片段的多核苷酸的复合表达文库中鉴定编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其 抗原特异性片段的多核苷酸的方法，其中文库在胞外包膜牛痘病毒（EEV)的表面上展示的 真核系统中构建和筛选。进一步的实施方案包括融合蛋白，其包含（a)包含人重链CH1结 构域的第一多肽区段，（b)包含牛痘胞外包膜病毒（EEV)-特异性膜蛋白的胞外和跨膜结构 域的第二多肽区段。在进一步的实施方案中，本文中公开的融合蛋白可以包含结合分子，例 如，免疫球蛋白的抗原特异性部分或其部分，例如，重链可变区，其在与合适的免疫球蛋白 轻链配对时结合目标抗原。
[0062] 本发明的一个方面是在胞外包膜牛痘病毒（EEV)的表面上展示的真核系统中构 建复合免疫球蛋白文库，其作为与包含EEV特异性膜蛋白的跨膜结构域的多肽区段的融合 体。
[0063] 应注意术语"一个（a) "或"一个"实体是指一个或多个所述实体；例如，"一免疫 球蛋白分子"理解为表示一个或多个免疫球蛋白分子。同样，术语"一（a)"（或"一个"）、 "一个或多个"和"至少一个"在本文中可以互换使用。
[0064] 术语"真核细胞"或"真核生物体"意图包含动物界、植物界和原生生物界的所有生 物体，包括原生生物、真菌、酵母、绿藻、单细胞植物、多细胞植物和所有动物（脊椎动物和 无脊椎动物）。该术语没有包含细菌或病毒。"真核细胞"意图包含单数的"真核细胞"以 及复数的"真核细胞"，并且包含源自真核生物的细胞。
[0065] 术语"脊椎动物"意图包含单数的"脊椎动物"以及复数的"脊椎动物"，并且包含 哺乳动物和鸟类，以及鱼类、爬行动物和两栖动物。
[0066] 术语"哺乳动物"意图包含单数的"哺乳动物"和复数的"哺乳动物"，并且包括，但 不限于人灵长类，如猿、猴子、猩猩和黑猩猩；犬科动物，如狗和狼；猫科动物，如猫、狮子和 老虎；马科动物，如马、驴和斑马；食物动物，如奶牛、猪和绵羊；有蹄动物，如鹿和长颈鹿； 啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；以及熊。在特定的实施方案中，哺乳动物是人类受试 者。
[0067] 术语"组织培养物"或"细胞培养物"或"培养物"或"培养"是指植物或动物组织 或细胞在允许保持细胞构造、保持细胞功能、进一步分化或所有这三者的条件下在体外的 维持或生长。"原代组织细胞"是直接从组织获取的那些，即，在生物体中执行相同功能的相 同种类的细胞群体。例如，用蛋白水解酶胰蛋白酶处理这些组织细胞将它们分离成单个的 原代组织细胞，其在接种于培养平板上时生长或维持细胞构造。
[0068] 术语"多核苷酸"是指存在于核酸或构建体中的任何一个或多个核酸区段或核酸 分子，例如，DNA或RNA片段。"编码免疫球蛋白亚基多肽的多核苷酸"是指包含此种多肽的 编码区的多核苷酸。此外，多核苷酸可以编码调控元件，如启动子或转录终止子，或可以编 码多肽或蛋白质的特定元件，如分泌信号肽或功能性结构域。
[0069] 如本文中所用的，术语"鉴定"是指其中从多个所需分子（例如，编码具有所需特 异性或功能的免疫球蛋白分子的多核苷酸）或所需分子文库区分出此类分子的方法。鉴定 方法可以包括"选择"和"筛选"。如本文中所用的，"选择"方法是其中所需分子可以从文 库直接分离的那些。例如，在本文中所述的一种选择方法中，通过经受细胞溶解事件并且由 此从其余宿主细胞连接的基质释放而使包含所需多核苷酸的宿主细胞与包含文库其余部 分的宿主细胞直接分离。如本文中所用的，"筛选"方法是其中将包含所需分子的池经历其 中可以检测所需分子的试验的那些方法。然后将其中分子被检测的池的等份试样连续分成 同样进行分析的较小池，直至获得所需分子高度富集的池。
[0070] 免疫球蛋白。如本文中所用的，"免疫球蛋白分子"定义为完整的双分子免疫球蛋 白，即，通常包含四个"亚基多肽"，即两个相同的重链和两个相同的轻链。在一些情况中，例 如，源自骆驼科（camelid)物种的或基于骆驼免疫球蛋白工程化的免疫球蛋白分子，完整 的免疫球蛋白分子可以只由重链组成，没有轻链。参见，例如，Hamers-Casterman等，Nature363:446-448(1993)。因此，"免疫球蛋白亚基多肽"表示单重链多肽或单轻链多肽。免疫球 蛋白分子还称为"抗体"，并且该术语在本文中可以互换使用。"分离的免疫球蛋白"是指基 本上从蛋白质和其他物质的环境中移除并且结合特定抗原的一个免疫球蛋白分子或者两 个或更多个免疫球蛋白分子。
[0071] 决定免疫球蛋白分子"类别"的重链是较大的两个亚基多肽，并且包含可变区和恒 定区。"重链"表示全长分泌的重链形式，即从细胞释放的形式，或膜结合重链形式，即包含 跨膜结构域，例如，与包含EEV-特异性膜蛋白的跨膜结构域的多肽区段的融合体。免疫球 蛋白"类别"是指在宿主中起不同功能的免疫球蛋白的大组。例如，人免疫球蛋白分成五类， 艮P，IgG,包含Y重链；IgM,包含ii重链；IgA,包含a重链；IgE,包含e重链；和IgD,包 含5重链。
[0072] "轻链"表示与重链氨基端区域结合的较小的免疫球蛋白亚基。与重链一样，轻链 包含可变区和恒定区。存在两种不同类型的轻链，k和X，并且它们中的一对可以与各种 重链中的任意一对结合以形成免疫球蛋白分子。
[0073] 免疫球蛋白亚基多肽通常包含恒定区和可变区。在大部分物种中，重链可变 区或VH结构域和轻链可变区或八结构域组合以形成"互补决定区"或CDR，这是免疫球 蛋白分子特异性识别抗原表位的部分。通过导致形成编码给定可变区的基因的一系列 种系DNA区段的重排，在动物中抗体产生细胞分化时产生了与重链和轻链恒定区结合 的可变区的大集合。重链和轻链可变区的更多变异通过分化细胞中的体细胞突变来发 生。免疫学领域的普通技术人员能充分理解免疫球蛋白分子的结构和体内形成。免疫 球蛋白多样性产生的简要综述可以在例如Harlow和Lane，Antibodies,ALaboratory Manual(抗体，实验室手册），ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor,N. Y. (1988)(下文中称为"Harlow"）；和Roitt等，Immunology(免疫学）GowerMedical Publishing,Ltd. ,London(1985)(下文中称为"Roitt"）中找到。将Harlow和Roitt全部 按引用并入本文中。
[0074] 如本文中所用的，免疫球蛋白分子的"抗原特异性片段"是保持结合抗原能力的免 疫球蛋白分子的任何片段或变体。抗原特异性片段包括，但不限于，Fab、Fab'和F(ab'）2、Fd、单链Fv(scFv)、单链免疫球蛋白（例如，其中重链或其部分和轻链或其部分融合）、二硫 化物连接的Fv(sdFv)、双链抗体、三链抗体、四链抗体、scFv微抗体（minibody)、Fab微抗体 和二聚scFv以及任何包含其构象使得形成特定CDR的 '和VH结构域的其他片段。
[0075] 抗原特异性免疫球蛋白片段可以包含单独的或者与完整的或部分恒定区（例如， 重链上的CHI、CH2、CH3结构域，和轻链恒定结构域，例如，轻链上的CK*CA结构域，或其 部分）结合的可变区。在特定的方面中，如本文中公开的融合蛋白包含与CH1恒定结构域 融合的重链可变结构域，所述CH1恒定结构域与包含EEV特异性膜蛋白（例如，A56R)的跨 膜结构域的多肽区段融合。
[0076] 在特定的实施方案中，本发明涉及鉴定（S卩，选择或可选地筛选）单独地或共同地 编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的多核苷酸的方法。在特定的实施方 案中，提供了选择具有目标抗原特异性的免疫球蛋白分子的方法，其中免疫球蛋白或抗体 在EEV表面上展示，分离EEV，并且分离编码免疫球蛋白的一部分（例如，VH区）的多核苷 酸。
[0077] 在特定的方面中，提供了选择编码抗原特异性免疫球蛋白分子的多核苷酸的方 法，其中该方法包括：（1)将第一多核苷酸文库引入允许牛痘病毒感染的宿主细胞群体中。 该文库可以在编码多个免疫球蛋白融合多肽的牛痘病毒载体（例如，EEV载体）中构建，其 中牛痘病毒载体包含（a)编码包含人重链CH1结构域（例如，CH1-Y结构域）的第一多肽 区段的第一多核苷酸，（b)编码包含牛痘膜蛋白的胞外和跨膜结构域的第二多肽区段（例 如，包含EEV-特异性膜蛋白例如，A56R的跨膜结构域的多肽区段）的第二多核苷酸，和（c) 编码免疫球蛋白重链可变区或其片段的第三多核苷酸。该方法进一步包括（2)将编码轻 链（例如，已知轻链）的多核苷酸或包含各自编码免疫球蛋白轻链的多个多核苷酸的第二 文库引入宿主细胞群体中。一旦被引入宿主细胞群体中，免疫球蛋白融合多肽可以结合免 疫球蛋白轻链以形成免疫球蛋白分子的抗原结合部分，其中该分子可以在可选择颗粒（例 如，通过宿主细胞产生并释放至周围介质中的EEV病毒粒）的表面上表达或"展示"。该方 法进一步用于选择从宿主细胞释放的结合目标抗原的EEV，例如，通过与平板或珠（例如， 蛋白G珠、抗生物素蛋白链菌素珠或甲苯磺酰化珠）的抗原特异性连接。然后可以回收表 达目标抗原结合结构域的EEV，并且用于重新感染新的宿主细胞，由此富集含有编码结合目 标抗原的免疫球蛋白重链的多核苷酸的EEV。然后可以回收该多核苷酸。可以重复该方法， 由此富集编码目标重链融合蛋白的多核苷酸。
[0078] 然后可以将分离的编码结合目标抗原的免疫球蛋白重链多肽融合蛋白的多核苷 酸转移至宿主细胞中并在其中表达（作为EEV融合蛋白或不作为EEV融合蛋白），其中编码 与包含EEV-特异性膜蛋白的跨膜结构域的多肽区段融合的免疫球蛋白轻链可变区的多核 苷酸的文库从而允许鉴定编码轻链可变区的多核苷酸，所述轻链可变区在结合第一步中鉴 定的重链可变区时，形成功能性免疫球蛋白分子或其识别特定的抗原的片段。
[0079] 如本文中所用的，"文库"是代表性多核苷酸类属（genus)，即通过例如其来自单一 动物物种、组织类型、器官或细胞类型的来源相关的一组多核苷酸，其中文库总体地包含在 给定多核苷酸类属内的至少两个不同种类。多核苷酸文库可以包含给定多核苷酸类属内的 至少10、100、10 3、104、105、106、107、10 8或109个不同种类。所述类属可以是相关分子，例如， 免疫球蛋白可变区，例如，人免疫球蛋白VH结构域或VL结构域。VH和VL结构域可以表示 可变结构域的整个集合，或可以早已是抗原特异性的，例如，对相同抗原特异性的。更具体 地，文库可以编码多个免疫球蛋白亚基多肽，即，重链亚基多肽或轻链亚基多肽。在这一情 况中，"文库"可以包含共同类属的多核苷酸，所述类属是编码特定类型和类别的免疫球蛋 白亚基多肽的多核苷酸，例如，文库可以编码人y、Y-l、Y-2、y-3、y-4、a-1、a-2、e 或S重链，或人K或A轻链。尽管任一个文库的各个成员可以编码相同的重链或轻链恒 定区，但文库总体地可以包含至少两个，或至少10、100、1〇 3、1〇4、1〇5、1〇6、1〇7、1〇 8或109个不 同的可变区，即与共同的恒定区结合的"多个"可变区。
[0080] 在其他实施方案中，文库可以编码多个免疫球蛋白单链片段，其包含可变区，如轻 链可变区或重链可变区，或可以同时包含轻链可变区和重链可变区。
[0081] 在一个方面中，本文提供了生产编码免疫球蛋白亚基多肽的多核苷酸文库的方 法。进一步提供了在真核表达载体（例如，EEV)中构建为融合蛋白的免疫球蛋白亚基多肽 的文库，其中免疫球蛋白亚基多肽与包含EEV-特异性膜蛋白（例如，A56R)的跨膜结构域 的多肽区段融合。
[0082] "受体细胞"或"宿主细胞"或"细胞"表示其中引入了如本文中所述的多核苷酸文 库的细胞或细胞群体。用于本文中所述文库的合适宿主细胞是允许牛痘病毒感染的真核细 胞。合适的细胞系可以是脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物、小鼠、灵长类动物或人细胞或细胞 系。
[0083]"宿主细胞群体"表示其中可以引入和表达如本文中提供的"文库"的一组培养的 细胞。用于本文中所述的EEV文库的宿主细胞可以允许牛痘病毒感染。本发明的宿主细胞 可以是粘附的，即粘附于固体基质生长的宿主细胞，或可选地，宿主可以是悬浮的。
[0084]如上所述，鉴定免疫球蛋白分子的特定方法包括将"第一"多核苷酸文库（编码例 如VH-CH1-A56R融合蛋白）引入宿主细胞群体中，以及将"第二"多核苷酸文库（例如，编 码VL区）引入相同的宿主细胞群体中。第一和第二文库是互补的，S卩如果"第一"文库编 码免疫球蛋白重链可变结构域，那么"第二"文库将编码免疫球蛋白轻链可变结构域，由此 允许免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段在宿主细胞群体中装配，使得免疫球蛋白在EEV 表面上表达或展示。
[0085]本文中所述文库中包含的多核苷酸可以通过"与转录控制区可操作地关联"来编 码免疫球蛋白亚基多肽。在将给定多核苷酸中的一个或多个核酸分子置于功能关系中时， 它们是"可操作地关联的"。这种关系可以是以允许在合适的分子（例如，转录激活子蛋白、 聚合酶等）结合于调控序列时编码区表达的方式连接的多肽的编码区和调控序列之间的 关系。"转录控制区"包括，但不限于启动子、增强子、操纵子和转录终止信号，并且与多核苷 酸包括在一起以指导其转录。例如，如果启动子能够影响编码免疫球蛋白亚基多肽的核酸 分子的转录，则启动子与该核酸分子可操作地关联。通常，"可操作地关联"表示DNA序列 在多核苷酸中是连续的或紧密连接的。然而，一些转录控制区，例如，增强子，不必须是连续 的。
[0086] "控制序列"或"控制区"表示在特定的宿主生物体中可操作在关联的编码序列表 达所需要的DNA序列。已知真核细胞利用启动子、多腺苷化化信号和/或增强子。
[0087]各种转录控制区是本领域技术人员已知的。如以下更详细讨论的，合适的转录控 制区包括能够在痘病毒感染的细胞的细胞质中起作用的启动子。
[0088] 在特定的实施方案中，如本文中所述的融合蛋白可以包含连接物，例如，连接免疫 球蛋白可变结构域与恒定结构域，例如，CH1、C_k或C-A结构域，和/或连接恒定结构域 与包含EEV-特异性膜蛋白（例如，A56R)的跨膜结构域的多肽区段。连接物可以包含，例 如，至少约5、至少约10或至少约15个氨基酸。合适的连接物可以由本领域普通技术人员 来确定。
[0089] 在本文中所述的融合蛋白包含重链恒定区（例如，CH1结构域）的情况中，可以 利用任何重链恒定区，包括，但不限于来自脊椎动物如鸟类、鱼或哺乳动物的免疫球蛋白重 链，例如，人免疫球蛋白重链。例如，人免疫球蛋白重链或其部分，例如，CH1结构域，可以是 U重链或其片段（即，IgM免疫球蛋白的重链），Y-1重链或其片段（即，IgGl免疫球蛋 白的重链），Y-2重链或其片段（即，IgG2免疫球蛋白的重链），Y-3重链或其片段（即， IgG3免疫球蛋白的重链），Y_4重链或其片段（即，IgG4免疫球蛋白的重链），a-1重链 或其片段（即，IgAl免疫球蛋白的重链），a _2重链或其片段（即，IgA2免疫球蛋白的重 链），e重链或其片段（即，IgE免疫球蛋白的重链），或S重链或其片段（即，IgD免疫球 蛋白的重链）。
[0090] 如本文中所述的膜结合融合蛋白可以通过与重链多肽融合的跨膜结构域锚定于 颗粒，例如，牛痘病毒颗粒（或病毒粒），例如，EEV颗粒（或病毒粒）的表面上。在特定的 实施方案中，跨膜结构域是包含EEV特异性膜蛋白的跨膜结构域的多肽区段的部分，S卩，在 胞外包膜牛痘病毒的表面上表达但不在胞内牛痘病毒颗粒上表达的蛋白。在特定的实施方 案中，EEV特异性膜蛋白是A56R，牛痘HA蛋白。"胞内结构域"、"细胞质结构域"、"细胞溶质 区"或相关术语在本文中可互换使用，表示在细胞内部的融合多肽的部分。
[0091] 在其中融合蛋白或其他文库蛋白包含免疫球蛋白轻链或其片段的那些实施方案 中，可以使用来自任何动物物种的任何免疫球蛋白轻链，例如，来自脊椎动物如鸟类、鱼或 哺乳动物的免疫球蛋白轻链，例如，人轻链，例如，人K和A轻链。轻链可以与重链结合以 产生免疫球蛋白分子的抗原结合蛋白。
[0092] 如本文中所述的编码重链融合蛋白的多核苷酸文库的每个成员可以包含（a)编 码包含文库所有成员共有的免疫球蛋白恒定区（例如，CH1结构域，例如，Y或iiCHl结构 域）的第一多肽区段的第一核酸分子，（b)编码包含牛痘胞外包膜病毒（EEV)特异性膜蛋 白（例如，A56R)的胞外和跨膜结构域的第二多肽区段的第二核酸分子，其中第二核酸分子 在第一核酸分子直接下游并且与第一核酸分子同框（直接融合或通过连接物连接），和（c) 编码包含免疫球蛋白重链可变区的第三多肽区段的第三核酸分子，其中第三核酸分子在第 一核酸分子直接上游并且与第一核酸分子同框（直接融合或通过连接物连接）。
[0093] 如本文中所述的编码轻链融合蛋白的多核苷酸文库的每个成员可以包含（a)编 码包含文库所有成员共有的免疫球蛋白恒定区（例如，C-k或C-A结构域）的第一多肽 区段的第一核酸分子，（b)编码包含牛痘胞外包膜病毒（EEV)特异性膜蛋白（例如，A56R) 的胞外和跨膜结构域的第二多肽区段的第二核酸分子，其中第二核酸分子在第一核酸分子 直接下游并且与第一核酸分子同框（直接融合或通过连接物连接），和（c)编码包含免疫球 蛋白轻链可变区的第三多肽区段的第三核酸分子，其中第三核酸分子在第一核酸分子直接 上游并且与第一核酸分子同框（直接融合或通过连接物连接）。
[0094] 没有与包含EEV特异性膜蛋白的跨膜结构域的多肽区段融合的免疫球蛋白重链 或轻链的文库可以用于共同感染宿主细胞以提供"互补的"免疫球蛋白链，从而产生功能性 抗原结合免疫球蛋白片段。这样的文库详细描述于例如美国专利No. 7, 858, 559中。
[0095] 编码重链或轻链可变区的多核苷酸文库可以含有多个（即，至少两个，或至少10、 100、103、104、105、10 6、107、108或109个）不同的可变区。如本领域普通技术人员公知的，轻 链可变区由重排的核酸分子编码，其各自包含轻链'区（具体是VK区或区）以及轻 链J区（具体是JK区或区）。相似地，重链可变区由重排的核酸分子编码，其各自包 含重链VH区、D区和J区。这些重排在细胞分化时在DNA水平上发生。例如，可以通过PCR 从成熟B细胞和浆细胞（其最终分化来表达对特定表位具有特异性的抗体）得到编码重链 和轻链可变区的核酸分子。此外，如果需要针对特定抗原的抗体，可以从已经用所述抗原免 疫的动物的成熟B细胞和浆细胞分离可变区，并且由此产生与抗原相互作用的抗体可变区 的扩增的集合。或者，如果需要更多样性的文库，可以从前体细胞（例如，前-B细胞和未成 熟B细胞）分离可变区，所述前体细胞已经经历了免疫球蛋白基因的重排，但没有暴露于抗 原（自体抗原或非自体抗原）。例如，可以通过RT-PCR从多名捐献者汇合的正常人骨髓分 离可变区。或者，可变区可以是合成的，例如，在实验室中通过产生合成寡核苷酸来制得，或 可以通过导致免疫球蛋白基因重排的种系DNA的体外操作来得到。
[0096]除了分别编码免疫球蛋白恒定区和可变区的第一和第二核酸分子以外，如上所述 的本发明的多核苷酸文库的每个成员可以进一步包含在编码可变区的核酸分子的直接上 游并且与其同框的编码信号肽的另外的核酸分子。
[0097]"信号肽"表示例如指引新生的免疫球蛋白多肽亚基转运至宿主细胞表面的多肽 序列。信号肽在本领域中也称为"信号序列"、"前导序列"、"分泌信号肽"或"分泌信号序 列"。信号肽通常作为完整或"未成熟"多肽的部分来表达，并且通常位于N-末端。
[0098]所有细胞（包括本发明的宿主细胞）具有组成型分泌途径，其中蛋白质（包括预 定用于输出的分泌的免疫球蛋白亚基多肽）从细胞分泌。这些蛋白经过期号可发生修饰的 ER-高尔基体加工途径。如果在蛋白质上没有检测到进一步的信号，其被指引至细胞表面 用于分泌或作为宿主细胞或病毒颗粒（例如，EEV病毒粒）表面上表达的组成膜成分插入。 免疫球蛋白亚基多肽的膜结合形式最初遵循与分泌形式相同的途径，经过ER内腔，除了它 们通过停止-转移信号或"跨膜结构域"的存在而保留在ER膜中。跨膜结构域是约20个 氨基酸残基的疏水性延伸，其跨越膜时采用螺旋构象。膜包埋蛋白锚定在质膜的磷脂 双层中。与分泌蛋白一样，跨膜蛋白的N-末端区具有信号肽，其通过膜并且在出离到ER内 腔中时切割。
[0099] 新合成的免疫球蛋白重链通过称为BiP的伴侣蛋白（Hsp70分子伴侣家族的成员） 保持滞留在ER中。重链CH1结构域与其伴体轻链的CL结构域的配对诱导BiP的解离、最 终的折叠和二硫键形成，以及装配的抗体从ER输出。然后抗体利用细胞的正常分泌途径， 并且通过高尔基体输送至细胞表面，在此处分泌或保留在表面上（如果抗体具有跨膜结构 域）。参见Daniel等，MolecularCell34:635-36(2009)。
[0100] 本文中提供的合适信号肽可以是天然产生的免疫球蛋白信号肽，即，由作为天然 产生的重链或轻链转录物的部分的序列编码的，或者是保留指引与其可操作地关联的免疫 球蛋白亚基多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。或者，可以使用异源信号肽或其功 能性衍生物。在特定的方面中，信号肽可以是牛痘病毒A56R蛋白的信号肽或其功能性衍生 物。
[0101] 在其他方面中，本文中所述的多核苷酸文库的成员可以进一步包含编码异源多肽 的另外的核酸分子。这样的编码异源多肽的另外的核酸分子可以在编码免疫球蛋白可变结 构域或恒定结构域或者EEV特异性膜蛋白的核酸分子的上游或下游。
[0102] 由另外的核酸分子编码的异源多肽可以是拯救序列。拯救序列是可以用于纯化或 分离免疫球蛋白或其片段的序列或者编码其的多核苷酸。因此，例如，肽拯救序列包括用 于Ni亲和柱的纯化序列，如6-His标签，以及用于检测、免疫沉淀或FACS(荧光激活细胞分 选）的表位标签。合适的表位标签包括myc(用于商业购得的9E10抗体）、细菌酶BirA的 BSP生物素化靶序列、flu标签、LacZ和GST。另外的核酸分子也可以编码肽连接物。
[0103] 本文中所述的各种文库中包含的多核苷酸可以引入合适的宿主细胞中。合适的宿 主细胞的特征可以在于例如能够表达与其表面连接的免疫球蛋白分子或是允许牛痘病毒 感染。可以通过本领域普通技术人员公知的方法将多核苷酸引入宿主细胞中。在多核苷酸 是病毒载体（例如，牛痘病毒）的部分的情况中，可以通过标准感染方便地引入宿主细胞 中。
[0104] 可以以任何顺序或同时将第一和第二多核苷酸文库引入宿主细胞中。例如，如果 在牛痘病毒载体（无论是传染性的或灭活的）中构建第一和第二多核苷酸文库两者，该载 体可以作为混合物通过同时感染来引入，或可以以连续的感染来引入。如果在牛痘病毒载 体中构建一个文库，而另一个在质粒载体中构建，则可以通过在另一个文库之前引入一个 文库来进行引入。
[0105] 将第一和第二多核苷酸文库引入宿主细胞中后，允许EEV表面上的免疫球蛋白分 子或其抗原特异性片段的表达发生。"允许表达"意思是允许已经引入宿主细胞中的载体经 受免疫球蛋白亚基多肽的转录和翻译，允许宿主细胞将完全装配的免疫球蛋白分子或其抗 原特异性片段作为与包含EEV特异性膜蛋白的跨膜结构域的多肽区段的融合体转运至膜 表面。通常，允许表达需要在允许表达的合适条件下孵育其中已经引入多核苷酸的宿主细 胞。允许表达所需的那些条件和时间将根据宿主细胞的选择和载体的选择而改变，如本领 域普通技术人员公知的。
[0106] 在特定的实施方案中，然后将已经允许表达在其表面上的免疫球蛋白分子或分泌 至细胞介质中的可溶性免疫球蛋白分子的宿主细胞和/或牛痘病毒粒接触抗原。如本文中 所用的，"抗原"是可以特异性结合抗体、免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的任何分子。 "特异性结合"表示抗原结合抗体的CDR。与CDR特异性地相互作用的抗原部分是"表位"或 "抗原决定簇"。抗原可以包含单一表位，但通常，抗原包含至少两个表位，并且可以包含任 何数量的表位，这取决于抗原的大小、构象和类型。
[0107] 抗原通常是肽或多肽，但可以是任何分子或化合物。例如，有机化合物（例如，二 硝基酚或DNP)、核酸、碳水化合物或任何这些化合物的混合物（具有或不具有肽或多肽）可 以是合适的抗原。据认为肽或多肽表位的最小尺寸为约四个至五个氨基酸。肽或多肽表位 可以含有至少七个、至少九个，或至少约15至约30个氨基酸。由于⑶R可以识别其三级形 式的抗原性肽或多肽，因此构成表位的氨基酸不需要是邻接的，并且在一些情况中，甚至可 以不是在同一肽链上。在本发明中，肽或多肽抗原可以含有至少4、至少5、至少6、至少7、 至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25以及约15至约30个氨基酸的序列。在 特定的实施方案中，包含抗原表位或由其组成的肽或多肽长度是至少1〇、15、20、25、30、35、 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸残基。抗原可以是任何形式的，并 且可以是游离的，例如溶解于溶液中，或可以连接于任何基质。本文中公开了合适的基质。 在特定的实施方案中，抗原可以是抗原表达牛痘病毒的部分，例如，以下更详细描述的EEV 病毒粒。
[0108] 可以根据本文中公开的方法来产生对于任一抗原特异性的免疫球蛋白分子。在特 定的实施方案中，抗原是"自体"抗原，即源自所产生的免疫球蛋白分子的相同物种的抗原。 例如，可能希望产生针对人肿瘤抗原的人抗体。其他所需的"自体"抗原包括，但不限于，细 胞因子、受体、配体、糖蛋白和激素。
[0109] 也可以通过公开的方法来鉴定和选择针对传染剂上的抗原的抗体。这样的抗原的 实例包括，但不限于，细菌抗原、病毒抗原、寄生虫抗原和真菌抗原。
[0110] 在其中免疫球蛋白分子在EEV表面上表达的特定选择和筛选方案中，按照所述产 生的重组EEV病毒粒通过将允许抗原（其特异性地识别EEV表面上表达的免疫球蛋白分子 的CDR)结合CDR的方法来"接触"抗原，由此允许特异性结合抗原的重组EEV病毒粒与不 结合抗原的那些EEV病毒粒区分开来。包括允许表达抗体的抗原特异性结合结构域的重组 EEV病毒粒与抗原相互作用的任何方法。例如，如果EEV病毒粒在悬浮液中，并且抗原连接 于固体基质，那么特异性结合抗原的重组EEV病毒粒将被捕获在固体基质上，从而允许不 结合抗原的那些病毒粒被洗掉，并且随后回收结合的重组EEV病毒粒。本文中公开了允许 重组EEV病毒粒接触抗原的方法。
[0111] 回收特异性结合抗原的重组EEV病毒粒后，可以从那些EEV病毒粒回收第一文库 的多核苷酸。"回收"表示将所需的成分与不需要的那些成分粗略地分离。例如，可以基于 它们与抗原涂覆的固体基质（例如为磁珠）的连接来"回收"结合抗原的重组EEV病毒粒， 其随后可以用磁体来分离。
[0112] 可以通过本领域普通技术人员已知的任何标准方法来完成多核苷酸的回收。在特 定的实施方案中，通过收获结合抗原的传染性EEV病毒粒来回收多核苷酸。
[0113] 如本领域普通技术人员容易认识到的，编码免疫球蛋白融合多肽的多核苷酸的鉴 定需要两轮或更多轮的如上所述的选择，且必然需要两轮或更多轮的如上所述的筛选。单 轮选择不一定导致编码所需第一免疫球蛋白融合多肽的纯的多核苷酸集合的分离；第一轮 后获得的混合物可以对于所需的多核苷酸是富集的，但可能还有非靶标插入序列的污染。 因此，按照所述的第一选择步骤可以或必须重复一次或多次，由此富集编码所需免疫球蛋 白融合多肽的多核苷酸。为了重复这个实施方案的第一步骤，包含按照以上所述回收的那 些多核苷酸的EEV可以经由感染引入宿主细胞群体中。第二多核苷酸文库也引入这些宿主 细胞中，例如，通过用能够表达由文库中的多核苷酸编码的互补免疫球蛋白分子（例如，轻 链）的牛痘病毒感染，并且允许在重组EEV病毒粒的膜表面上表达免疫球蛋白分子或其抗 原特异性片段。类似地重组EEV病毒粒与抗原接触，并且再次从EEV病毒粒（其表达特异性 结合抗原的免疫球蛋白分子）回收第一文库的多核苷酸。这些步骤可以重复一次或多次， 从而导致源自第一文库的多核苷酸的富集，所述多核苷酸编码作为特异性结合抗原和/或 具有所需功能性特征的免疫球蛋白或其抗原特异性片段的部分的免疫球蛋白融合多肽。
[0114] 从上述第一文库适当地富集所需多核苷酸后，已经回收的那些多核苷酸是"分离 的"，即，它们实质从其天然环境移除并且大部分与文库中不编码抗原特异性免疫球蛋白多 肽的多核苷酸分离。例如，载体中所含的克隆多核苷酸被认为是分离的。将理解通过本文中 所述的方法可以回收两种或更多种不同的免疫球蛋白融合多肽（其与例如轻链结合时特 异性地结合相同的抗原）。因此，编码结合相同抗原的多肽的多核苷酸的混合物也被认为是 "分离的"。分离的多核苷酸的更多实例包括保持在异源宿主细胞、重组牛痘（例如，EEV病 毒粒）的那些或在溶液中的纯化（部分或基本上）的DNA分子。然而，对于本发明的目的， 作为混合文库的成员并且没有与文库的其他克隆分离（例如，通过编码抗原特异性免疫球 蛋白融合多肽）的克隆中所含的多核苷酸不是"分离的"。例如，在已经回收并且任选噬斑 纯化后，病毒载体中所含的多核苷酸是"分离的"。
[0115] 鉴于抗原可以包含两个或更多个表位，并且几种不同的免疫球蛋白分子可以结合 任何给定的表位，设想可以从这个实施方案的第一步回收几种合适的多核苷酸，例如，两 种、三种、四种、五种、十种、100种或更多种多核苷酸，其全部可以编码免疫球蛋白融合多 肽，该免疫球蛋白融合多肽在与由预选的多核苷酸或第二文库的多核苷酸编码的合适免疫 球蛋白亚基多肽结合时将形成能够特异性地结合目标抗原的免疫球蛋白分子或其抗原结 合片段。设想单独地分离从第一文库回收的每种不同的多核苷酸。
[0116] 一旦从分离了来自第一文库的一种或多种合适的多核苷酸，在这个实施方案的第 二步骤中，在第二文库中鉴定一种或多种多核苷酸，其编码能够与从第一文库分离的多核 苷酸编码的免疫球蛋白融合多肽结合以形成特异性结合目标抗原的免疫球蛋白分子或其 抗原结合片段的免疫球蛋白亚基多肽。
[0117] 本文中提供了用于抗原结合分子表达的牛痘病毒载体，其中抗原结合分子，例如， 免疫球蛋白重链可变区和CH1，作为与EEV特异性膜蛋白的融合体来表达。在特定的实施方 案中，作为EEV融合蛋白来回收重链，并且轻链文库或单个预选择轻链可以在牛痘病毒或 其他载体（例如，质粒载体）中作为可溶性蛋白来表达。
[0118] 在特定的实施方案中，可以用4'-氨基甲基-氧补骨脂素（补骨脂素）并且随 后将病毒载体暴露于紫外（UV)光来进行表达可溶性互补链（例如，轻链）的病毒的灭 活。病毒的补骨脂素和UV灭活是本领域普通技术人员公知的。参见，例如，Tsung，K.等， J.Virol. 70:165-171 (1996)，将其全部按引用并入本文中。
[0119] 在真核细胞中从编码免疫球蛋白亚基多肽（其中一个亚基作为与EEV特异性膜蛋 白的融合体来表达）的两个多核苷酸文库装配和表达免疫球蛋白分子或其抗原特异性片 段的能力提供了优于在细菌系统中生产单链抗体的方法的显著进步，因为两步选择方法可 以是用于选择具有各种特异性的免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的基础。
[0120] 牛痘EEV载体。痘病毒在DNA病毒中是独特的，因为它们只在宿主细胞的细胞质 中，在细胞核外复制。在其复制周期中，牛痘病毒产生外膜存在不同的四种感染性形式：胞 内成熟病毒粒（MV)、胞内包膜病毒粒（IEV)、细胞相关包膜病毒粒（CEV)和胞外包膜病毒 粒（EEV)。普遍的观点是MV由单一脂蛋白膜组成，而CEV和EEV都是由两个膜层包围，且 IEV具有三个包膜。EEV从宿主细胞的质膜脱落，并且EEV膜源自转运-高尔基体。
[0121] 感染后，病毒丧失其膜，并且DNA/蛋白质核心沿着微管转运至细胞中。由早期牛 痘mRNA( "早期"定义为DNA复制前）编码的蛋白质导致牛痘核心的脱壳以及随后的DNA 复制。这种复制发生在所谓的"病毒工厂"中，其主要位于ER的顶部。在病毒工厂内，未成 熟的病毒粒（IV)装配并且加工以形成MV(胞内成熟病毒）。MV含有源自ER的膜。大 部分的IMV通过细胞裂解从细胞释放。一些IMV在微管上转运至由转运高尔基体网络或 早期核内体包裹的位点。頂V颗粒被双重膜包裹形成了称为IEV(胞内薄膜病毒）的牛痘 病毒形式。然后IEV在微管上转运至细胞表面。外层IEV膜与质膜融合以在细胞表面暴 露CEV(细胞相关包膜病毒）。来自宿主细胞的肌动蛋白聚合可以驱动CEV感染邻近的细 胞，或病毒可以作为EEV释放。参见，例如，KimL.Roberts和GeoffreyL.Smith。Trends inMicrobiology16(10):472-479(2008);GeoffreyL.Smith?等，JournalofGeneral Virology83:2915-2931(2002)〇
[0122] 至少六种病毒编码的蛋白质已经报道为EEV包膜的组分。其中，四种蛋白质 (A33R、A34R、A56R和B5R)是糖蛋白，一种（A36R)是非糖基化跨膜蛋白，和一种（F13L)是棕 榈酰化外周膜蛋白。参见，例如，Lorenzo等，JournalofVirology74(22): 10535(2000)。 在感染过程中，这些蛋白质定位至高尔基体复合物，它们在此处并入传染性病毒中，然后传 染性病毒转运并释放至胞外介质中。如本文中提供的，免疫球蛋白融合多肽（例如，可变重 链），例如，作为与EEV特异性膜蛋白（例如，A56R)的融合蛋白，结合EEV膜。
[0123] 如本文中提供的EEV融合蛋白可以在任何合适的牛痘病毒中表达。在特定的实施 方案中，可以将编码EEV融合蛋白的DNA插入牛痘病毒基因组中对于生长和载体的复制非 必需的区域中，使得产生传染性病毒。尽管已经表征了牛痘病毒基因组的多种非必需区域， 但最广泛使用的用于外源基因插入的基因座是胸苷激酶基因座，位于基因组中的Hindlll J片段中。
[0124] 将编码免疫球蛋白融合多肽的多核苷酸的文库插入牛痘病毒载体中形成与转录 控制区的可操作的关联，所述转录控制区在痘病毒感染的细胞的胞质中起作用。
[0125] 痘病毒转录控制区包含启动子和转录终止信号。痘病毒中的基因表达受到时间调 控，并且用于早期、中期和晚期基因的启动子具有不同的结构。特定的痘病毒基因组成型 地表达，并且用于这些"早期-晚期"基因的启动子带有杂合结构。合成的早期-晚期启动 子也已经开发。参见HammondJ.M?等，J.Virol.Methods66:135-8(1997);Charkrabarti S.等，Biotechniques23:1094-7(1997)。对于本文中公开的实施方案，可以使用任何痘病 毒启动子，但基于选定的宿主细胞和/或选择方案，使用早期、晚期或组成型启动子可能是 理想的。在特定的实施方案中，使用组成型启动子。用于本文中所述方法中的合适启动子 是早期/晚期7. 5-kD启动子，或早期/晚期H5启动子（或其变体）。
[0126] 三-分子重组方法。传统上，痘病毒载体，如牛痘病毒，尚未用于从复合文库鉴定 之如未知的目标基因，因为对于牛痕不存在构建和筛选文库的商效率、商效价的广生方法。 牛痘病毒中异源蛋白表达的标准方法涉及体内同源重组和体外直接接合。使用同源重组， 重组病毒的产生效率在大约0. 1%或更低的范围中。尽管使用直接接合的重组病毒产生效 率较高，但所得到的效价相对低。因此，对于蛋白质表达和疫苗研发的目的，牛痘病毒载体 的使用限于之前分离的DNA的克隆。
[0127]如Zauderer，PCT公开No.W000/028016 和美国专利No. 7, 858, 559 中公开的三-分 子重组是一种用于在牛痘病毒中产生文库的高效率、高效价产生方法。使用三-分子重组 方法，本发明人已经实现了以至少90%的效率和高于通过直接接合获得的效价至少2个数 量级的效价来产生重组病毒。
[0128] 在特定的实施方案中，如本文中所述的能够表达免疫球蛋白融合多肽的多核苷酸 的文库可以通过三-分子重组在痘病毒载体（例如，牛痘病毒载体）中构建。
[0129] 在特定的实施方案中，提供了用于产生融合多肽文库的转移质粒，其包含通过与 牛痘病毒H5启动子可操作地关联编码免疫球蛋白重链CH1和牛痘病毒A56R蛋白的至少跨 膜部分的多核苷酸。示例性载体是PJEM1，其包含序列：
[0130] jAATTCCAfCGGATGGAGCTGmTCATCCTCTTCTTGGTilCCIIACAGCmC&Glg?agmCTCCG ftgftTceAiiiiiiiSiiSSsciiiii^iiHiiiiiiiiiSEs&giiiiieiiGasgg ccmmmmmmmwmTcmcmcT^cmsgmE^mmmGccmcmawmm mmmmsmmsmsmmmsmsmmmsBmmMmmmmmmm rni^sMXsmmsmmsxmsmmMsssmms^m^^^&mh ctTmM^mmmmiccmcmcm^^mmmmmTcmssmMxmmsmcMcm. mmm￡mmsms￡mssm^m￡msmmmmsm^msmsmmmssrnm& GACAAGAAAGfTACITCAAC?ACAAATGlCACTGATMtflSTAMnmTGlIKaATACTCCKaGA GTffiAffGTWIAmClGATlSTGmilTCGACTATftGJICMAAlACfAlCTGGlfCfACACAfTClC CGGWIACTAGTTCfAAGAMCCTGMflfAmGAf?TTCTftATfGCTCGfCGGTATTCSI?AfC GCGACfCCGGAACCAATfllCfGATIIATGfAGMGAfCATlClGACACCGTCmCATACACTAGTGA fAGCIffmmCAGTAAGTGCATCmTCTGGAGmfCCACMCAGACGAtiACTCCGGIIACCIIIITTA CreAfMAGAAGAfCAfACAGfTACAGAClCTGTCfCAmClCmCAGfAAGmCATCIITCTGm MTGTCACmCTAAATCAACCACCSATGlfGCGGAfCfffMGATACGTIIC?fGATIIATGAmC AGTIICCIICClACTACfGflSSCGGTAGmCIUICCfCmfTA6CMTTATA?ACCftAGGACTTf6 mGMAfATffGGfaTfACCSCAffllATfWATfGTCGGCCGTSSCmfTTTCTSTATTACAmf TlfllTATATAATAAACGTfCACGfRftATACamACAGAGAftCAMGTCTAG
[0131] 双下划线.-H5启动子
[0132] 单下划线-前导狀
[0133]波浪型下划线.-代表性重链可变区
[0134] 粗下划线一IgGCH1结构域
[0135] 无下划线-牛痘病毒A56R
[0136] 粗斜体-BssHII和BstEII可变基因克隆位点
[0137] 其在本文中称为SEQIDN0:1。各种不同的PCR扩增的重链可变区可以同框地插 入唯一的BssHII和BstEII位点中，其是以上用粗斜体表示的。
[0138] 质粒pJEMl是美国专利No. 7, 858, 559中所述的p7. 5/tk的衍生物。pJEMl保留与 牛痘基因组同源的侧翼区域，其使得能够如美国专利No. 7, 858, 559中所述的进行重组。然 而，替代p7. 5/tk中的表达盒（启动子和表达的序列），pJEMl含有以下元件：
[0139] 牛痘病毒H5启动子
[0140] 前导肽
[0141] 用于克隆可变重链的5'BssHII克隆位点
[0142] 重链可变区
[0143] 用于克隆可变重链的3'BstEII克隆位点
[0144]IgGCH1 结构域
[0145] 牛痘病毒A56R
[0146] 这些元件列于图1和SEQIDN0 :1中。这一盒可以通过合成形成。
[0147] 在另一个实施方案中，本发明的包含通过与牛痘病毒p7. 5启动子可操作地关联 编码免疫球蛋白k轻链多肽的多核苷酸的转移质粒是PVKE，其包含序列：
[0148]GGCCAAAAATTGAAAAACTAGATCTATTTATTGCACGCGGCCGCCCATGGGATGGAGCTGTATCATCCT CTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGCGTGCACTTGACTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGA GGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGC GAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGGTCGAC
[0149] 其在本文中称为SEQIDN0:2。PCR-扩增的k轻链可变区可以同框地插入唯一 的ApaLI)和Xhol位点中，其是以上用粗体表示的。
[0150] 此外，在其中希望在如上所述的选择第一文库的多核苷酸的过程中在质粒载体中 具有第二文库的多核苷酸的那些实施方案中，可以使用pVKE。
[0151] 在另一个实施方案中，本发明的包含通过与牛痘病毒p7. 5启动子可操作地关联 编码免疫球蛋白A轻链多肽的多核苷酸的转移质粒是PVLE，其包含序列：
[0152]GGCCAAAAATTGAAAAACTAGATCTATTTATTGCACGCGGCCGCCCATGGGATGGAGCTGTATCATCCT CTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGC'CiTCCACTTGACTCGAGAAGCTTACCGTCCTACGAACTGTGGCTG CACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAAT AACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT CACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAAC ACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT TAGGTCGAC
[0153] 其在本文中称为SEQIDNO:3。PCR-扩增的入轻链可变区可以同框地插入唯一 的ApaLI和Hindlll位点中，其是以上用粗体表示的。
[0154] 此外，在其中希望在如上所述选择第一文库的多核苷酸的过程中在质粒载体中具 有第二文库的多核苷酸的那些实施方案中，可以使用pVLE。
[0155] 除非另外指出，本发明的实施将使用常规的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、 转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的技术，其在本领域技术范围内。这样的技 术在文献中有详细的解释。参见，例如，MolecularCloningALaboratoryManual(分子 克隆实验室手册），第 2 版，Sambrook等编辑，ColdSpringHarborLaboratoryPress: (1989);MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册），Sambrook等 编辑，ColdSpringsHarborLaboratory，NewYork(1992),DNACloning(DNA克隆），卷I 和II(D.N.Glover编辑，1985) ;01igonucleotideSynthesis(寡核苷酸合成）（M.J.Gait 编辑，1984);1\1111118等，美国专利1^〇:4,683，195;池(316；[04(^(1办131'1(112&1:;[011(核酸杂 交）（B.D.Hames&S.J.Higgins编辑，1984);TranscriptionAndTranslation(转录和翻 译）（B.D.Hames&S.J.Higgins编辑，1984);CultureofAnimalCells(动物细胞的培养） (R.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc. , 1987);ImmobilizedCellsAndEnzymes(固定化细胞 和酶）（IRLPress, 1986) ;B.Perbal，APracticalGuideToMolecularCloning(分子克 隆实用指导）（1984);论文，MethodsInEnzymology(酶学方法）（AcademicPress，Inc.， N.Y. )；GeneTransferVectorsForMammalianCells(用于哺乳动物细胞的基因转移载 体）（J.H.Miller和M.P.Calos编辑，1987，ColdSpringHarborLaboratory);Methods InEnzymology(酶学方法），第 154 和 155 卷，（Wu等编辑），ImmunochemicalMethodsIn CellAndMolecularBiology(细胞和分子生物学中的免疫化学方法）（Mayer和Walker 编辑，AcademicPress,London,1987)；HandbookOfExperimentalImmunology(实 验免疫学手册），卷I_IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，1986);Manipulatingthe MouseEmbryo(操纵小鼠胚胎），(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpring Harbor，N.Y.，1986);和Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生 物学通用实验方案），JohnWileyandSons，Baltimore，Maryland(1989)。
[0156] 抗体工程的一般原理列于AntibodyEngineering(抗体工程），第2版， C.A.K.Borrebaeck编辑，OxfordUniv.Press(1995)中。蛋白质工程的一般原理列于 ProteinEngineering，APracticalApproach(蛋白质工程化，实用方法），Rickwood，D. 等编辑，IRLPressatOxfordUniv.Press，Oxford，Eng. (1995)中。抗体和抗体-半 抗原结合的一般原理列于：Nisonoff，A.，MolecularImmunology(分子免疫学），第2 片反，SinauerAssociates,Sunderland,MA(1984)和Steward，M.W.，Antibodies，Their StructureandFunction(抗体，其结构和功能），ChapmanandHall，NewYork，NY(1984) 中。此外，本领域已知的并且没有特意描述的免疫学中的标准方法通常遵循Current ProtocolsinImmunology(免疫学中的通用实验方案），JohnWiley&Sons，NewYork; Stites等（编辑），BasicandClinical-Immunology(基础和临床-免疫学）（第 8 版），Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)以及Mishell和Shiigi(编辑），Selected MethodsinCellularImmunology(细胞免疫学中的选定方法），W.H.FreemanandCo.，New York(1980)〇
[0157] 给出免疫学一般原理的标准参考著作包括CurrentProtocols inImmunology(免疫学通用实验方案），JohnWiley&Sons，NewYork; Klein,J. ,Immunology:TheScienceofSelf-NonselfDiscrimination(免疫学：自体-非 自体辨别的科学），JohnWiley&Sons，NewYork(1982) ;Kennett，R?等编辑，Monoclonal Antibodies，Hybridoma:ANewDimensioninBiologicalAnalyses(单克隆抗体，杂交 瘤：生物分析中的新维度），PlenumPress，NewYork(1980) ;Campbell，A.，"Monoclonal AntibodyTechnology〃（单克隆抗体技术），在Burden，R?等编辑，LaboratoryTechniques inBiochemistryandMolecularBiology(生物化学和分子生物学中的实验室技术）中， 第 13 卷，Elsevere，Amsterdam(1984)。 实施例
[0158] 实施例1
[0159]CH1-A56R融合蛋白的制备
[0160] 构建重链融合蛋白以帮助重组牛痘病毒细胞表面上表达的特定免疫球蛋白区段 的选择。
[0161] 通过以下方法构建了编码融合蛋白的表达载体，所述融合蛋白包含与来自 WesternReserve牛痘病毒的A56R的胞外和跨膜结构域融合的人CY的重链CH1结构域 (在本文中称为CH1-A56R)以及C35-特异性VH(H2124)。
[0162]pJEMl。构建了包含编码人Y免疫球蛋白恒定区（CH1)、牛痘A56R的片段和用于人 重链可变区（例如，H2124)插入的盒的多核苷酸序列的表达载体，在本文中称为"pJEMl"。 简而言之，通过以下方法，将按照PCT公开No.W000/028016(将其全部按引用并入本文中） 中所述产生的p7. 5/tk转化成pJEMl。
[0163]IgGCH1。使用获自Clontech，PaloAlto,CA的SMART?RACEcDNA扩增试剂盒， 从骨髓RNA分离编码IgG重链的cDNA。使用5'引物huCy1-5B:ATTAGGATCCGGTCACCGTC AGAG3'（SEQIDN0:5)进行PCILPCR产物包含以下元件：BamHI-BstEII-(编码VH的氨基酸 111-113的核苷酸）-(编码Cy1的氨基酸114-478的核苷酸）-TGA-SalI。将该产物在BamHI 和Sail位点亚克隆至pBluescirptll/KS中，并且通过定点诱变除去对应于Cy1的CH1结 构域内的氨基酸191和192的第二BstEII位点而不改变氨基酸序列。用BstEII和Sail消 化质粒pBluescirptll/KS，并且将约1Kb的较小DNA片段凝胶纯化。然后将该较小片段用 作PCR反应中的模板，所述PCR反应使用正向引物CHI(F) -5'-CAAGGGACCCTGGTCACO GTCTCCTCAGCCTCC-3'（SEQIDN0:6)(斜体和下划线的是BstEII限制性位点）和反向引物CH1(R)5'-AACITTCTTGTCCACCTTGGTGITG-3'（SEQIDN0:7)。将所得到的约 320 个碱基对 的PCR产物凝胶纯化。
[0164]全长IgG。使用获自Clontech，PaloAlto,CA的SMART?RACEcDNA扩增试剂盒 从骨髓RNA分离编码人IgG重链的cDNA。使用5'弓丨物huCy1-5B:(SEQIDN0:4)和3' 引物huCyl-3S:(SEQIDN0:5)进行PCR。PCR产物包含以下元件：BamHI-BstEII-(编码 VH的氨基酸111-113的核苷酸）-(编码Cy1的氨基酸114-478的核苷酸）-TGA-SalI。将 该产物在BamHI和Sail位点处亚克隆至pBluescirptll/KS中，并且通过定点诱变除去对 应于Cy1的CH1结构域内的氨基酸191和192的第二BstEII位点而不改变氨基酸序列。 用BstEII和Sail消化质粒pBluescirptll/KS，并且将对应于全长IgGl的933个碱基对的 DNA片段凝胶纯化。
[0165]A56R(较长形式）。使用正向引物A56R(F) 5'-CAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTACATCA ACTACAAATGACACTGATAG-3'（SEQIDN0:8)和反向引物A56R(R) 5'-TATA.GTCOCCTAGA CTTTGirCTCTGTmGTAITTACG-3'（SEQIDN0:9)(斜体和下划线的是Sail限制性位点）从 分离的WesternReserve牛痕病毒DNA扩增编码来自牛痕病毒（WesternReserve)的A56R 血凝素（hemmagglutinin)蛋白的氨基酸108至314的DNA片段，该蛋白包含柄、跨膜和胞 内结构域（Genbank登录号No.YP_233063)。将所得到的约660个碱基对的PCR产物凝胶纯 化。
[0166]A56R(较短形式）。使用正向引物A56R(F2):5'-CAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTACC ACCGATGATGCGGATCTTTATGA-3'（SEQIDN0:21)和反向引物A56R(R)(SEQIDN0:9)从分离 的WesternReserve牛痕病毒DNA扩增编码来自牛痕病毒（WesternReserve)的A56R血 凝素蛋白的氨基酸240至314的DNA片段，该蛋白包含柄、跨膜和胞内结构域（Genbank登 录号No.YP_233063)。将所得到的约263个碱基对的PCR产物凝胶纯化。
[0167]Fab构建体（具有A56R较长形式的IgGCH1)。320和660-碱基对的片段然后使 用用于5'产物的正向引物CH1(F)(SEQIDN0:6)和反向引物CH1(R2) :5'-ACAAAAGTATTGGT AATCGTGTCATAACITTCTTGTCCACCTTGGTGITG-3'（SEQIDN0:22)及用于 3'产物的与A56R(R)(SEQIDN0:9)组合的A56R(F)(SEQIDN0:8)通过SOEPCR结合。这两个产物然后结合以 产生约980个碱基对的融合片段。用BstEII和Sail消化这一片段，并且将所得到的934-碱 基对的片段凝胶纯化。
[0168]TR构建体（具有A56R较短形式的全长IgGl)。使用用于5'产物的正向引物 CH1(F)(SEQIDN0:6)和反向引物A56R(R2) :5'-TCATAAAGATCCGCATCATCGGTGGITTTACCCGG AGACAGGGAGAGGCTC-3'（SEQIDN0:23)及用于 3' 产物的与A56R(R):(SEQIDN0:9)组合 的A56R(F3) :5'-GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAACCACCGATGATGCGGATCTTTATGA-3'（SEQID N0:24)。这两个产物然后结合以产生约1256个碱基对的融合片段。用BstEII和Sail消 化这一片段，并且将所得到的1235-碱基对的片段凝胶纯化。
[0169]FL构建体（具有A56R较长形式的全长IgGl)。993和660-碱基对片段使用用于 5'产物的正向引物CH1(F):(SEQIDN0:6)和反向引物A56R(R3) :5'-TATCAGTGTCAITTGTAG irGATGITTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC-3'（SEQIDN0:25)及用于 3'产物的与A56R(R)(SEQ IDN0:9)组合的A56R(F4) :5'-GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAACATCAACTACAAATGACACTGATA -3'（SEQIDNO: 26)通过SOEPCR结合。这两个产物然后结合以产生约1653-碱基对的融 合片段。用BstEII和Sail消化这一片段，并且将所得到的1632-碱基对的片段凝胶纯化。
[0170] 质粒p7. 5/tk也用BstEII和Sail消化，并且将较大的约5. 7Kb的所得片段凝胶 纯化。然后将这两个BstEII/Sall片段连接以产生pJEMl质粒。
[0171]pJEMl保留与牛痘病毒基因组同源的侧翼序列，这使得能够重组。然而，替代 p7. 5/tk中的表达盒（启动子和表达的序列），pJEMl含有以下元件：牛痘病毒H5启动 子；前导肽；用于克隆可变重链的5'BssHII克隆位点；重链可变区；用于克隆可变重链的 3'BstEII克隆位点；IgGCH1结构域；和牛痘病毒A56R，pJEMl的这些元件的序列显示于图 1 和SEQIDN0:1 中。
[0172] 将对于C35特异性的重链可变区（H2124)插入pJEMl的BssHII和BstEII位点中， 产生VH(H2124)-CH1-A56R融合构建体。pJEMl中制备的VH(H2124)-CH1-A56R融合构建体 的核苷酸和氨基酸序列分别显示如下。
[0173] 编码VH(H2124)-CH1-A56RFab产物融合蛋白的多核苷酸序列（SEQIDN0:10):
[0174]
【权利要求】
1. 一种融合蛋白，其包含（a)包含重链恒定区结构域的第一多肽区段和（b)包含牛痘 胞外包膜病毒（EEV)特异性膜蛋白的跨膜结构域的第二多肽区段。
2. 权利要求1的融合蛋白，进一步包含第三多肽区段，其包含免疫球蛋白重链可变区 或其片段。
3. 权利要求2的融合蛋白，进一步包含用于促进所述融合多肽在EEV表面上表达的信 号肽。
4. 权利要求1的融合蛋白，其中所述牛痘EEV特异性膜蛋白是A56R。
5. 权利要求1的融合蛋白，其中所述第二多肽区段进一步包含EEV特异性膜蛋白的胞 外结构域或其一部分。
6. 权利要求1的融合蛋白，其中所述第二多肽区段进一步包含EEV特异性膜蛋白的胞 内结构域或其一部分。
7. 权利要求1的融合蛋白，其中所述恒定区包含CHl结构域或其一部分。
8. 权利要求1的融合蛋白，其中所述恒定区包含IgG-γ重链。
9. 权利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO: 11的氨基酸215至421。
10. 编码权利要求1的融合蛋白的多核苷酸。
11. 权利要求10的多核苷酸，包含SEQ ID NO: 10的核苷酸，其编码来自Western Reserve牛痘病毒株的A56R的氨基酸108至314或SEQ ID NO: 11的氨基酸215至421。
12. 包含权利要求10的多核苷酸的载体。
13. 包含权利要求10的多核苷酸或权利要求12的载体的重组牛痘病毒。
14. 用权利要求13的重组牛痘病毒感染的宿主细胞。
15. -种重组牛痘文库，其包含在牛痘病毒载体中构建的编码多个免疫球蛋白融合多 肽的第一多核苷酸文库，其中所述牛痘病毒载体包含（a)编码包含重链CHl结构域的第一 多肽区段的第一多核苷酸，（b)编码包含位于所述CHl结构域下游的牛痘病毒EEV特异性 膜蛋白的跨膜结构域的第二多肽区段的第二多核苷酸，和（c)编码位于所述CHl结构域上 游的免疫球蛋白重链可变区或其片段的第三多核苷酸。
16. 权利要求15的第一文库，进一步包含用于促进所述融合多肽在EEV表面上表达的 信号肽。
17. 权利要求15的第一文库，其中所述EEV特异性膜蛋白是A56R。
18. 权利要求15的第一文库，其中所述牛痘EEV特异性膜蛋白是A56R。
19. 权利要求15的第一文库，其中所述第二多肽区段进一步包含EEV特异性膜蛋白的 胞外结构域或其一部分。
20. 权利要求15的第一文库，其中所述第二多肽区段进一步包含EEV特异性膜蛋白的 胞内结构域或其一部分。
21. 权利要求15的第一文库，其中所述恒定区包含CHl结构域或其一部分。
22. 权利要求15的第一文库，其中所述恒定区包含全长IgG。
23. 权利要求1的融合蛋白或权利要求15的第一文库，其中所述第一多肽区段包含SEQ ID NO: 11的氨基酸215至421。
24. 权利要求1的融合蛋白或权利要求15的第一文库，其中所述第二多肽区段包含SEQ ID NO: 11的氨基酸215至421。
25. -种用于选择编码抗原特异性免疫球蛋白重链可变区或其抗原结合片段的方法， 包括： (a) 将权利要求15的编码免疫球蛋白融合蛋白的第一文库引入允许牛痘病毒感染的 宿主细胞群体中； (b) 将一个或多个编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸引入所述宿主细胞群体中， 其中免疫球蛋白融合蛋白能够与免疫球蛋白轻链组合，以形成免疫球蛋白分子的抗原 结合结构域； (c) 允许胞外包膜病毒（EEV)从所述宿主细胞释放； (d) 从上清液收集释放的EEV ; (e) 将释放的EEV接触抗原；和 (f) 回收第一文库的编码在EEV的膜表面上表达并且对于所述抗原具有特异性的免疫 球蛋白融合多肽的多核苷酸。
26. 权利要求25的方法，进一步包括： (g) 将（f)中回收的多核苷酸引入允许牛痘病毒感染的第二宿主细胞群体中； (h) 将一个或多个编码免疫球蛋白轻链的多核苷酸引入所述宿主细胞群体中； (i) 允许胞外包膜病毒（EEV)从所述宿主细胞释放； (j) 从上清液收集释放的EEV ; (k) 将释放的EEV接触抗原；和 (l) 回收第一文库的编码在EEV的膜表面上表达并且对于所述抗原具有特异性的免疫 球蛋白融合多肽的多核苷酸。
27. 权利要求26的方法，进一步包括重复步骤（g) - (1) -次或多次，由此富集所述第一 文库的编码作为特异性结合所述抗原的免疫球蛋白融合多肽的部分的免疫球蛋白重链可 变区或其抗原特异性片段的多核苷酸。
28. 权利要求25的方法，进一步包括分离从所述第一文库回收的多核苷酸。
【文档编号】C12Q1/70GK104520444SQ201380033060
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年4月26日 优先权日:2012年4月26日
【发明者】E·S·史密斯, T·潘迪纳, L·A·克罗伊, M·帕里斯, M·佐德勒, A·莫克萨, R·柯克 申请人:瓦西尼斯公司