品系设计的制作方法

品系设计的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于遗传修饰杂交植物的基因组的方法，其通过将它的染色体或染色体片段的一个或多个替换为一个或多个供体亲本的相应染色体或染色体片段而实施。本发明采用反向育种技术构建一种新型的取代文库和渐渗文库，其可以用于加速的育种和杂交植物校正。这些文库和它们的用途也是本发明的一部分。
【专利说明】品系设计发明领域
[0001]本发明涉及一种用于遗传修饰杂交植物的基因组的方法。它还涉及染色体取代系(substitut1n line)和/或渐渗系(introgress1n line)的文库，以及由此获得的染色体和渐渗系的文库用于加速的植物育种的用途。
[0002]发明背景
[0003]植物育种的目的在于将尽可能多的有利的和有吸引力的性状组合在同一植物基因组中，其目标是获得优良植物品系或品种。由此，植物育种者可以利用在相关作物物种内或在相同种或属的野生(未人工培育的和未驯化的)亲缘内的遗传变异。
[0004]他还可以通过化学、物理或其它方式进行诱变而诱导感兴趣的植物物种的基因组中的遗传变异，并寻找由该诱导的遗传变异所产生的表型变异。
[0005]如果他愿意并能够应用转基因方法，他还可以选择将一个或多个转基因导入作物植物的基因组。这些转基因可以对应于在同一植物物种中或者在能够一起杂交以产生可育后代的植物物种中天然存在的基因、基因簇或基因间序列。这被称为同源基因化(cisgenesis)。或者，它们可以对应于合成基因或来自不能与感兴趣的植物物种天然杂交的有机体(organism)DNA片段,例如来自另一个家系的植物,或是来自不同分类(taxa)的有机体，例如动物、真菌、病毒或细菌。这被称为转基因(transgenesis)。这些DNA序列或者以未发生改变的方式被导入感兴趣的植物物种的基因组，或者它们被以某种方式改变，例如通过诱变或者不诱变的重组技术。
[0006]转基因技术允许研究者将多个DNA构建体组合入同一植物的基因组，并因而堆叠(stack)或形成金字塔式的(pyramid)不同的性状。该方法通过编码这些性状的转基因的组合堆叠/金字塔结构最终可以导致携带多个所选择性状的植物的建立。但是，这样的转基因方法具有若干缺点。
[0007]给定转基因的效果和/或功能性往往强烈地依赖于它被插入在植物基因组中的确切位置。任何经遗传修饰的物质要获得批准用于商业用途和动物和/或人类消费，需要经历非常广泛的监管程序，其是极为昂贵的和耗时的。通常只会对给定基因组中特定转基因插入事件进行授权。多个转基因的堆叠只会使得这个过程更加昂贵、繁琐和复杂。此外，在全球食品市场的重要区域中，转基因食品不被允许用于人类消费。
[0008]不希望生产或销售转基因植物的植物育种者通常会依赖于传统育种技术以便将多个感兴趣的性状组合在一个植物物种中。育种过程包括通过杂交的方式将两个植物的基因组混合的第一步，其中每个植物包括有趣的遗传性状。随后，需要跟踪感兴趣的性状在这两个植物的杂交后代中的存在，其通常基于表型分析和/或基因组测试(例如DNA标记分析、单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)检测、DNA测序等)来完成。
[0009]因为原始植物的整个基因组已经被混合在Fl产物中并在减数分裂过程中被重组，原始亲本植物的各种性状会被打乱，并且它们在杂交的F2后代中分离。然后，育种者希望在单个植物中固定尽可能多的商业上有吸引力的性状，而同时消除尽可能多的不想要的性状。他的目标是建立一个可市场化的、商业上有吸引力的产品，其由于例如各种有趣的表型性状的新组合而在市场上是有竞争力的并且是成功的。
[0010]为了实现该目标，他需要将衍生自亲本植物与供体植物杂交的Fl植物反复与亲本植物回交，并且在每一个世代中针对携带所有或实际上尽可能多的期望性状的个体再次选择。这个过程是非常耗时的，因为通常需要四至六个回交世代和大量的后代群体来获得主要是纯合的并类似于亲本植物的系，并且来自供体植物的一个或多个期望的性状已经渐渗并固定其中。
[0011]某些作物(例如莴苣)具有相对短的生命周期，而其它作物(例如胡萝卜)需要两年来产生种子。因此，在这样的作物中，一个新的商业品种的产生很容易就需要大约8年至大约20年。另外，在选择和随后的回交过程中，几乎所有的存在于供体植物或种质(access1n)的基因组中的遗传变异被丢失了，因为育种者在该供体种质中特异性针对他最初鉴定(主要通过表型)的一个或几个感兴趣的性状进行选择。如果每个随后回交世代的群体大小是有限的(例如由于用于植物的种植空间的有限可用性)，植物育种者将不可避免地无法注意并欣赏由供体种质的基因组贡献的其它潜在有趣的性状。因此，传统育种面对的是存在于例如野生型种质和作物植物的未栽培亲缘中的大量遗传变异开发不足(under-exploitat1n)的问题。
[0012]本发明的一个目的是提供一种用于产生非转基因植物的有效方法，其基因组已被导入选自其它基因组的基因组片段，尤其是完整染色体或其部分。本发明的另一个目的是给传统育种提供一种快速、非转基因替代方案，其中杂交可以带有来自超过两个亲本的基因组贡献被有效地构建，并且其中所述育种过程可以通过代表所期望的来自给定植物物种的尽可能多的遗传变异的工具箱的方式被延续下去。该工具箱包括植物系的集合，所述植物系的每个携带不同子集的染色体或染色体片段，其衍生自一个或多个供体植物。在本申请中，这样的集合也被称为文库。
[0013]反向育种技术，如W003/017753中所描述并要求保护的，允许从杂合的起始植物有效生产纯合植物。该技术依赖于减数分裂重组的部分或完全抑制以允许所述杂合起始植物产生孢子，其中杂合起始植物的亲本染色体没有被重组。因而亲本染色体被全部传递给孢子以及下一代，而没有与姐妹染色单体的交换(cross-over)。在存在和不存在减数分裂重组的减数分裂之间的区别示于图1中。
[0014]从通过减数分裂重组的部分或完全抑制所获得的孢子，可以通过例如孤雄生殖(androgenesis)或孤雌生殖(gynogenesis)操作方案，或通过采用单倍体诱导子系统而再生单倍体植物。这些单倍体植物的基因组随后被加倍。基因组加倍可自发地发生，或通过加入阻断有丝分裂的化学品例如秋水仙碱(colchicine)、黄草消(oryzalin)或氟乐灵(trifluralin)而发生，其导致双单倍体植物(DH植物，DHs)的形成，其能够产生种子。以这种方式，单倍体系被永生化。
[0015]由该方法得到的DHs具有完全纯合的基因组，其由自杂合的起始植物的亲本继承的完整染色体组成，没有发生重组。原始亲本染色体有各种可能的组合，并且不同DH系的数量完全取决于所述植物物种的染色体数目。非整倍体可以在这个阶段发生，因为在减数分裂结束期间的胞质分裂过程中染色单体随机迁移至两个细胞极中的一个。当所得到的孢子或配子是整倍体，即含有该物种基因组典型的单倍体染色体(η)的全部互补体(fullcomplement)时,亲本染色单体有2n个可能的组合。这示于图2A中。
[0016]或者所述DHs恰好对应于所述杂合起始植物的两个亲本之一，或者它们的基因组由第一亲本的一条或多条染色体结合第二亲本的剩余染色体集组成，以达到该种属的完整单倍体染色体数目。这样的DHs是染色体取代系，其中，当与所述杂合起始植物的原始亲本之一比较时，至少一条染色体已被来自另一亲本的完整的相应染色体取代，而未发生交换。完整染色体取代的文库包括能够由给定的杂合起始植物获得的所有染色体取代系，并因此包括来自该杂合植物的两个亲本系的所有可能的染色体组合。
[0017]完整的染色体取代文库可以例如通过减数分裂重组的部分或完全抑制的方式由给定的杂合起始植物直接获得(如在反向育种中)，或者，尤其是当该物种的染色体数目大时，想要获得所有可能的染色体取代系可能需要两轮或连续更多轮的部分或完全抑制减数分裂重组(类似于两轮或连续更多轮的反向育种)。
[0018]在后者的情况下，可以将通过减数分裂重组的部分或完全抑制获得的两个不同的染色体取代系杂交，以产生杂交植物，其中一些染色体以纯合状态存在，而其它染色体以杂合状态存在。在该新的杂交植物中应用减数分裂重组的部分或完全抑制导致额外的染色体取代系的建立。这种在多个步骤中采用减数分裂重组抑制的方式减少了杂合染色体的数量并因此非常显著地增加了获得期望的独特核型(亲本染色体的特定组合)以及获得完整的染色体取代文库的可能性。
[0019]这个概念最好用一个理论例子进行说明，其中采用属于具有10个染色体对的种属的杂合起始植物(例如玉米)。当用减数分裂重组的部分或完全抑制从该起始Fl杂交子产生双单倍体时，染色体向DH的传递通常根据二项式分布发生。获得含有来自杂合起始植物的第一原始亲本的5条非重组亲本染色体和来自杂合起始植物的第二原始亲本的5条非重组亲本染色体的DH系的整体概率比获得含有来自仅一个原始亲本的10条非重组染色体的DH的概率高256倍。这是由以下事实造成的——对于具有10条染色体对的种属——有256种不同的可能性(排列组合)来获得含有来自第一原始亲本的5条非重组亲本染色体和来自第二原始亲本的5条非重组亲本染色体的DH系(例如来自第一亲本的染色体1、
I1、II1、IV和V结合来自第二亲本的染色体V1、VI1、VII1、IX和X是获得包括来自Fl杂交子的每个原始亲本的5条染色体的整倍单倍体基因组的一种可能性；第二种可能性是来自第一亲本的染色体1、II1、IV、V和VI与来自第二亲本的染色体I1、VI1、VII1、IX和X的组合；这样，对于包括来自Fl杂交子的每个原始亲本的5条染色体的整倍单倍体基因组有256种不同的组合是可能的)。
[0020]如果在第一轮反向育种之后还没有获得完整的染色体取代文库，已经获得的染色体取代系的所选择的成对组合可以在第二轮反向育种中用作起始材料以获得剩下的染色体取代系。当将所选择的双单倍体染色体取代系对杂交时，这将导致对于一些染色体是纯合的并对另一些染色体是杂合的后代植物。例如，可以将携带来自第一亲本的染色体1、11、
II1、IV、V和VI和来自第二亲本的染色体VI1、VII1、IX和X的第一DH植物与携带来自第一亲本的染色体1、I1、II1、IV、V、IX和X和来自第二亲本的染色体V1、VII和VIII的第二 DH植物进行杂交。从该杂交得到的后代对于染色体1、I1、II1、IV、V、VII和VIII是纯合的，对于染色体V1、IX和X是杂合的。该方法因而降低了基因组的复杂性，因为所得到的后代(在这个例子中)不是10条杂合染色体，而是仅具有3条杂合染色体，并具有7条纯合染色体。当对这样的后代植物进行反向育种时，其表现就像是只有3个染色体对的植物，因为其它7个染色体对已经以纯合状态被固定。
[0021]当制得几个这些靶向DH组合时，这种方法将大大增加鉴定由该第二轮反向育种得到的DH群体中亲本染色体的所有可能的组合的可能性。因而采用两轮或更多轮连续反向育种可以便利地针对具有大量染色体数量的种属建立完整的染色体取代文库，而无需筛选过大的DH群体。
[0022]本发明人现在设想，通过提供一种用于遗传修饰杂交植物的基因组的方法(其通过将它的染色体或染色体片段中的一个或多个替换为一个或多个供体亲本的相应染色体或染色体片段)，反向育种技术可以用于将来自一个或多个供体植物的有趣的染色体或染色体片段导入优良系或优良杂交植物，该方法包括:
[0023]a)将所述杂交植物的亲本之一与供体亲本之一杂交，以获得第一 Fl群体，允许所述Fl在抑制重组的同时产生孢子，产生所述孢子的双单倍体，以获得染色体取代系的第一群体，
[0024]b)任选地，将所述杂交植物的其它亲本与同一个或另一个供体亲本杂交，以获得第二 Fl群体，允许所述Fl在抑制重组的同时产生孢子，产生所述孢子的双单倍体，以获得染色体取代系的第二群体，以及
[0025]或者:
[0026]Cl)通过选择所述第一或所述第二群体的一个个体并将该个体与另一群体的个体或与所述杂交植物的一个亲本杂交，产生已经获得供体亲本(们)的一个或多个完整染色体的被修饰的杂交植物；
[0027]或者
[0028]c2)通过以下方式产生被修饰的杂交体的群体:
[0029]1.选择所述第一或所述第二群体的一个个体并将该个体与所述杂交植物的相应亲本杂交，以及
[0030]i1.允许由该杂交得到的后代植物(们)产生孢子，同时允许重组发生，以获得已经得到供体亲本的一个或多个染色体片段的孢子群体，并制造其双单倍体，以及
[0031]ii1.将由此获得的双单倍体植物与任选地被修饰的杂交植物的另一亲本杂交，或与另一个纯合系杂交。
[0032]本发明本质上允许针对每个个别染色体育种，同时该植物的基因组的其余部分可以保持未被修饰。以这种方式，通过将其完整的染色体或片段替换为衍生自一个或多个供体植物的相应染色体或染色体片段，优良杂交品种的亲本系能够以非常靶向的形式针对每个个别染色体进行校正。
[0033]如图3中所示，本发明的方法涉及建立染色体取代系的集合和/或渐渗系的集合，本发明中也被称为染色体取代文库和渐渗文库，其中一个或多个供体种质的基因组的部分被固定于来自育种程序的优良亲本系的基因组中。当这些文库足够大时，它们本质上可以携带所述一个或多个供体种质的整个基因组，使得所述一个或多个供体种质中存在的基本上所有的遗传变异被固定于来自育种程序的优良亲本系的基因组中。
[0034]如例如图4中所示，本发明的方法通常能够构建由所选择的基因组片段组成的杂交体，所述基因组片段衍生自超过两个亲本系，即“多亲本杂交体”。这样的“更高级杂交体”(三元杂交体或三杂交体、多杂交体)给植物育种者提供了极大的灵活性和选择性，并且该方法因此允许他通过采用大型渐渗文库作为多功能工具箱并且作为在给定的种或属中遗传变异的几乎取之不尽、用之不竭的源泉进行创作和设计植物基因组。
[0035]供体植物要么属于与亲本系相同的种，要么属于能够与亲本系成功杂交以得到活的并可育的后代的种。如实施例中所示，所述供体植物可以或者是人工培育的品种或亲本(自交)系，或野生型种质，基因库种质，或转基因植物。
[0036]在被子植物中，孢子可以或是小孢子或是大孢子。这两种孢子类型均在花中产生，小孢子发育成雄性配子体(花粉粒)，而大孢子发育成雌性配子体(胚囊)。孢子通常是减数分裂的产物，并且它们通常是单倍体，除非例如在减数分裂过程中发生第一次分裂复原(first divis1n restitut1n)或第二次分裂复原(second divis1n restitut1n)，在这种情况下所述孢子是二倍体。
[0037]取代系(在本申请中也称为“染色体取代系”)是在它的基因组中携带来自另一系或植物的至少一条染色体的系。原始染色体的一个或两个拷贝已被来自另一系或植物的所述染色体的相应的一个或两个拷贝替换。包括其每个携带来自两个亲本源的染色体的不同组合的个别染色体取代系的染色体取代系群体被称为染色体取代文库。完整的染色体取代文库包括亲本染色体的所有可能的组合。
[0038]例如，可以建立来自两个杂交植物的染色体取代系，所述杂交是通过将优良杂交的两个亲本系的每一个与第三植物(“供体植物”)杂交获得的，所述第三植物携带亲本系及其杂交所缺乏的感兴趣的性状。如果已知感兴趣的性状位于供体植物的哪个染色体和/或性状的存在可以通过例如分子标记或可检测的表型的方式鉴定，那么针对两个亲本系的每一个建立特定的染色体取代系是可能的，其在它们的纯合基因组中，除了包含供体植物的一条染色体以外，包含亲本系的所有染色体。
[0039]然后，可以从每个染色体取代文库选择染色体取代系，其携带供体植物的携带所期望的性状的染色体。除了由供体植物所贡献的一条染色体外，这些染色体取代系与亲本系是相同的。除了一个染色体对，这样两个染色体取代系的杂交将准确地重建所述优良杂交植物。与原始优良杂交植物相反，所重建的或校正的杂交植物对于所选择的供体植物的染色体是纯合的，而缺少来自它的两个亲本系的相应染色体。这示于实施例1中。
[0040]或者，可以选择将来自优良杂交植物的仅一个亲本系的染色体拷贝替换为供体植物的相应拷贝。这个策略使得能够通过将一条或更多条染色体取代为其改进的版本而靶向和受控地改进优良杂交植物，而不会转基因性引入外源基因。这示于实施例3中。
[0041]这种方法可以达到更高水平的复杂度，其中通过在优良杂交植物的各亲本和两个不同供体系之间建立染色体取代系来实现。以这种方式，有可能用来自不同起源的染色体取代优良杂交植物的多个染色体，并因此将从不会在自然界中发生的染色体组组合到一起。
[0042]通过应用本发明，可以平行建立多个染色体取代文库，并可以随后将不同文库的个别染色体取代系互相组合，以创作或设计新的遗传组合。因此可以选择来自不同遗传背景的哪些染色体在染色体组中组合到一起，以组成构成该物种的整个基因组的完整染色体组。
[0043]在后基因组时代，定位和正确地鉴定构成农学上重要性状的基础的基因组变异正在变得日益可行。数量性状基因座(Quantitative Trait Loci, QTL)作图、标记开发和基因座测序结合相关研究允许研究者确定导致特定表型性状的基因组信息是由哪个染色体所编码的，并将这种定位缩小至具体的染色体臂，至染色体区域，并且最终至单个基因座和/或在SNPs的情况下，定位至单独核苷酸。
[0044]因此，还可以将上述概括的方法细化至亚染色体水平，并可以具体地建立在它们的基因组中含有来自一个或多个供体植物的一个或多个选定的渐渗片段的植物系和杂交植物，而没有来自供体植物(们)的任何其它基因组贡献。这种方法的优点是巨大的，因为可以有效地将携带期望的遗传材料的基因组片段导入优良杂交植物，而无需早已存在于该优良杂交植物中的性状的复杂分离，这种复杂分离在通过传统育种方式将所述杂交植物与供体植物杂交以导入来自供体植物的期望的遗传材料时会不可避免地发生，在该过程中亲本基因组通常完全混合并重新组合。
[0045]根据本发明，为了将来自供体植物的特定染色体的染色体片段导入两个亲本系的杂交植物，可以首先建立所述亲本系之一的染色体取代系，其中所述染色体之一已被所述供体植物的染色体替换。当该纯合(双单倍体)染色体取代系随后与它所衍生而来的亲本系回交时，所得到的Fl植物对于所有染色体是纯合的，除了已由供体植物所贡献的那条染色体。对于后一染色体，所述Fl植物是杂合的，在它的基因组中携带衍生自亲本系的一个拷贝和衍生自供体植物的一个拷贝。
[0046]然后，当该Fl植物被允许在减数分裂过程中不抑制染色体重组的情况下产生孢子并且从这些孢子建立DH群体时，该DH群体将会组成纯合渐渗文库。对于以杂合状态存在的该条染色体将发生在非姐妹染色单体之间的随机重组，而重组对于全部以纯合状态存在的其它染色体没有可检测的作用。这示于图2B中。
[0047]因为在孢子形成过程中随机发生减数分裂重组，并且一个或多个重组事件可以发生在每个孢子中，因此以这种方式可以产生几乎无限多的不同的DHs。这些个别DHs将会彼此不同并且与原始亲本系在来自供体植物的该条染色体渐渗亲本系基因组的程度上存在不同。
[0048]该渐渗可以由供体植物的单个染色体片段组成，或由供体植物的多个染色体片段组成，取决于产生每个个别配子的减数分裂过程中已经发生的交换事件的数目。渐渗片段的大小可能差别巨大，其范围可能从当两个交换事件发生在彼此紧密临近时的非常小的片段，直至当没有发生交换时的整个染色体。该方法还允许染色体内的顺式-上位相互作用(cis-epistatic interact1n)的作图。
[0049]因此，渐渗系在另一植物的基因组背景中包括来自供体植物的一个或多个染色体片段。包括其每个携带来自供体植物的不同渐渗片段组的个体渐渗系的渐渗系群体被称为渐渗文库。群体大小越大，则渐渗文库变得越完整，但理论上对于任何给定染色体可以有几乎无限多的渐渗系。在本发明的上下文中，渐渗文库是针对每条个体染色体制得的，并且不是随机基因组范围的。这是与在传统植物育种中已知的渐渗文库(例如RIL或NIL群体)的重要区别。因此，本发明的渐渗文库优选包括其中只有一条染色体已经获得供体的一个或多个渐渗片段的系。完整的渐渗文库包括针对每条染色体的一大组的渐渗系。在每个组内，所有其它染色体保持不变，而变异只发生在属于该组的该一条染色体中。
[0050]该方法允许建立与亲本系的基因组几乎相同的植物基因组，但在该基因组中已经以快速、有效并且非转基因的方式导入了来自供体植物的特定染色体片段。通过采用分子标记、基因组测序和/或表型分析，可以在这样的纯合渐渗文库中鉴定个体植物，其基因组包括来自携带感兴趣的性状的供体植物的染色体片段。因此，期望的性状可以被特异性地导入亲本系或优良杂交植物的基因组，而无需转基因方法或耗时和重复的回交。亲本系或杂交植物的基因组通过将基因组的部分用来自另一植物的相应部分替换、保持基因组的其余部分不变，从而在本质上被“校正”。该方法示于实施例4、5和7中。
[0051]本发明提供一种用于遗传修饰杂交植物的基因组的方法，其通过将它的染色体或染色体片段的一个或多个替换为一个或多个供体亲本的相应染色体或染色体片段来实施，所述方法包括:
[0052]a)将所述杂交植物的亲本之一与供体亲本之一杂交，以获得第一 Fl群体，允许所述Fl在抑制重组的情况下产生孢子，产生所述孢子的双单倍体，以获得染色体取代系的第一群体，
[0053]b)任选地，将所述杂交植物的另一亲本与同一个或另一个供体亲本杂交，以获得第二 Fl群体，允许所述Fl在抑制重组的情况下产生孢子，产生所述孢子的双单倍体，以获得染色体取代系的第二群体，以及
[0054]c)通过选择所述第一或所述第二群体的一个个体并将该个体与另一群体的个体或与所述杂交植物的亲本杂交，产生已经获得供体亲本(们)的一个或多个完整染色体的被修饰的杂交植物。
[0055]本发明还提供一种用于遗传修饰杂交植物的基因组的方法，其通过将它的染色体或染色体片段的一个或多个替换为一个或多个供体亲本的相应染色体或染色体片段来实施，所述方法包括:
[0056]a)将所述杂交植物的亲本之一与供体亲本之一杂交，以获得第一 Fl群体，允许所述Fl在抑制重组的同时产生孢子，产生所述孢子的双单倍体，以获得染色体取代系的第一群体，
[0057]b)将所述杂交植物的另一亲本与同一个或另一个供体亲本杂交，以获得第二 Fl群体，允许所述Fl在抑制重组的同时产生孢子，产生所述孢子的双单倍体，以获得染色体取代系的第二群体，以及
[0058]c)通过选择所述第一或所述第二群体的一个个体并将该个体与另一群体的个体或与所述杂交植物的一个亲本杂交，产生已经获得供体亲本(们)的一个或多个完整染色体的被修饰的杂交植物。
[0059]在另一个实施方案中，本发明提供一种用于遗传修饰杂交植物的基因组的方法，其通过将它的染色体或染色体片段的一个或多个替换为一个或多个供体亲本的相应染色体或染色体片段来实施，所述方法包括:
[0060]a)将所述杂交植物的亲本之一与供体亲本之一杂交，以获得第一 Fl群体，允许所述Fl在抑制重组的同时产生孢子，产生所述孢子的双单倍体，以获得染色体取代系的第一群体，
[0061]b)任选地，将所述杂交植物的另一亲本与同一个或另一个供体亲本杂交，以获得第二 Fl群体，允许所述Fl在抑制重组的同时产生孢子，产生所述孢子的双单倍体，以获得染色体取代系的第二群体，以及
[0062]c)通过下述操作产生被修饰的杂交植物的群体:
[0063]1.选择所述第一或所述第二群体的一个个体并将该个体与所述杂交植物的相应亲本杂交，以及
[0064]?.允许由该杂交得到的后代植物(们)产生孢子，同时允许重组发生，以获得已经得到供体亲本的一个或多个染色体片段的孢子群体，并制造其双单倍体，以及
[0065]ii1.将由此获得的双单倍体植物与杂交植物的另一亲本杂交，或与另一个纯合系杂父。
[0066]在又一个实施方案中，本发明提供一种用于遗传修饰杂交植物的基因组的方法，其通过将它的染色体或染色体片段的一个或多个替换为一个或多个供体亲本的相应染色体或染色体片段来实施，所述方法包括:
[0067]a)将所述杂交植物的亲本之一与供体亲本之一杂交，以获得第一 Fl群体，允许所述Fl在抑制重组的同时产生孢子，产生所述孢子的双单倍体，以获得染色体取代系的第一群体，
[0068]b)将所述杂交植物的另一亲本与同一个或另一个供体亲本杂交，以获得第二 Fl群体，允许所述Fl在抑制重组的同时产生孢子，产生所述孢子的双单倍体，以获得染色体取代系的第二群体，以及
[0069]c)通过下述操作产生被修饰的杂交植物的群体:
[0070]1.选择所述第一或所述第二群体的一个个体并将该个体与所述杂交植物的相应亲本杂交，以及
[0071]i1.允许由该杂交得到的后代植物(们)产生孢子，同时允许重组发生，以获得已经得到供体亲本的一个或多个染色体片段的孢子的群体，并制造其双单倍体，以及
[0072]ii1.将由此获得的双单倍体植物与杂交植物的另一亲本杂交，或与另一个纯合系杂父。
[0073]本发明还涉及一种用于遗传修饰杂交植物的基因组的方法，其通过将它的染色体或染色体片段的一个或多个替换为一个或多个供体亲本的相应染色体或染色体片段来实施，所述方法包括:
[0074]a)将所述杂交植物的亲本之一与供体亲本之一杂交，以获得第一 Fl群体，允许所述Fl在抑制重组的同时产生孢子，产生所述孢子的双单倍体，以获得染色体取代系的第一群体，
[0075]b)将所述杂交植物的另一亲本与同一个或另一个供体亲本杂交，以获得第二 Fl群体，允许所述Fl在抑制重组的同时产生孢子，产生所述孢子的双单倍体，以获得染色体取代系的第二群体，以及
[0076]c)通过下述操作产生被修饰的杂交植物的群体:
[0077]1.选择所述第一或所述第二群体的一个个体并将该个体与所述杂交植物的相应亲本杂交，以及
[0078]i1.允许由该杂交得到的后代植物(们)产生孢子，同时允许重组发生，以获得已经得到供体亲本的一个或多个染色体片段的孢子的群体，并制造其双单倍体，以及
[0079]ii1.将由此获得的双单倍体植物与根据步骤b)被修饰的杂交植物的另一亲本杂交，或与另一个纯合系杂交。
[0080]选择所述第一或所述第二群体的一个个体可以以本领域技术人员已知的任何方式完成。例如，可以基于表型特征和/或基于基因组测试(例如通过DNA标记分析、单核苷酸多态性(SNP)检测、DNA测序等)选择所述个体。
[0081]染色体重组的抑制可以通过干扰重组中涉及的一个或多个靶基因来实现。在一个实施方案中，所述一个或多个靶基因参与双链断裂，例如SP011、MER1、MER2、MRE2、MEI4、REC102、REC104、REC114、MEK1/MRE4、REDl、HOPl、RAD50、MREl1、XRS2 或它们的功能性同系物。
[0082]所述一个或多个靶基因还可以参与染色体配对和/或链交换，例如RHD54/TID1、DMCl、SAE3、REDl、H0P1、H0P2、REC8、MER1、MRE2、ZIPl、ZIP2、MEI5、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RPA、SMC3、SCCl、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、S0L0DANCERS、HIM6、CHK2 或它们的功能性同系物。
[0083]所述一个或多个靶基因还可以参与减数分裂重组过程，例如SGS1、MSH4、MSH5、ZIPl和ZIP2或它们的功能性同系物。
[0084]在另一个实施方案中，所述一个或多个靶基因选自由以下基因组成的组:PRD1、PRD2、PRD3、PHSl、NBSl、COMl、MNDl、MER3/RCK、ZIP3、ZIP4、PTD、SHOCl、ZYPl、MLHl、MLH3 或它们的功能性同系物。
[0085]对所述一个或多个靶基因的干扰可以由阻断其转录组成。在一个优选的实施方案中，通过针对靶基因启动子的RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或RNAi分子的方式阻断转录。在另一个优选的实施方案中，通过作用于靶基因启动子的负作用转录因子的表达的方式阻断转录。
[0086]对所述一个或多个靶基因的干扰可以由破坏靶基因mRNA或转录物的稳定性组成，优选通过与靶基因mRNA或转录物互补的核酸分子的方式，其选自以下组成的组:反义RNA、RNAi分子、病毒诱导的基因沉默(VIGS)分子、共抑制子分子、RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或 sgRNA 分子(小向导 RNA，如 Qi et al, 2013, Cell 152:1173-1183 所述的 CRISPRi系统的部分)。
[0087]在又一个实施方案中，对所述一个或多个靶基因的干扰由抑制靶基因表达产物组成，优选通过一个或多个显性失活核酸构建体的表达产物的方式，或优选通过一种或多种化学化合物的方式。
[0088]在另一个实施方案中，任何旨在通过干扰涉及重组的一个或多个靶基因而抑制染色体重组的转基因方法可以涉及诱导型启动子序列的使用。在该方法中，凭借外部因素或处理作用于与转基因核酸序列可操作地连接的启动子序列的活性，这些外部因素或处理可用于诱导和/或调节转基因的时间和/或空间表达模式。所述可诱导型启动子可选自以下启动子组成的组:热诱导型启动子、化学诱导型启动子、类固醇诱导型启动子、醇诱导型启动子或其它启动子。用诱导所述诱导型启动子活性的试剂和/或条件对发生减数分裂性重组的阶段或该阶段不久之前的花序或花蕾进行处理(例如热休克或热处理、特异性化学品、特异性类固醇如地塞米松或醇)激活了所述诱导型启动子，其导致转基因的瞬时表达。
[0089]在另一个实施方案中，对所述一个或多个靶基因的干扰由将一个或多个突变导入所述靶基因组成，优选显性作用突变，导致其生物功能的扰动，并且所述一个或多个突变优选通过以下方式随机导入:一种或多种化学化合物，例如甲磺酸乙酯、亚硝基甲脲、羟胺、二氛基B丫卩定、N-甲基-N-亚硝基狐、N-乙基-N-亚硝基服、N-甲基-N-硝基_亚硝基狐、硫酸二乙酯、吖丙啶、叠氮化钠、福尔马林、乌拉坦、苯酚和环氧乙烷，和/或通过物理方式，例如UV辐射、快中子照射、X射线、Y辐射，和/或通过遗传元件的插入，例如转座子、T-DNA、逆转录病毒元件，和/或将所述一个或多个突变通过同源重组、基于寡核苷酸的诱变、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALENs)或规律成簇的间隔短回文重复(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat,CRISPR)系统的方式特异性导入。
[0090]双单倍体可以由孢子通过以下方式产生:首先通过孤雄生殖的方式，例如小孢子培养或花药培养，通过孤雌生殖的方式，或通过诱导来自由受精事件得到的受精卵缺失母体染色体的方式建立所述孢子的单倍体植物，然后加倍由此获得的单倍体植物的基因组。
[0091]基因组加倍可自发地发生，或其可以通过化学品(例如秋水仙碱、黄草消或氟乐灵)的应用被诱导。这些化学品破坏有丝分裂过程中纺锤体的形成，并通常用于有丝分裂的阻断。
[0092]来自由受精事件得到的合子的母体染色体的缺失可以通过在杂交中将单倍体诱导子系作为雌性来诱导。单倍体诱导子系统已经在各种植物物种进行了描述。在一个实施方案中，所述雌性是不同种属的植物。在种间杂交中，经常观察到亲本之一的基因组的丧失，例如在小麦和珍珠粟之间、在大麦和球莖大麦(Hordeum bulbosum)之间以及在烟草(Nicotiana tabacum)和 Nicotiana africana 之间的杂交中。
[0093]所述雌性植物还可以是包括异源转基因表达盒的转基因植物，所述表达盒包括可操作地连接多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码重组性改变的CENH3、CENPC, MIS12、NDC80或NUF2多肽，并具有相应失活的内源性CENH3、CENPC, MIS12、NDC80或NUF2基因。这个实施方案首先描述于拟南芥(Arabidopsis thaliana) (Maruthachalam Ravi&Simonff.L.Chan ；Haploid plants produced by centromere-mediated genome eliminat1n ；Nature 464 (2010), 615-619 ；US-2011/0083202 ;W02011/044132)，并且其在植物中是可以广泛应用的。
[0094]允许重组发生可以通过不再干扰涉及重组的一个或多个靶基因来实现。当已经通过转基因的方式实现重组的抑制时，允许重组发生可通过从基因组去除由其抑制重组的该转基因，或通过选择在基因组中不存在该转基因来实现。当已经通过诱导型转基因构建体的方式实现重组的抑制时，允许重组发生可通过不再将所述植物暴露给激活驱动所述转基因表达的所述诱导型启动子的外部因素或处理来实现。当已经通过一种或多种化学品的方式实现重组的抑制时，允许重组发生可通过不再应用由其抑制重组的所述一种或多种化学品来实现。
[0095]在一个实施方案中，允许重组以高于平均水平的频率发生。但是，在实践中，彼此紧密临近的多个交换事件的发生是被自然抑制的，使得渐渗片段通常不会非常小。这种现象被称为染色体干扰或交换干扰。
[0096]在减数分裂重组过程中交换事件可以沿着染色体的长度随机发生，在同一个减数分裂过程中多个交换事件可以在同一条染色体中发生。但是，已知在独立交换事件之间发生干扰，使得两个重组事件通常不彼此紧密临近发生。在传统植物育种过程中，这会导致潜在的大型基因组片段的延续(carry-over)，所述片段是不希望的并且可能包括具有负作用的基因，因为在将人工培育系与例如野生型物种杂交之后，它们在遗传上以及在物理上与育种者所选择的期望性状相连锁的。
[0097]通常，当希望保留感兴趣的性状时，这些基因组片段是很难去除的，因为其会要求期望性状的附近发生两个交换事件，而这极其罕见。这个问题被称为“连锁累赘(linkage-drag) ”。
[0098]但是，在减数分裂过程中通过提高重组频率有可能进一步增加可能的交换事件的数目。例如，这可以通过在天然抑制染色体干扰的一个或多个基因中引入突变来实现(例如FANCM)，或通过抑制这些基因的表达来实现，如实施例8中所示。这会导致甚至更大可能数目的不同的纯合渐渗系，因为它允许彼此紧密临近的交换事件发生，并且它增加沿着染色体的交换事件的总数。这具有明显的优点:渐渗片段可以被限制为仅一个或少数基因，并因此可以有效防止连锁累赘。这进一步提高了本发明的方法的效率。
[0099]在一个实施方案中，干扰天然抑制染色体干扰的所述一个或多个基因可以由阻断其转录组成。在一个优选的实施方案中，通过直接针对所述基因启动子的RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或RNAi分子的方式阻断转录。在另一个优选的实施方案中，通过表达作用于靶基因启动子的负作用转录因子的方式阻断转录。
[0100]在另一个实施方案中，干扰天然抑制染色体干扰的所述一个或多个基因可以由破坏靶基因mRNA或转录物的稳定性组成，优选通过与靶基因mRNA或转录物互补的核酸分子的方式，其选自以下分子组成的组:反义RNA、RNAi分子、病毒诱导的基因沉默(VIGS)分子、共抑制子分子、RNA寡核苷酸或DNA寡核苷酸。在又一个实施方案中，干扰天然抑制染色体干扰的所述一个或多个基因可以由抑制靶基因表达产物组成，优选通过一个或多个显性失活核酸构建体的表达产物的方式，或优选通过一种或多种化学化合物的方式。
[0101 ] 在另一个实施方案中，任何旨在干扰天然抑制染色体干扰的一个或多个基因的转基因方法可以涉及诱导型启动子序列的使用。在该方法中，凭借外部因素或处理作用于与转基因核酸序列可操作地连接的启动子序列的活性，这些外部因素或处理可用于诱导和/或调节转基因的时间和/或空间表达模式。所述可诱导型启动子可选自以下启动子组成的组:热诱导型启动子、化学诱导型启动子、类固醇诱导型启动子和醇诱导型启动子。用诱导所述诱导型启动子活性的试剂和/或条件在减数分裂重组发生的阶段或该阶段不久之前处理花序或花蕾(例如热休克或热处理、特异性化学品、特异性类固醇如地塞米松或醇)激活了所述诱导型启动子，其导致转基因的瞬时表达。
[0102]在另一个实施方案中，干扰天然抑制染色体干扰的一个或多个基因由将一个或多个突变导入所述基因组成，导致其生物功能的扰动，并且所述一个或多个突变优选随机导入，其通过一种或多种化学化合物的方式实现，例如甲磺酸乙酯、亚硝基甲脲、羟胺、二氨基口丫唳、N_甲基-N-亚硝基狐、N-乙基-N-亚硝基服、N-甲基-N-硝基_亚硝基狐、硫酸二乙酯、吖丙啶、叠氮化钠、福尔马林、乌拉坦、苯酚和环氧乙烷，和/或通过物理方式实现，例如UV辐射、快中子照射、X射线、Y辐射，和/或通过遗传元件的插入实现，例如转座子、T-DNA、逆转录病毒元件，和/或所述一个或多个突变通过以下方式特异性导入:同源重组、基于寡核苷酸的突变诱导、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALENs)或规律成族的间隔短回文重复(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat,CRISPR)系统。
[0103]本发明还涉及取代系的文库，其由本发明的方法可以获得。优选地，在这样的文库的每一个取代系中，一条染色体衍生自供体植物，并且其它染色体衍生自杂交植物的亲本系O
[0104]此外，本发明涉及渐渗系的文库，其由本发明的方法可以获得。优选地，这样的文库包括一组或多组渐渗系，其中在每组渐渗系中，一条染色体包括衍生自供体植物的一个或多个渐渗片段，并且其它染色体衍生自杂交植物的亲本系。所述文库优选包括针对每条染色体的一组渐渗系。优选地，每组仅在一条染色体方面有变化。这种改变可以是或者通过原始染色体的一个或两个拷贝已被所述供体的染色体替换，或者已经在原始染色体的一个或两个拷贝上替换了一个或多个染色体片段。通过针对作物种属的每条染色体组合这些组，可以构建含有许多可能的变体的完整文库。由于每个系优选仅在一条染色体方面有不同，有效选择仅那些携带期望的染色体或染色体片段的系用于杂交是可能的。因此，不再需要重复回交以去除不期望的供体染色体或染色体片段。文库中的系优选是纯合的。
[0105]因此，本发明还涉及使用这样的文库进行加速的植物育种或杂交植物校正的用途。加速的植物育种包括从文库选择一个或多个系，所述系包括期望的供体染色体或携带期望的供体来源渐渗片段的染色体，并将所选择的系与另一个植物杂交，例如杂交植物的亲本系。杂交植物校正包括被修饰的亲本系的选择，所述被修饰的亲本系包括期望的供体染色体或携带期望的供体来源渐渗片段的染色体，并将所选择的系与杂交植物的另一亲本杂交。在一个实施方案中，所述杂交植物的另一亲本选自取代或渐渗文库。
[0106]上面概述的方法使得研究者或植物育种者能够以非常靶向和有效的方式“校正”亲本系及其所衍生的杂交植物，而不必使得所得到的植物成为转基因的，并且无需许多回交世代。其要求的是，优选大型纯合渐渗系，由其中每个植物包括不同大小的一个或多个随机渐渗片段的植物组成，所述渐渗片段衍生自一个或多个供体植物，可逆地实现减数分裂重组的部分或完全抑制的方式，以及随后允许减数分裂重组再次正常进行的方式。
[0107]采用本发明的方法，建立来自供体植物的染色体或染色体片段已经特异性地渐渗其中的亲本系是可能的，而没有将亲本系和供体植物的整个基因组混合并重组(reshuffling)。因此，可以针对每个个体染色体进行植物育种，而所述植物的其它染色体保持完整、纯合并因而不变。染色体或染色体片段能够以靶向的方式被特异性交换、校正和替换，并且不期望的遗传特征能够从植物基因组去除。
[0108]以本发明的方法平行产生的“校正”过的亲本系可以随后互相杂交，以产生杂交植物，其基因组包括它们的亲本系已经从一个或多个供体植物获得的所述不同渐渗片段。
[0109]故此，有可能例如亲本系之一在其染色体之一上已经获得供体植物的渐渗片段，同时另一亲本系在另一染色体上已经获得同一或另一个供体植物的渐渗片段。然后，这两个亲本系的杂交会导致在两个染色体上带有“校正”的杂交后代植物(或者是全部染色体，或者是特定染色体片段)。这例如实施例4中所示。
[0110]或者，有可能在Fl杂交植物的孢子的形成过程中再次部分或完全抑制减数分裂重组，以建立所述渐渗片段纯合的DHs。在这种情况下，所述渐渗片段在遗传上是被固定的。
[0111]在甚至更高水平的复杂度上，还可以通过将来自同一供体植物和/或来自一个或多个不同的供体植物的额外的染色体片段渐渗至亲本系来继续该过程。以这种方式，通过将来自不同种质(germplasm)的所选择的染色体片段渐渗至优良亲本系，而不混合整个基因组并因而失去已经存在于亲本系中的所有其它期望的性状和基因组特征的组合，可以有效“设计”植物基因组。这个方法允许在植物基因组中有效形成金字塔式性状，而无需重复回交以固定性状，如在传统植物育种的情况下实施的，并且没有使得终产物成为转基因的，如当应用转基因技术时的情况下。
[0112]此外，当应用本发明的方法时，衍生自所述一个或多个供体种质的性状以与它们在供体植物中相同的基因组背景和位置被精确地导入亲本系基因组。这与转基因技术相反，其中转基因的整合位点通常是随机的并且不能进行选择。这样的随机插入可能导致例如亲本系基因组中的内源性基因的破坏，并因此导致额外的不期望的和不可预测的表型作用，并且通常转基因插入的随机性质是转基因技术的严重缺陷。当应用本发明的方法时，所述一个或多个供体植物的染色体片段本质上替换亲本系中的相应染色体片段，从而保持了基因组背景。
[0113]在(纯合)染色体取代文库和(纯合)渐渗文库中，在已知适于生产优良杂交植物的亲本系的基因组背景中，来自任意数目的供体系的遗传变异可以被固定并被充分保持以供将来使用。因此，这个方法解决了存在于传统育种中的重要问题，即在育种过程中留在供体植物(例如野生型种质)的基因组中的大部分天然变异仍然开发不足、被忽视和不被重视的事实，因为育种者必须专注于感兴趣的预先确定的性状，并且在育种过程中，与那些预先确定的性状不是紧密地在遗传上或物理上连锁的其它遗传变异被丢失了。
[0114]这对于仅以纯合状态存在时才导致可检测表型(例如隐性突变)、并会因其它显性等位基因变体的存在而被遮蔽的遗传变异尤其是个问题。纯合染色体取代文库和/或纯合渐渗文库的建立带来一个大型工具箱，其中这样的隐性性状可以在不受来自不同遗传背景的显性等位基因的影响而被评估。如果特定纯合渐渗系表现出建立其的亲本系中不存在的表型，该表型的遗传基础可以追溯至由供体植物已经贡献给植物基因组的渐渗片段之一。在此，没有任何性状会在下一代中丢失或被遮蔽的风险，因为所述渐渗系是完全纯合的DH系，其能够产生种子，并且其通过自交的后代本质上会是克隆。因此，这个方法使得能够以有效得多的方式开发植物物种的基因组，并能够以最佳方式使用种属内或一组相关种属内存在的遗传变异，能够优化属于该种属或相关种属组的商业上感兴趣的植物的遗传特征，例如蔬菜、果树、观赏植物和大田作物。
[0115]当应用本发明的方法时，能够例如在给定的感兴趣种属的个体植物的基因组中鉴定突变或其它遗传特征，例如亲本系，或野生型人工培育的亲缘，或诱变的植物，或转基因植物，并将该突变或遗传特征特异性并非常有效地导入该种属的优良系。
[0116]本发明可以被应用与所有能够被转化的和从其可以制得双单倍体的植物物种。可以对其实施本发明的作物种属包括但不限于烟草、杨树、玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、糖用甜菜、油籽油菜、黑麦草、向日葵、大豆、番茄、黄瓜、小黄瓜、野苣、菠菜、胡椒、矮牵牛、土豆、茄子、甜瓜、西瓜、胡萝卜、萝卜、莴苣、芸苔属蔬菜(甘蓝、花椰菜、西兰花、球茎甘蓝、抱子甘蓝)、韭菜、蚕豆、豌豆、苦苣、菊苣、洋葱、草莓、茴香、菜用甜菜、芹菜、块根芹、芦笋、向日葵、葡萄、木薯、楼桃、苹果、梨、桃、香蕉、郁金香、矮牵牛、玫瑰和菊花(Chrysanthemum)。
[0117]染色体取代系(也称为“取代系”)是在它们的基因组中携带来自另一个系或植物的至少一条染色体的系。来自第一系或植物的原始染色体或染色体们的一个或两个拷贝已被来自另一个系或植物的该染色体或染色体们的相应的一个或两个拷贝替换(取代)。剩下的染色体与原始存在于所述第一系或植物的那些相同。
[0118]在本发明的上下文中，取代系的文库(也称为“染色体取代系的文库”或“染色体取代文库”)是指包括个体染色体取代系的染色体取代系群体，其中每个个体染色体取代系携带来自两个不同亲本来源的完整染色体的不同组合。
[0119]完整的染色体取代文库包括来自两个不同亲本来源的亲本染色体的所有可能的组合。例如，在带有5个染色体对的二倍体种属拟南芥中，染色体取代系的完整文库包括2X=25 = 32个成员(系)。在起始Fl植物中所含有的所有遗传变异存在于该32个植物的小文库中。完整的取代文库允许以前所未有的方式进行上位相互作用检测。代表所有染色体部分的NIL文库将要求几乎无限多的杂交和回交，甚至还远远达不到这种情况。
[0120]渐渗系是在另一个系或植物的基因组背景中包括来自供体系或植物的一个或多个染色体片段的系或植物。第一系或植物在其基因组与供体系或植物的基因组混合，并且来自该供体系或植物的一个或多个染色体片段被渐渗至所述第一系或植物的基因组内的可以变成渐渗系。
[0121]在本发明的上下文中，渐渗系的文库(也称为“渐渗文库”)是指其每个携带来自供体系或植物的不同组渐渗片段的个体渐渗系或植物的群体。在本发明的上下文中，渐渗文库是针对每条个体染色体制得的，并且不是随机基因组范围的。这是与在传统植物育种中已知的渐渗文库的一个重要区别。因此，本发明的渐渗文库优选包括其中只有一条染色体已经获得供体的一个或多个渐渗片段的系或植物。完整的渐渗文库可以包括针对每条染色体的一组渐渗系或植物。在每个组内，所有其它染色体保持不变，并且变异只发生在属于该组的所述一条染色体中。
[0122]纯合渐渗文库由其中每个系含有不同大小的一个或多个随机渐渗片段(优选在一个染色体上)的系组成，其衍生自一个或多个供体系或植物，并且其中所有染色体以完全纯合的状态存在，使得所有遗传信息被遗传性固定。
[0123]在本发明的上下文中，术语“杂交植物校正”是指杂交植物基因组中的至少一个染色体拷贝或染色体片段被来自一个或多个供体系或植物的相应染色体拷贝或染色体片段替换，而不破坏或丧失在杂交植物基因组的剩余部分中存在的性状的特定组合。以这种方式，早已组合在杂交基因组中(并且如果杂交植物被允许与自身或与供体植物进行有性杂交，将在下一代中互相分离)的所有期望的性状保持不变，而杂交植物基因组中的特定缺陷或不期望的或商业上低劣的性状可以通过用另一种(商业上优良的)版本替换它们而被“校正”，而不必使得终产物成为转基因性的。“杂交植物校正”可以例如导致野生型等位基因的导入以替换不想要的突变等位基因，导致优良突变等位基因的导入以替换野生型等位基因，导致转基因的位点特异性导入或消除等。因此，“杂交植物校正”可以例如带来连锁累赘的去除，带来特定突变和/或转基因导入杂交植物基因组，并通常带来杂交植物基因组的微调和进一步改善，而没有丢失早已存在于该杂交植物基因组中的期望性状组合的风险(由于分离)。实际基因组校正优选在杂交有机体的亲本系中进行，使得基因组校正的作用可以在纯合有机体中延续，以方便地在未来研究和育种活动中使用和开发。在实践中，“杂交植物校正”可以例如包括系的选择，所述系包含来自已从杂交植物的第一亲本制得的取代或渐渗文库的期望的供体染色体或携带期望的供体来源渐渗片段的染色体，并将所选择的系与杂交植物的第二亲本杂交，或与从来自已从杂交植物的第二亲本制得的取代或渐渗文库所选择的另一个系杂交。对于建立来自杂交植物的第一和/或第二亲本的取代或渐渗文库，可以采用或者同一供体系或植物或者遗传上不同的供体系或植物。
[0124]尽管已经详细阐述了本发明及其优点，应当理解的是，在此可以进行各种变化、取代和变更而不偏离如所附权利要求中所定义的本发明的精神和范围。
[0125]本发明以下面的实施例进一步阐述，并不以任何方式限定本发明。在这些实施例中，参考以下的图:
[0126]图1:在存在和不存在减数分裂重组的情况下减数分裂的比较，接着DH的生产。图A示出了在存在减数分裂重组的情况下从Fl杂交植物形成DHs中的连续步骤。染色体复制(2η至4η)后，基因组范围的交换事件随机发生(减数分裂重组)，导致由杂交植物的两个亲本系贡献给杂交植物基因组的染色体的重组(reshuffling)。在孢子形成过程中，形成单倍体染色体组(η)，当DHs由这些孢子形成时，它们的基因组随后加倍。最终的结果是RIL样DHs群体(其中这里只显示了两个例子)，其中重组的基因组被遗传固定。另一方面，图B显示了在不存在减数分裂重组的情况下从Fl杂交植物形成DHs中的连续步骤。这两个亲本基因组没有发生重组(reshuffling)，并且孢子含有完整亲本染色体的随机的并通常是新的组合。当DHs由这些孢子形成时，它们的基因组被加倍，并且最终的结果是纯合染色体取代系群体(或纯合染色体取代文库)。该图上只显示了两个例子。为了简单起见，该图只显示了四条染色体，以说明其普遍原理。
[0127]图2:取代和渐渗系的建立。图A显示了来自Fl杂交植物的四个不同染色体取代系的建立(没有显示图1中的步骤；这里只显示了单倍体染色体组，而实际上DHs由这些孢子制得，由此染色体组是加倍的)。当DHs与其所衍生自的杂交植物的亲本系之一杂交时，这导致了染色体取代系，其针对一条染色体是杂合的，但对其它染色体是纯合的。图B示出了这样的染色体取代系是如何用于产生针对一条染色体的渐渗文库。重要的是，减数分裂重组被允许在这个阶段正常进行。此图最终的结果是一个孢子群体，其中每个个体孢子含有杂交植物的第一亲本的基因组，在其染色体之一中带有来自杂交植物的第二亲本的一个或多个渐渗片段。为了简单起见，该图只显示了四条染色体，以说明其普遍原理。
[0128]图3:品系设计。图A示出了本质上用于本发明的方法的植物:杂交植物的两个亲本系，和在本申请中定义为供体植物的第三系(在框中描绘的)。图B显示了亲本系之一是如何与供体植物杂交的，产生Fl杂交植物。在图C中，该Fl杂交植物用于建立纯合染色体取代系，通过在不存在减数分裂重组的情况下从由该Fl杂交植物形成的孢子建立DHs来实现，如图1和2中详细示出的。在图D中，纯合染色体取代系之一——其对应于图A的第一亲本系的“被校正”版本——与图A的第二亲本系杂交。该杂交的Fl对应于图A的杂交植物的被校正版本。对于它的一条染色体，一个拷贝已由供体植物贡献，而不是由第一亲本系贡献。图E显示了另一种方法，其中图B和图C中示出的步骤也对图A的第二亲本系(平行)进行。这样得到了亲本系和(在此情况下)同一供体植物两者的染色体取代系。在图E中，来自不同取代文库的两个纯合染色体取代系互相杂交，以产生图A的杂交植物的校正版本。对于它的染色体之一，两个拷贝均由供体植物贡献，而不是由第一和第二亲本系贡献。可以有许多替代方法，例如其中采用超过一个供体植物，和/或其中图A的两个亲本系在不同染色体中被“校正”(图F)等。如果图D的染色体取代系与图A的第一亲本系杂交(而不是与第二亲本系)，可以实现图2B的情况:第一亲本系的“校正”版本，其中一条染色体的拷贝之一已被由供体植物贡献的染色体拷贝替换。然后，图2B的步骤还可以应用于这种情况:当在这个阶段减数分裂重组被允许以不受抑制的方式进行时，这会导致渐渗文库的建立。然后，该文库的个体DHs可以具有供体植物的对应染色体的一个或多个片段。为了简单起见，该图只显示了四条染色体，以说明其普遍原理。
[0129]图4:在更高水平的复杂度上的品系设计。图A显示了(左侧)来自第一亲本系的纯合染色体取代系，其携带来自第一供体植物的一条染色体，以及(右侧)来自第二亲本系的纯合染色体取代系，其携带来自第二供体植物的一条染色体。当这两个DHs互相杂交时，得到了对应于原始Fl杂交植物的校正版本的F1，所述原始Fl杂交植物可由将第一亲本系与第二亲本系杂交得到。被校正的杂交植物对于它的染色体之一携带由第一供体植物贡献的染色体拷贝，对于它的另外染色体携带由第二供体植物贡献的染色体拷贝。图B中第一和第二亲本系均获得(通过应用本发明的方法)来自第二供体植物的染色体，并且这两个被修饰的亲本系杂交的结果是对于已经由第二供体植物贡献的染色体而言为纯合的杂交植物。图C示出了这个方法是如何用于甚至更高水平的复杂度的，其中杂交植物的每条染色体已由不同植物贡献。图C的杂交植物本质上具有来自不少于六个亲本的基因组贡献(两个亲本系和四个不同的供体植物)，这在采用任何之前已知的方法是不可能以快速并且有效的方式进行的。也可以将该图中所描绘的场景与图2的教导结合起来，以建立带有来自一个或多个供体植物的贡献的渐渗文库。为了简单起见，该图只显示了四条染色体，以说明其普遍原理。
实施例
[0130]实施例1
[0131]拟南芥杂交植物中的染色体替换
[0132]通过将Col-O种质的第一植物(纯合的)与Ler种质的第二植物(纯合的)杂交建立杂交拟南芥植物。对于五条染色体的每一条，使用两个区分性SNP标记物确定该Col-OxLer杂交植物的基因型，以确认其基因组组成。对于五条染色体的每一条，可以检测到两个亲本种质的贡献。
[0133]为了重建该杂交植物并且在其中将该杂交背景中的一个特定染色体的两个拷贝替换为来自第三种质(Cvi)(纯合的)的拷贝，如下应用所要求保护的发明。在该应用的术语中，Col-O和Ler植物是亲本系，Cvi植物是供体亲本，参见例如图3A。
[0134]在第一步中，采用农杆菌介导(Agrobacterium-mediated)的转化(Clough&Bent, 1998 ；Plant J 16:735-743)，将靶向拟南芥的 DMCl 基因(Wijnker etal, 2012 ；Nature Genetics 44:467-470)的 RNAi 构建体导入 Col-O 和 Ler 植物的基因组。从每个种质选择以杂合单拷贝状态(半合子)携带该转基因构建体的TO植物。分子生物学分析和DNA测序显示出该转基因被插入在所选择的Col-O植物中的染色体II内，以及所选择的Ler植物中的染色体IV内。该转基因以显性方式在孢子体水平起作用，使得减数分裂重组在孢子形成过程中在携带该转基因的至少一个拷贝的植物中受到抑制。
[0135]随后，分别对Col-O和Ler种质建立两个染色体取代文库:在Col-O和Ler植物的基因组中，一条或多条染色体用来自Cvi供体种质的基因组的相应染色体或多条染色体替换。这是通过首先(平行)将转基因的Col-OTO植物与Cvi植物杂交以及将转基因的LerTO植物与Cvi植物杂交，并在不存在减数分裂重组的情况下使所得到的杂交植物形成孢子而实现的。为了这个目的，选择在它们的基因组中携带针对DMCl的RNAi构建体的后代植物，即已经继承了携带该转基因的Col-O或Ler染色体拷贝的植物。因为原始的转基因性Col-O和Ler植物对于该转基因是半合子，获得的Col-Ox Cvi和Ler x Cvi后代也缺乏该转基因，但是在该实施例中只选择具有该转基因的后代植物，以抑制在孢子形成过程中的减数分裂重组。
[0136]转基因的存在抑制了减数分裂重组，使得所选择的Col-Ox Cvi和Ler x Cvi杂交植物产生，其中亲本染色体并未重组的小孢子。相反，两个亲本系的染色体已经全部以随机组合的方式被传递给小孢子。
[0137]通过着丝粒介导的基因组消除(Ravi and Chan, 2010 ；Nature 464，615-619 ;美国专利申请号20110083202 ;W02011044132)、随后基因组加倍的方式产生来自每个选择的杂交植物的单倍体。或者，也可以采用从孢子再生单倍体植物的其它方法，例如孤雌生殖、或小孢子或花药培养操作。
[0138]因此，通过在杂交植物的小孢子形成过程中抑制重组，建立了两个DH植物群体。这些群体的个别DH植物的基因组在一种情况下由完整的、未重组的Col-O和Cvi染色体的组合组成，在另一种情况下由完整的、未重组的Ler和Cvi染色体的组合组成。只选择带有正确单倍体染色体数量(对于拟南芥η = 5)的孢子，而非整倍体孢子被排除在该实验的进一步步骤之外。可以例如通过流式细胞术的方式，或通过肉眼选择具有与该种属的正常孢子大小相应大小的孢子而从形态学上鉴定均衡的孢子，其意味着在孢子形成过程中所有染色体的平等分配。
[0139]通过能够在构成每个DH的不同种质之间进行区分的分子标记的方式，检查每个DH的基因组组成，以在每个个体DH植物中鉴定五条染色体中每一条的起源。以该方式选择两个DH植物:
[0140]一携带Cvi的染色体I结合剩下的来自Col-O的4条染色体的第一植物；
[0141]一携带Cvi的染色体I结合剩下的来自Ler的4条染色体的第二植物。
[0142]随后，将所选择的这两个植物互相杂交，得到杂交后代植物，其对于染色体I1、II1、IV和V是杂合的(即对于这四条，染色体中的每一条携带来自Col-O的一个拷贝和来自Ler的一个拷贝)，但对于染色体I是纯合的。后一染色体起源于Cvi种质,如可以通过分子标记的方式确认的。这些杂交后代植物还携带两个拷贝的RNAi转基因(一个在Col-O的染色体II上，另一个在来自Ler的染色体IV上；这两个转基因在杂交植物中以杂合子的状态存在)。本实施例的结果对应于图3的小图E。
[0143]实施例2
[0144]拟南芥杂交植物中的染色体替换，得到非转基因终产物
[0145]在实施例1中，所得到的杂交后代在本质上是转基因的(导致被监管的GMO状态以及由靶向DMCl的RNAi构建体存在带来的额外的表型困难，其例如由于非整倍体的出现导致部分不育，这种非整倍体由在孢子形成过程中减数分裂重组的抑制造成的)。
[0146]在本实施例中，通过在选择以下两个DH植物之后，在该操作中包括额外的实验步骤，该问题得到克服:
[0147]一携带Cvi的染色体I结合剩下的来自Col-O的4条染色体的第一植物；
[0148]一携带Cvi的染色体I结合剩下的来自Ler的4条染色体的第二植物。
[0149]将所述第一植物与野生型的非转基因Col-O植物(回)交一次，所述第二植物与野生型的非转基因Ler植物(回)交一次。由于DMClRNAi构建体的显性性质，在由这些回交所得到的杂交植物产生的孢子中发生减数分裂重组的抑制。由Fl植物产生的整倍体(均衡)小孢子产生DHs，并且用分子标记筛选DHs，以鉴定它们的五个纯合子染色体对中每一个的起源，如实施例1中所述。
[0150]在这个阶段，不仅排除非整倍体个体，而且排除携带靶向DMCl的RNAi构建体的个体。在由Col-Ox Cvi杂交植物得到的DH植物中，只选择那些携带Col-O染色体II的野生型拷贝(没有转基因)、并且存在来自Cvi的染色体I的个体，在由Ler x Cvi杂交植物得到的DH植物中应用类似的选择策略。这种选择确保所选择的DH植物是非转基因的，并且在这些所选择的植物中减数分裂期间减数分裂重组不被打断地进行。
[0151]该选择的结果是携带Cvi的染色体I结合剩下的来自Col-O的4条染色体的非转基因DH植物，和携带Cvi的染色体I结合剩下的来自Ler的4条染色体的非转基因DH植物。
[0152]随后，将所选择的这两个植物互相杂交，得到杂交后代植物，其对于染色体I1、
II1、IV和V是杂合的(即对于这四条染色体中的每一条携带来自Col-O的一个拷贝和来自Ler的一个拷贝)，但对于染色体I是纯合的。后一条染色体起源于Cvi种质，如可以通过分子标记的方式确认的。
[0153]因此，这个步骤允许快速并有效替换杂交植物背景中的染色体I，而不影响其它染色体的完整性，并且并不使得所得到的杂交植物是转基因的。它不要求多轮回交，每条染色体是完整传递的，不发生重组。该方法例如在以下情况中是有用的，其中在原本合适的杂交植物的一条染色体上存在一个或多个不想要的性状，并且已经在另一植物、种质或野生近缘中鉴定到优异的染色体。然后，这个优异的染色体可以用于替换所述杂交植物背景中该染色体的两个拷贝，而不改变其遗传组成的其余部分。
[0154]实施例3
[0155]拟南芥杂交植物中一个染色体拷贝的替换
[0156]在同一实验中，建立在其基因组内仅含有来自Cvi的一个拷贝的染色体I的Col-Ox Ler杂交植物。这是通过选择起源于Col-O的染色体取代文库的DH植物实现的(如实施例1中所述)，其基因组包括来自Cvi的染色体I和来自Col-O的所有其它染色体，并且其(与实施例1和2中所选择的植物相反)在染色体II上缺乏DMCl转基因。
[0157]随后，将该植物与野生型Ler植物杂交，以产生杂交后代。这些后代植物对于染色体I1、II1、IV和V是完全杂交的(即除了这些染色体的每一条的一个Ler拷贝外，它们的基因组还包括这些染色体的每一条的一个Col-O拷贝)，但是其含有染色体I的一个Ler拷贝和染色体I的一个Cvi拷贝，但没有该染色体的Col-O拷贝。因此，以这种方式，该Col-OxLer杂交植物已经被“校正”了，使得染色体I的Col-O拷贝已经特异性地被该染色体的Cvi版本替换了，而不影响该杂交植物的基因组的其余部分。本实施例对应于图3的小图D。
[0158]可以想象许多情况，其中这将是有吸引力的策略，例如当杂交背景中的一个拷贝的特定染色体包括显性突变时，所述突变在原本完美的杂交植物中造成不想要的表型。它还可以通过将携带转基因的染色体替换为另一(非转基因)拷贝而用于从杂交植物中去除转基因。
[0159]实施例4
[0160]染色体片段向拟南芥杂交植物中的渐渗
[0161]在同一实验中，进行第四种方法:建立在Col-O背景中针对来自Cvi的染色体I和在Ler背景针对来自Cvi的染色体II的渐渗文库。第一步是建立针对Col-Ox Cvi和针对Ler X Cvi的染色体取代文库,如实施例1中所述。
[0162]从Col-Ox Cvi染色体取代文库中选择非转基因的DH植物(缺乏RNAi转基因)，其基因组由来自Cvi的染色体I和来自Col-O的其它四条染色体组成(该DH植物早已在实施例3中被选择到)。从Ler x Cvi染色体取代文库中选择非转基因的DH植物(缺乏RNAi转基因)，其基因组由来自Cvi的染色体II和来自Ler的其它四条染色体组成。
[0163]随后，将所选择的植物与它们的亲本种质之一回交(即前者是与野生型Col-Ο，后者是与野生型Ler)，与图2的示意图类似。由这些回交得到的非转基因Fl植物是:
[0164]— Col-Ox Cvi的情况下:对于染色体I是杂合的(来自Col-O的一个拷贝和来自Cvi的一个拷贝)，对于染色体I1、II1、IV和V是纯合的(Col-0)。
[0165]— Ler x Cvi的情况下:对于染色体II是杂合的(来自Ler的一个拷贝和来自Cvi的一个拷贝)，对于染色体I1、II1、IV和V是纯合的(Ler)。
[0166]使这些Fl植物形成孢子，而不干扰减数分裂重组，因为靶向DMCl的RNAi构建体没有存在于它们的基因组中。在孢子形成过程中，在整个基因组发生交换事件，但由于五条染色体中的四条是以纯合子状态存在的，仅在以杂合子状态存在的该一条染色体上有可检测到的重组作用:在Col-Ox Cvi的情况下是染色体I,在Ler x Cvi的情况下是染色体II。
[0167]对于所述一条杂合子染色体，在孢子的每一个中随机发生重组，使得由Fl植物产生的孢子群体中的个体孢子们互相之间仅在该一条染色体的组成中存在区别。在某些情况下没有发生重组，而在其它情况下在该染色体中发生一个或多个交换事件。
[0168]随后，这些孢子用于DH生产，如实施例1中所述。如同通常对于所有DHs的情况一样，所得到的DHs是完全纯合的，并且它们的基因组是固定的。对于它们五条染色体中的四条，这些DHs是彼此相同的，但不同在于Cvi片段渐渗至剩下一条染色体的程度。由该实验得到的DHs群体代表了一条染色体的渐渗文库。
[0169]该群体越大，可用于育种中的研究和应用的渐渗区段的变异越大。采用能够区分这三个亲本拟南芥种质的分子标记来详细检查来自该渐渗文库的个体DHs。该分析确认了可以鉴定到在来自Col-O和Cvi的染色体I之间已经发生了重组(而染色体I1、II1、IV和V完全衍生自Col-Ο)的个体植物，并且可以鉴定到在来自Ler和Cvi的染色体I之间已经发生了重组(而染色体1、II1、IV和V完全衍生自Ler)的个体植物。
[0170]因此，该分析证实了染色体I (在前者的情况下)和染色体II (在后者的情况下)携带衍生自来自Cvi的相应染色体的一个或多个片段，而在该操作过程中其它染色体仍然保持不变。
[0171]随后，将以这种方式获得的选中的DHs相互杂交，得到了带有“校正过”的染色体I和II的Col-Ox Ler杂交植物的建立。除了染色体I和II上特异性染色体片段的替换外，它们与原始Col-Ox Ler杂交植物是相同的。这些区域分别起源自Col-O和Cvi以及起源自Ler和Cvi,而杂交植物基因组的其余部分由来自Col-O和Ler的同等贡献组成。
[0172]在实践中，该方法可以用于例如替换原本合适的杂交植物的亲本系中的“次优的”染色体片段，或引入能够进一步改善杂交植物的染色体片段(含有特定等位基因变异或转基因的片段)。
[0173]该方法的一大优点是其实施的速度，例如当与传统育种相比时。重要的是，当试图采用本领域已知的传统育种方法建立渐渗系时，这将首先导致对所有五条染色体的渐渗事件。这样将需要与原始亲本系回交至少六代以从基因组中“纯化掉”尽可能多的不期望的渐渗片段，而每次选择期望的渐渗片段的存在。
[0174]因此，在本实施例中，可以从将Col-O植物与Cvi植物杂交开始，并允许该杂交的Fl后代在存在重组的情况下产生孢子，并自体受精(self-fertilise)。随后，在该杂交的F2代中，可以筛选在它们的基因组中携带期望的、衍生自Cvi基因组的渐渗片段的个体，并将这些个体与Col-O回交。该常规操作可以至少再重复五次，或直到基因组范围内的标记分析显示所选择的植物的基因组主要衍生自Col-Ο，而仅所期望的来自Cvi的渐渗片段存在于它们的基因组中。同样的常规操作可能需要平行地对Ler X Cvi组合完成。最终可以例如获得在一条染色体上带有衍生自Cvi的一个或多个特定渐渗片段的Col-O植物，以及带有衍生自Cvi的一个或多个特定渐渗片段(在这种情况下在另一条染色体上)的Ler植物。最后，可以将所选择的这两个植物互相杂交，以获得在其基因组中带有来自Cvi的特定贡献的Col X Ler Fl杂交植物。
[0175]当将这种传统方法所需的时间与采用本发明的方法获得该结果所需的时间相比较时，很明显，后者更为高效和快捷。上述(实施例4)概括的实验要求以下步骤:
[0176]一平行生产两个染色体取代文库，其通过用合适的用于抑制减数分裂重组的转基因构建体转化，杂交(一代)，以及DH步骤来进行；
[0177]一从所述取代文库中选择合适的个体，
[0178]一一个回交世代，接着进行DH步骤，以及
[0179]一选择，以及将所选择的系杂交。
[0180]因此，该处理比在传统育种方法中所需要的初始杂交再接着六个或更多的回交世代、合适系的选择以及另一个杂交以获得杂交植物(从种子到种子总共至少八个世代)要快得多。
[0181]取决于在给定种属中转化和DH生产可供利用的操作步骤的速度和效率，本发明的方法可以非常迅速，因为不必总是在杂交之后等待种子产生，而是仅仅等待要用于DH生产的孢子产生即可。尤其是当有非常有效的DH操作步骤可供利用时(例如单倍体诱导子系统)，本发明的方法可以非常迅速。
[0182]除了速度外，本发明的方法的另一个明显的优点是供体植物的基因组贡献可以被固定并在染色体取代和/或渐渗文库中以纯合的形式长期存在这一事实，这使得它们在亲本系的基因组背景中以稳定的方式保持可用，其中它们可以被用于育种中的未来筛选和开发。它还是现有技术的显著改善，渐渗文库可以基于每个个体染色体进行制备，而这是采用传统育种方法不可能完成的。
[0183]实施例5
[0184]在玉米中转基因的特定传递，同时保持该转基因的确切插入位置
[0185]在本实施例中，转基因被引入优良玉米系，而不直接将其转化入该系。首先，该转基因被引入可容易转化的玉米系，并且可以选择许多独立转基因事件中最好的事件用于传递入优良玉米系。在此保持该转基因的确切的基因组插入位置。
[0186]通过农杆菌介导的转化、米用Ishida et al (Nature Protocols 2,1614-1621;2007)所述的操作步骤获得A188基因型的经遗传修饰的玉米植物。该实验中所使用的转基因是带有核定位信号的、可操作连接至强泛素启动子的GFP标记(绿色荧光蛋白)。该构建体能够在整个转化的玉米植物中高水平表达GFP，其由于荧光GFP蛋白在细胞核内的积累而易于检测到。
[0187]从在该实验中所获得的转化的A188玉米植物中选择一个个体，其在其基因组中染色体VIII上含有该转基因的单一拷贝。在第一步中，将该选中的转基因系与优良系B73杂交，其在其基因组中含有靶向DMCl基因的RNAi构建体(也在染色体VIII上，单拷贝插入，半合子)。后者的转基因以显性形式起作用，使得在孢子形成过程中的减数分裂重组在所得到的杂交后代中被抑制。
[0188]从该杂交的Fl后代植物收集小孢子，并且采用本领域技术人员已知的方法将它们用于DH生产。
[0189]从所得到的相应于染色体取代系的DH植物中选择这样一个个体，其具有来自B73的所有染色体，但染色体VIII除外，后者衍生自A188。将该植物与缺乏靶向DMCl的RNAi构建体的野生型B73植物回交，以产生对于染色体VIII为杂合(一个拷贝衍生自B73，另一个拷贝衍生自A188，携带GFP转基因)、但其它九条染色体则完全对应于野生型B73的后代植物(玉米的η = 10)。
[0190]在不存在靶向DMCl的RNAi构建体的情况下，允许在这些后代植物中的孢子形成过程中发生减数分裂重组。它们的孢子被用于产生DH植物(如上所述)，并且在这些DHs中，除了染色体VI11外所有染色体完全衍生自Β73背景，而染色体VI11本质上衍生自Β73，具有来自Α188系的随机渐渗片段。
[0191]可以从这个DH群体中选择纯合的个体，其只在染色体VIII上含有相对小片段的A188DNA，并且仍然具有GFP转基因(其在分子标记的帮助下可以很容易地被检测)。以这种方式，该转基因被有效地从Α188玉米植物传递给Β73优良系，而不必用该构建体直接转化Β73，并且不必将Β73的基因组与Α188的基因组混合。这将不可避免地需要与Β73的多轮回交以获得再次非常类似Β73的后代植物。
[0192]该方法允许在可容易地转化的Α188背景中大规模生产转基因系，以及选择最好的转基因插入事件，其随后在与Α188中确切相同的基因组位置被传递入Β73，而所述Β73是非常不容易转化的。
[0193]很明显的是，该方法还可以用于其它转基因，例如赋予对除草剂或食草动物抗性、赋予疾病抗性或对不良条件的更高耐受性、提供更高产率等的转基因。
[0194]相似地，采用该方法，还可以从转基因植物的基因组去除转基因，而不影响其基因组其余部分的组成。含有转基因的染色体区域或整个染色体因而被来自另一个系的相应野生型片段替换。非常特异性地，一条染色体可以独立于基因组的其余部分而被“校正”，并且该校正通常需要完整染色体或染色体片段的替换。
[0195]实施例6
[0196]玉米中杂种优势的高效育种
[0197]杂种优势效应可以显著提高杂交植物的产率。它们通过由亲本系杂交得到的Fl杂交植物而具有两个亲本系的表型优异表现。尽管杂种优势的分子或遗传本质仍然未知，实证研究已经在作物中提供了宝贵信息。例如在玉米中，基于谱系信息或分子标记分析，例如 SSR(Simple Sequence Repeat,简单序列重复)或 SNP(Single NucleotidePolymorphism,单核苷酸多态性)标记，已经鉴定了各种杂交优势组。这样的杂种优势群组的例子是 Flint、Lancaster> Stiff Stalk 以及 1dent (Van Inghelandt et al, 2010 ；Theor.Appl.Genet.120:1289-1299) > 或 Dent (Zea mays indentata)、Flint (Zea maysindurata)和 Sweet (Zea mays rugosa or Zea mays saccharata)。每个杂种优势组包括互相之间具有一定程度的遗传相似性的若干近交系。为了在下一代中得到杂种优势效应，通常需要将来自不同杂交优势组的近交系互相杂交。
[0198]通常而言，表现出杂种优势的新的玉米杂交植物的建立包括两个不同杂种优势组的亲本系的改进，以及那些亲本系的随后杂交以获得Fl杂交种子。亲本系的改进涵盖传统植物育种和/或转基因或同源基因化(cisgenesis)，并且在每个杂交植物中，来自仅两个杂种优势组的基因组贡献可以汇聚在一起。
[0199]但是，当应用本发明的方法时，可以将两个以上的杂种优势群组汇聚在单个杂交植物中。所需要的是给群组的杂种优势本质作出贡献的染色体区域上的信息，以使得来自一个杂种优势群组的近交系的这些区域可以被特异性地传递入来自另一个杂种优势群组的近交系的基因组。这与实施例5中所述的方法相似，其中采用的是染色体取代和/或渐渗文库。
[0200]以这种方式，来自第一杂种优势群组的近交系专门被改进以便也含有来自第二杂种优势群组的杂种优势基因组区域。在下一步中，该改进的近交系可以与来自第三个杂种优势群组的近交系杂交，其可能本身也已经采用本发明的方法被改进了，以含有来自超过一个杂种优势群组的基因组材料。因而杂种优势的遗传基础以顺势和/或反式的形式被汇聚在同一染色体组中。该方法的结果是一次建立携带不是两个、而是三个或甚至更多个杂交优势群组的遗传材料的杂交玉米植物。这给在玉米中提高例如杂交植物产率提供了强大的、新的可能性。
[0201]实施例7
[0202]将病毒抗性特异性传递入杂交甜瓜
[0203]瓜类黄矮失调病毒(CucurbitYellow Stunting Disorder Virus,CYSDV)是一种由粉風(whitefly, Bemisia tabaci)传播的纺锤病毒(closterovirus),其影响瓜类作物如甜瓜(Cucumis melo)。已经在来自津巴布韦的甜瓜种质TGR-1551中鉴定到赋予对该病毒的抗性的遗传性状(Lopez-Sese and Gomez-Guillamon, 2000 ；Hort.Sc1.35:110-113)。该实施例解释了——通过本发明的方式——这种显性单基因抗性性状是如何被有效传递给优良甜瓜杂交品种，而无需许多次回交世代。
[0204]在第一步中，采用由Guis等,2000 (Sc1.Hort.8:91-99)开发的用于哈密瓜(Cantaloupe melons)的改良转化操作步骤，将靶向甜瓜的DMCl基因的RNAi构建体导入优良杂交甜瓜的父本系的基因组。选择以杂合单拷贝状态(半合子)携带该转基因构建体的TO甜瓜植物。优良杂交甜瓜的父本系和母本系的互补对可以例如由本领域技术人员通过应用反向育种(Reverse Breeding),采用优良甜瓜杂交植物作物杂合起始有机体而获得,如W003/017753中所述和要求保护的。
[0205]将转基因父本系与在其基因组中携带赋予对CYSDV抗性的遗传性状的甜瓜种质TGR-1551 一起生长。随后，将转基因甜瓜植物与种质TGR-1551杂交，并且使所得到的杂交后代植物——选择为在它们的基因组中携带针对DMCl的RNAi构建体——在不存在减数分裂重组的情况下形成孢子。由这些Fl植物形成的孢子包括两个亲本系的完整染色体的随机组合，因为在它们的形成过程中没有发生减数分裂重组。
[0206]通过孤雌生殖的方式，如例如Malik等，2011年所述(Hort.Sc1.38:27-34)，以及随后的染色体加倍(Lim&Earle, 2009 ;Plant Cell, Tissue&Organ Culture 98:351-356),由Fl植物产生的大孢子再生成为双单倍体(DH)小植株。
[0207]以这种方式获得的DH群体的个体DH植物的基因组由完整的、未重组的来自两个亲本系的染色体的组合组成。只选择带有正确单倍体染色体数量(η = 12)的小植株，并且在该实验的进一步步骤中排除非整倍体个体。在这个阶段还将携带具有RNAi构建体的染色体拷贝的DHs排除掉。
[0208]通过能够在两个亲本系的每一条染色体(每个DH的基因组由其组成)之间进行区分的分子标记的方式，检查每个DH的基因组组成，以鉴定每个个体DH植物中12条染色体中的每一条的来源。选择在它们的基因组中携带来自TGR-1551、其上具有CYSDV抗性性状的染色体的DH植物，其可以通过本领域技术人员已知的抗性分析的方式凭经验检测，并且其余十一条染色体表现出与优良杂交甜瓜的父本系相同的分子标记模式，并缺乏靶向DMCl的RNAi构建体。这样的植物是完全纯合的染色体取代系，其中携带CYSDV抗性性状的来自TGR-1551的一条染色体与来自优良杂交甜瓜的父本系的11条染色体组合，形成完整的基因组互补体(genomic complement)。
[0209]原则上，这些选中的系(其显示对CYSDV的抗性，可以采用本领域技术人员已知的抗性测试进行实验性确认)已经可以通过将其与合适的母本系杂交而用于构建CYSDV抗性杂交植物。但是，因为“被校正”的父本系的一条染色体完全衍生自TGR-1551，这只会导致优良甜瓜杂交品种的不完全重建。为了克服该问题并且为了能够完成几乎完美的杂交重建，在该实验的下一步中产生渐渗文库，以限制TGR-1551系的基因组对于包含该抗性性状的染色体片段的贡献。
[0210]为此目的，随后将所选择的DH植物与优良杂交甜瓜的父本系回交。因为所述父本系是几乎完全纯合的(为纯系)，从该杂交得到的Fl后代中12条染色体有11条事实上以纯合的状态存在，因为所述DH植物是完全纯合的，并具有来自所述父本系的12条染色体中的11条。对于剩下的一条染色体，在该杂交的Fl后代中存在衍生自TGR-1551系、携带CYSDV抗性性状的一个拷贝，以及衍生自所述父本系的一个拷贝。
[0211]在这些Fl植物的孢子形成过程中的减数分裂重组特异性地导致该条染色体的两个拷贝之间的随机交换事件。所述Fl植物被允许形成孢子，并通过孤雌生殖的方式，从由这些后代植物产生的大孢子建立另一个DH群体。在优良杂交甜瓜的父本系的遗传背景中，针对携带来自TGR-1551系的CYSDV抗性性状的染色体，这些DH植物有效地构成了非转基因的渐渗文库。剩下的11条染色体大致保持不变，这样在该渐渗文库中的个体DHs之间的唯一主要区别在于衍生自TGR-1551的染色体拷贝的渐渗片段进入到衍生自优良杂交甜瓜的父本系的染色体拷贝中的数目、大小和位置。
[0212]通过病毒抗性测试和分子标记的方式，鉴定在其基因组中携带来自TGR-1551、包括CYSDV抗性性状的相对小的渐渗片段的DH植物。随后，该DH植物被确认为CYSDV抗性。
[0213]所选择的DH系实质上相应于优良杂交甜瓜的父本系的被校正的版本，因为其一条染色体的片段被来自另一甜瓜种质的相应片段所特异性替换，并且在该处理中，显性抗性性状被导入其基因组。
[0214]随后将该“被校正”的系与优良杂交甜瓜的母本系杂交，该杂交的(非转基因)Fl后代除了 CYSDV抗性之外，还具有优良甜瓜杂交品种的所有的特色特征。
[0215]实施例8
[0216]重组频率增加的拟南芥中性状的有效金字塔化
[0217]已经发现了负责“交换干扰”现象(构成例如连锁累赘的基础)的遗传决定因子。一个这样的因子是FANCM基因，其已被显示在拟南芥的减数分裂交换形成的控制中发挥关键作用(Knoll et al, 2012 ；Plant Cell 24:1448-1464 ;Crismani et al, 2012 ；Science336:1588-1590)。
[0218]抑制植物中FANCM的表达和/或活性消除了个体交换事件之间的干扰，使得在单个减数分裂中每个染色体或染色体区域有更多的重组事件能够发生。因此，可以通过抑制FANCM的表达或通过干扰FANCM的活性大大增加植物物种的遗传图大小，并且因而可以方便地去除连锁累赘。
【权利要求】
1.一种用于遗传修饰杂交植物的基因组的方法，其通过将它的染色体或染色体片段的一个或多个替换为一个或多个供体亲本的相应染色体或染色体片段来实施，所述方法包括: a)将所述杂交植物的亲本之一与供体亲本之一杂交，以获得第一Fl群体，允许所述Fl在抑制重组的同时产生孢子，产生所述孢子的双单倍体，以获得染色体取代系的第一群体， b)任选地，将所述杂交植物的另一亲本与同一个或另一个供体亲本杂交，以获得第二Fl群体，允许所述Fl在抑制重组的同时产生孢子，产生所述孢子的双单倍体，以获得染色体取代系的第二群体，以及 或者: Cl)通过选择所述第一或所述第二群体的一个个体并将该个体与另一群体的个体或与所述杂交植物的亲本杂交，产生已经获得供体亲本(们)的一个或多个完整染色体的被修饰的杂交植物； 或者 c2)通过如下操作产生被修饰的杂交植物的群体: . 1.选择所述第一或所述第二群体的一个个体并将该个体与所述杂交植物的相应亲本杂交，以及 ?.允许由该杂交得到的后代植物(们)产生孢子，同时允许重组发生，以获得已经获得供体亲本的一个或多个染色体片段的孢子群，并制造其双单倍体，以及 ii1.将由此获得的双单倍体植物与任选地被修饰的杂交植物的另一亲本杂交，或与另一个纯合系杂交。
2.如权利要求1所述的方法，其中允许重组发生是通过从基因组去除能够抑制重组的转基因来实现的，或通过不施用能够抑制重组的一种或多种化学品实现的。
3.如权利要求1所述的方法，其中使重组以高于平均值的频率发生。
4.如权利要求3所述的方法，其中重组的高于平均值的频率是通过干扰涉及重组抑制的一个或多个靶基因如FANCM实现的。
5.取代系的文库，其由权利要求1所述的方法可获得。
6.如权利要求5所述的文库，其中在每个取代系中，一条染色体是源自供体植物，并且其它染色体是源自杂交植物的亲本系。
7.由权利要求1所述的方法可获得的渐渗系的文库。
8.如权利要求7所述的文库，包括一组或多组渐渗系，其中在每组渐渗系中，一条染色体包括源自供体植物的一个或多个渐渗片段，并且其它染色体是源自杂交植物的亲本系。
9.如权利要求7或8所述的文库，其中对于每条染色体包括一组渐渗系。
10.权利要求5-9中任一项的文库用于加速的植物育种或杂交植物校正的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其中加速的植物育种包括从所述文库选择一个或多个系，所述系包含所述期望的供体染色体或携带所述期望的供体来源渐渗片段的染色体，并将所选择的系与另一个植物杂交。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述另一个植物是杂交植物的亲本系。
13.如权利要求10所述的用途，其中杂交植物校正包括系的选择，所述系包含所述期望的供体染色体或携带所述期望的供体来源渐渗片段的染色体，并将所选择的系与杂交植物的另一亲本杂交。
14.如权利要求13所述的用途，其中杂交植物的另一亲本也选自所述取代或渐渗文库。
【文档编号】C12N15/82GK104411158SQ201380034112
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年6月27日 优先权日:2012年6月29日
【发明者】R·H·G·德尔克斯 申请人:瑞克斯旺种苗集团公司