用于产生单体和多聚体分子的方法及其用途
【专利摘要】本文报道用于产生作为n聚体具有生物活性的多肽的方法，其包括编码下式(Bn-CSo-Is-CSp-FC-CSq-It-CSr-Bm)u的融合多肽的核酸，其中B表示作为n聚体具有生物活性且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成非限定的聚集体/多聚体的多肽，FC表示重链Fc区多肽，CS表示切割位点，I表示间插氨基酸序列，其中FC基本上不结合Fc受体，从细胞或培养基回收融合多肽，可选地用蛋白酶切割融合多肽，从而产生作为n聚体具有生物活性且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成非限定的聚集体/多聚体的多肽。
【专利说明】用于产生单体和多聚体分子的方法及其用途
[0001] 本文报道用于产生作为与免疫球蛋白Fc区的融合多肽的单体和多聚体分子（如 治疗剂）的方法及其在测定法、层析柱或产生疾病动物模型中的用途。
【背景技术】
[0002] 免疫球蛋白一般包含两条轻多肽链和两条重多肽链。每条重多肽链和轻多肽链 包含含有能够与抗原相互作用的结合结构域的可变区（通常是多肽链的氨基端部分）。每 条重多肽链和轻多肽链还包含恒定区（通常是羧基端部分）。重链的恒定区介导免疫球蛋 白与例如具有Fcy受体（FcyR)的细胞（如吞噬细胞）或与具有新生儿FC受体（FcRn) (也称为Brambell受体）的细胞的结合，还介导与一些因子（包括经典补体系统的因子，如 (Clq)成分）的结合。
[0003] Hulett和Hogarth(Hulett,M.D?和Hogarth,P.M.，Adv.Immunol. 57 (1994) 1-127) 报道，G类免疫球蛋白的Fc部分的胞外受体是跨膜糖蛋白家族，该家族包含具有不同结合 特异性的三种不同受体类型：FcyRI、FcyRII和FcyRIII。I型受体与未复合的IgG相互 作用，而II型和III型受体优选与复合的IgG相互作用。
[0004] 某些基于免疫球蛋白的细胞因子融合蛋白可商购（例如从Biomol)。FC 区融合物广泛报道于"Therapeuticmonoclonalantibodies-frombenchto clinic"（Wiley,ZhiqiangAn编辑，2009)中。
[0005] TO01/03737 中报道了免疫球蛋白融合蛋白。Gillies,S.D?等（Clin.Cancer Res. 8 (2002) 210-216)报道了抗体-白介素2免疫细胞因子的基于减少的胞内水解的改善 的循环半寿期和功效。Dumont,J.A.等（Biodrugs20(2006) 151-160)报道了单体Fc融合 物。Lo，K-M.等（Prot.Eng. 11(1998)495-500)报道了Fc-X融合蛋白在哺乳动物细胞中的 高水平表达和分泌。W0 00/40615中报道了作为Fc融合蛋白表达和输出抗-肥胖蛋白。
[0006] 发明概述
[0007] 已发现，可以通过将这些多肽表达为与基本上不结合Fc受体的Fc区的融合多肽 来以可溶形式获得作为n聚体（n-mer)具有生物活性且在表达时形成非限定的聚集体/多 聚体的多肽。用融合多肽进行多肽的表达提高了以融合多肽的形式或作为分离的多肽可获 得的多肽产量。还进一步发现，多肽在切割并去除Fc区后保持限定的n聚体形式。
[0008] 本文报道的一个方面是用于产生作为n聚体具有生物活性且在缺乏融合的Fc区 的情况下表达时形成非限定的聚集体/多聚体的多肽的方法，该方法包括以下步骤：
[0009] a)培养包含编码根据式I的融合多肽的核酸的细胞
[0010] (Bn-CS0-Is-CSp-FC-CSq-It-CSr-Bm)u (式I)
[0011] 其中
[0012] B表示作为n聚体具有生物活性且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成非限定 的聚集体/多聚体的多肽，
[0013] FC表示重链Fc区多肽，
[0014] CS表示切割位点，和
[0015] I表示间插氨基酸序列，
[0016] 其中，n=l且m= 0,或n= 0 且m=l，
[0017] 其中，如果n= 1，则〇 = 0或1，并且如果〇 = 0,则p= 0或1，并且如果〇 = 1， 则P= 〇,并且s= 0或1，并且q= 0,并且t= 0,并且r= 0，
[0018] 其中，如果m= 1，则q= 0或1，并且如果q= 0,则r= 0或1，并且如果q= 1， 则r= 0,并且t= 0或1，并且〇 = 0,并且s= 0,并且p= 0，
[0019] 其中，u=l或 2，
[0020] 其中FC基本上不结合Fc受体，
[0021] b)从细胞或培养基回收融合多肽，
[0022] c)可选地用蛋白酶切割融合多肽，
[0023] 从而产生作为n聚体具有生物活性且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成非 限定的聚集体/多聚体的多肽。
[0024] 本文报道的一个方面是根据式I的融合多肽
[0025] (Bn-CS0-Is-CSp-FC-CSq-It-CSr-Bm)u (式I)
[0026] 其中B表示作为n聚体具有生物活性且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成 非限定的聚集体/多聚体的多肽，
[0027] FC表示重链Fc区多肽，
[0028] CS表示切割位点，和
[0029] I表示间插氨基酸序列，
[0030] 其中，n= 1 且m= 0,或n= 0 且m= 1，
[0031] 其中，如果n= 1，则〇 = 0或1，并且如果〇 = 0,则p= 0或1，并且如果〇 = 1， 则P= 〇,并且s= 0或1，并且q= 0,并且t= 0,并且r= 0，
[0032] 其中，如果m= 1，则q= 0或1，并且如果q= 0,则r= 0或1，并且如果q= 1， 则r= 0,并且t= 0或1，并且〇 = 0,并且s= 0,并且p= 0，
[0033] 其中，u=l或 2，
[0034] 其中FC基本上不结合Fc受体。
[0035] 本文报道的一个方面是通过切割本文报道的通过本文报道的方法获得的融合多 肽获得的n聚体多肽。
[0036] 在一个实施方案中，B选自细胞因子的组，如IL17、IL18和IL33 ;细胞因子受体的 组，如IL18R和IL33R;TNF家族成员的组，如TNF、TWEAK和TLla。
[0037] 在一个实施方案中，FC是选自人IgGl重链多肽、人IgG2重链多肽、人IgG3重链多 肽、人IgG4重链多肽、鼠IgGl重链多肽、鼠IgG2重链多肽、鼠IgG2a重链多肽、鼠IgG3重 链多肽、兔IgG重链多肽的组的重链多肽的变体。这包括所有天然存在的同种异型。
[0038] 在一个实施方案中，重链Fc区多肽在位置234、235、236、237、238、239、253、254、 265、266、267、268、269、270、288、297、298、299、307、311、327、328、329、330、331、332、434和 435中的一个或多个处具有氨基酸突变。在一个实施方案中，Fc受体中的一个或多个是 Fey受体。
[0039] 在一个实施方案中，人IgGl重链多肽在氨基酸位置233、234、235、236、265、297、 329和331中的一个或多个处具有突变。
[0040] 在一个实施方案中，人IgGl重链多肽具有氨基酸突变E233P、L234A、L235A、 L235E、AG236、D265A、N297A、N297D、P329A、P329G和P331S中的一个或多个。
[0041 ] 在一个实施方案中，人IgGl重链多肽具有氨基酸突变L234A和L235A及E233P、 L235E、AG236、D265A、N297A、N297D、P329A、P329G和P331S中的一个或多个。
[0042] 在一个实施方案中，人IgGl重链多肽具有氨基酸突变L234A和L235A及P329A或 P329G〇
[0043] 在一个实施方案中，人IgG2重链多肽在氨基酸位置233、234、235、236、265和329 中的一个或多个处具有突变。
[0044] 在一个实施方案中，人IgG4重链多肽在氨基酸位置228、235、265和329中的一个 或多个处具有突变。
[0045] 在一个实施方案中，人IgG4重链多肽具有突变S228P、L235E、D265A、P329A和 P329G中的一个或多个。
[0046] 在一个实施方案中，人IgG4重链多肽具有突变S228P和L235E及P329A或P329G。
[0047] 在一个实施方案中，重链Fc区多肽在位置248、250、251、252、253、254、255、256、 257、272、285、288、290、291、308、309、310、311、314、385、386、387、428、433、434、435 和 436 中的一个或多个处具有氨基酸突变。在一个实施方案中，Fc受体中的一个或多个是FcRn。
[0048] 在一个实施方案中，人IgG重链多肽在氨基酸位置238、252、253、254、255、256、 265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、 386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439和/或447 中的一个或多个处具有突变。
[0049] 在一个实施方案中，具有减少的与FcRn的结合的人IgG重链多肽在氨基酸位置 252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439 和 / 或 447 处具有一个或 多个氨基酸改变。
[0050] 在一个实施方案中，具有减少的与FcRn的结合的人IgG重链多肽具有氨基酸突变 I253A、H310A和H435A。
[0051] 在一个实施方案中，u= 2,并且第一Fc包含突变T366W且可选地包含突变S354C， 并且第二Fc包含突变T366S、L368A和Y407V且可选地包含突变Y349C。
[0052] 在一个实施方案中，u= 2,且
[0053] a)n= 1，并且m= 0,并且与第一FC融合的B和与第二FC融合的B相同，或
[0054] b)n= 1，并且m= 0,并且与第一FC融合的B和与第二FC融合的B不同，或
[0055] c)n= 0,并且m= 1，并且与第一FC融合的B和与第二FC融合的B相同，或
[0056] d)n= 0,并且m= 1，并且与第一FC融合的B和与第二FC融合的B不同。
[0057] 在一个实施方案中，u= 1，并且融合多肽包含第二二硫化物连接的FC。
[0058] 在一个实施方案中，u= 1，并且融合多肽包含第二二硫化物连接的FC，其中一个 FC包含突变T366W且可选地包含突变S354C，并且另一FC包含突变T366S、L368A和Y407V 且可选地包含突变Y349C。
[0059] 在一个实施方案中，本文报道的方法用于产生作为1聚体（单体）具有生物活性 且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成非限定的聚集体/多聚体的多肽，且包括以下步 骤：
[0060] a)培养包含编码根据式II的融合多肽的核酸的细胞
[0061] Bn-CS0-Is-CSp-FC1-CSq-It-CSr-Bm:FC2 (式II)
[0062] 其中
[0063] B表示作为1聚体具有生物活性且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成非限定 的聚集体/多聚体的多肽，
[0064] FC1表不第一重链Fc区多肽，
[0065] FC2表示第二重链Fc区多肽，
[0066] CS表不切割位点，和
[0067] I表示间插氨基酸序列，
[0068] 其中，n= 1 且m= 0,或n= 0 且m= 1，
[0069] 其中，如果n= 1，则〇 = 0或1，并且如果〇 = 0,则p= 0或1，并且如果〇 = 1， 则P= 〇,并且s= 0或1，并且q= 0,并且t= 0,并且r= 0，
[0070] 其中，如果m= 1，则q= 0或1，并且如果q= 0,则r= 0或1，并且如果q= 1， 则r= 0,并且t= 0或1，并且〇 = 0,并且s= 0,并且p= 0，
[0071] 其中FC1和FC2通过一个或多个二硫键（:）共价连接，
[0072] 其中FC1和FC2基本上不结合Fc受体。
[0073] b)从细胞或培养基回收融合多肽，
[0074] c)可选地用蛋白酶切割融合多肽，
[0075] 从而产生作为1聚体具有生物活性且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成非 限定的聚集体/多聚体的多肽。
[0076] 在一个实施方案中，本文报道的方法用于产生作为2聚体（二聚体）具有生物活 性且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成非限定的聚集体/多聚体的多肽，且包括以下 步骤：
[0077] a)培养包含编码根据式II的融合多肽的核酸的细胞
[0078] Bn-CS0-Is-CSp-FC1-CSq-It-CSr-Bm:FC2 (式II)
[0079] 其中
[0080] B表示作为2聚体具有生物活性且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成非限定 的聚集体/多聚体的多肽，
[0081] FC1表不第一重链Fc区多肽，
[0082] FC2表示第二重链Fc区多肽，
[0083] CS表示切割位点，和
[0084] I表示间插氨基酸序列，
[0085] 其中，n= 1 且m= 0,或n= 0 且m= 1，
[0086] 其中，如果n= 1，则〇 = 0或1，并且如果〇 = 0,则p= 0或1，并且如果〇 = 1， 则P= 〇,并且s= 0或1，并且q= 0,并且t= 0,并且r= 0，
[0087] 其中，如果m= 1，则q= 0或1，并且如果q= 0,则r= 0或1，并且如果q= 1， 则r= 0,并且t= 0或1，并且〇 = 0,并且s= 0,并且p= 0，
[0088] 其中FC1和FC2通过一个或多个二硫键（:）共价连接，
[0089] 其中FC1和FC2基本上不结合Fc受体。
[0090]b)从细胞或培养基回收融合多肽，
[0091]c)可选地用蛋白酶切割融合多肽，
[0092] 从而产生作为2聚体具有生物活性且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成非 限定的聚集体/多聚体的多肽。
[0093] 在一个实施方案中，本文报道的方法用于产生作为3聚体（三聚体）具有生物活 性且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成非限定的聚集体/多聚体的多肽，且包括以下 步骤：
[0094]a)培养包含编码根据式II的融合多肽的核酸的细胞
[0095]Bn-CS0-Is-CSp-FC1-CSq-It-CSr-Bm:FC2 (式II)
[0096] 其中
[0097] B表示作为3聚体具有生物活性且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成非限定 的聚集体/多聚体的多肽，
[0098]FC1表不第一重链Fc区多肽，
[0099]FC2表示第二重链Fc区多肽，
[0100] CS表示切割位点，和
[0101] I表示间插氨基酸序列，
[0102] 其中，n= 1 且m= 0,或n= 0 且m= 1，
[0103] 其中，如果n= 1，则〇 = 0或1，并且如果〇 = 0,则p= 0或1，并且如果〇 = 1， 则P= 〇,并且s= 0或1，并且q= 0,并且t= 0,并且r= 0，
[0104] 其中，如果m= 1，则q= 0或1，并且如果q= 0,则r= 0或1，并且如果q= 1， 则r= 0,并且t= 0或1，并且〇 = 0,并且s= 0,并且p= 0，
[0105] 其中FC1和FC2通过一个或多个二硫键（:）共价连接，
[0106] 其中FC1和FC2基本上不结合Fc受体。
[0107]b)从细胞或培养基回收融合多肽，
[0108]c)可选地用蛋白酶切割融合多肽，
[0109] 从而产生作为3聚体具有生物活性且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成非 限定的聚集体/多聚体的多肽。
[0110] 在一个实施方案中，间插氨基酸序列选自包含（g3s)3、（g3s)4、（g3s)5、（g3s)6、 (G4S)3、（G4S)4、（G4S)5、（G5S)2、（G5S)3、（G5S)4及其任意组合的第一组，或选自包含Arg标记、 Avi标记、His_Avi标记、His标记、Flag标记、3xFlag标记、Strep标记、Nano标记、SBP标 记、c-myc标记、S标记、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST标记 或MBP标记的第二组，或选自这些组的两个元件的组合。
[0111] 在一个实施方案中，切割位点选自IgA蛋白酶切割位点、颗粒酶B蛋白酶切割 位点、Tev蛋白酶切割位点、PreScission蛋白酶切割位点、凝血酶切割位点、因子10a 蛋白酶位点、Ides蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点或SUMO蛋白酶（来自酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)的Ulpl(Ubl特异性蛋白酶1))切割位点。
[0112] 在一个实施方案中，融合多肽不包含额外的蛋白酶切割位点而是包含固有的蛋白 酶切割位点，如木瓜蛋白酶切割位点、胃蛋白酶切割位点或Ides蛋白酶切割位点。
[0113] 在一个实施方案中，一个或多个FC区中的C端赖氨酸残基已经缺失。这减少了蛋 白酶切割副产物的量（人工蛋白酶切割位点的去除）。
[0114] 本文报道的一个方面是固定化的本文报道的融合多肽或本文报道的n聚体多肽 作为亲和层析配体的用途。
[0115] 本文报道的一个方面是固定化的本文报道的融合多肽或本文报道的n聚体多肽 在免疫测定法中的用途。
[0116] 在一个实施方案中，融合多肽或n聚体多肽结合于固相。
[0117] 本文报道的一个方面是包含本文报道的融合多肽或本文报道的n聚体多肽的药 物组合物。
[0118] 本文报道的一个方面是本文报道的融合多肽或本文报道的n聚体多肽在制备药 物中的用途。
[0119] 本文报道的一个方面是本文报道的融合多肽或本文报道的n聚体作为免疫原的 用途。
[0120] 本文报道的一个方面是本文报道的融合多肽或本文报道的n聚体用于通过将本 文报道的融合多肽或本文报道的n聚体应用于实验动物来获得疾病的动物模型的用途。
[0121] 本文报道的一个方面是本文报道的融合多肽或本文报道的n聚体用于选择特异 性结合B或B的n聚体的抗体的用途。
[0122] 本文报道的一个方面是本文报道的融合多肽或本文报道的n聚体用于产生B的二 硫化物连接的2聚体的用途。
[0123] 发明详述
[0124] 附图简述
[0125] 图1.Fc受体融合多肽表达质粒的质粒图谱。
[0126] 图2.Fc受体融合多肽的木瓜蛋白酶切割的分析型SDS-PAGE凝胶。
[0127]图 3. 12%BisTrisGel+/-DIT;分别用PreScission蛋白酶（泳道4,8)、IgA蛋 白酶（泳道3, 7)切割FcyRIIIaV158-Avi-FcLALAP239G:可以看到使用PP的非特异性 切割（泳道2, 6)。
[0128] 图4.抗Her抗体（野生型，上部）和糖改造的抗Her抗体的不同糖基化形式的分 离和定量。
[0129] 图5.使用FcyRIIIaV158和Fc标记的FcyRIIIaV158的亲和柱的比较。
[0130] 图 6?与FeyRIIIaV158 的 40RU相比，FeyRIIIaV158-FcLALAP329G融合多肽 的响应的BIAcore传感图显示超过100个响应单位；FcgRIIIaV158_008表示非切割的融 合多肽，FcgRIIIaV158_007表示FcgRIIIa的缩短的非功能性变体（=对照），FcgRIIIa V158_jf323表示包含FcgRIIIa的功能性变体的完整的HisAvi标记。
[0131] 图7.?〇丫受体￥1584(：1^1^?3296融合多肽（图73)、？〇丫受体￥158(图713)、切 割的Fey受体V158-FcLALAP329G融合多肽（图7c)、非功能性Fey受体V158-FcLALA P329G融合多肽（图7d)(=对照）的传感图。
[0132] 图8.Fc-TWEAK融合多肽表达质粒的质粒图谱。
[0133] 图9.FC-IL17A融合多肽表达质粒的质粒图谱。
[0134] 图10.人TNF a变体的滴定曲线。
[0135] 图11.不同二聚体FcIL17融合多肽装配和状态的示意图。
[0136] 图12.三聚体Fc区人TWEAK融合多肽。
[0137] 图13.IL-33的全长（1-270)和缩短（112 - 270)形式都具有功能活性；可以加入 IgG-Fc替代IL-33的其余部分（1-112)，以获得具有功能活性的IL-33 ;作为单体发挥作 用；单体IgGl-Fc_IL-33。
[0138] 图14.作为IgGl-Fc-KiH_Precision蛋白酶位点_shTNF融合多肽的三聚体人 TNFa。
[0139] 图15.Fc-shTNFa融合多肽（结）表达质粒的质粒图谱。
[0140] 图16?人IgGIFc区（孔）表达质粒的质粒图谱。
[0141] 图17.本文报道的单体IL18R-FC融合多肽较之二聚体IL18R-FC融合多肽的 BIAcore数据。
[0142] 定义
[0143] 术语"与Fc受体结合"指在例如BIAcore?测定法（PharmaciaBiosensor AB,Uppsala,瑞典）中Fc区与Fc受体的结合。
[0144] 在BIAcore?测定法中，使Fc受体结合于表面，并通过表面等离振子共振（SPR)来 测量分析物（例如含有Fc区的融合多肽或抗体）的结合。通过术语ka(缔合常数：Fc区 融合多肽或缀合物缔合形成Fc区/Fc受体复合物的速率常数）、kd(解离常数：Fc区融合 多肽或缀合物从Fc区/Fc受体复合物解离的速率常数）和KD(kd/ka)来定义结合的亲和 力。备选地，可以就共振信号高度和解离行为将SPR传感图的结合信号与参考的响应信号 直接比较。
[0145] 术语"CH2结构域"指从约EU位置231延伸至EU位置340 (按照Kabat的EU编 号系统）的抗体重链多肽部分。在一个实施方案中，CH2结构域具有SEQIDN0:01(APELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK)的氨基酸序列。CH2结构域的独特性在于，它不与另一结构 域紧密配对。相反，两个N连接的分枝糖链插在完整的天然Fc区的两个CH2结构域之间。 已推测，糖可以提供结构域-结构域配对的替代，并帮助稳定CH2结构域。Burton,Mo1. Immunol. 22(1985) 161-206。
[0146] 术语"CH3结构域"指约从EU位置341延伸至EU位置446的抗体重链多肽部分。 在一个实施方案中，CH3 结构域具有SEQIDNO: 02(GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG)的氨 基酸序列。
[0147] 术语抗体的"类别"指它的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主 要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几种可以进一步划分为亚类（同种型）， 例如IgGpIgGylgGpIgGpIgAjPIgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分 别称为a、6、e、y和]i。
[0148] 术语"Fc区"指免疫球蛋白的C端区域。Fc区是包含两个二硫化物连接的抗体重 链Fc区多肽（Fc区多肽链）的二聚体分子。Fc区可以通过木瓜蛋白酶消化或IdeS消化或 胰蛋白酶消化完整（全长）抗体来产生或可以重组产生。
[0149]可从全长抗体或免疫球蛋白获得的Fc区包含全长重链C端的残基226 (Cys)，因 此包含部分铰链区和两个或三个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构 域。从US5, 648, 260和US5, 624, 821已知，Fc区中确定的氨基酸残基的修饰导致表型效 应。
[0150] 通过所包含的CH3结构域的非共价二聚化来介导包含两个相同或不同的抗 体重链片段的二聚体Fc区的形成（所涉及的氨基酸残基见例如Dall'Acqua，Bioch em. 37(1998)9266-9273)。通过铰链区中二硫键的形成来共价稳定Fc区（见例如Huber 等，Nature264 (1976) 415-420;Thies等，J.Mol.Biol. 293 (1999) 67-79)。由于CH3-CH3 结 构域二聚化所涉及的残基的位置定位在CH3结构域的内侧界面，而Fc区-FcRn相互作用所 涉及的残基定位在CH2-CH3结构域的外侧，为破坏CH3-CH3结构域相互作用的二聚化而在 CH3结构域内引入的氨基酸残基改变对FcRn结合没有不利的影响。
[0151] Fc区相关效应子功能由Fc区与效应子功能特异性细胞表面受体的相互作用起 始。大多数情况下，IgGl同种型的抗体可以实现受体激活，而IgG2和IgG4同种型的抗体 不具有效应子功能或具有有限的效应子功能。
[0152] 引出效应子功能的受体是Fc受体类型（和亚型）FcyRI、FcyRII*FcyRIII。 可以通过在下铰链区中引入特异性氨基酸改变（如涉及FcyR和Clq结合的L234A和/或 L235A)来减少与IgGl同种型相关的效应子功能。尤其是定位在CH2和/或CH3结构域中 的某些氨基酸残基也与抗体分子或Fc区融合多肽在血流中的循环半寿期相关。通过Fc区 与新生儿Fc受体（FcRn)的结合来测定循环半寿期。
[0153] 按照Kabat(Kabat等 1991，SequencesofProteinsofimmunological Interest，U.S.DepartmentofPublicHealth，Bethesda，Md.)的EU索引进行抗体恒定区 中氨基酸残基的编号。
[0154] 术语"人来源的Fc区"指人来源的免疫球蛋白重链的C端区域，其包含至少部分铰 链区、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pr〇230 延伸至重链的羧基端。但是，Fc区的C端赖氨酸（Lys447)可以存在或不存在。除非本文另 有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号按照Kabat,E.A.等，SequencesofProteins ofImmunologicalInterest，第 5 版，PublicHealthService,NationalInstitutesof Health，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication91-3242 中所述的EU编号系统，也称为EU 索引。
[0155] 术语"Fc区的FcRn结合部分"指抗体重链多肽的部分，其约从EU位置243延伸 至EU位置261，和约从EU位置275延伸至EU位置293,和约从EU位置302延伸至EU位置 319,和约从EU位置336延伸至EU位置348,和约从EU位置367延伸至EU位置393和EU 位置408,和约从EU位置424延伸至EU位置440。在一个实施方案中，改变以下根据Kabat 的EU编号的氨基酸残基中的一个或多个：F243、P244、P245P、K246、P247、K248、D249、T250、 L251、M252、I253、S254、R255、T256、P257、E258、V259、T260、C261、F275、N276、W277、Y278、 V279、D280、V282、E283、V284、H285、N286、A287、K288、T289、K290、P291、R292、E293、V302、 V303、S304、V305、L306、T307、V308、L309、H310、Q311、D312、W313、L314、N315、G316、K317、 E318、Y319、1336、S337、K338、A339、K340、G341、Q342、P343、R344、E345、P346、Q347、V348、 C367、V369、F372、Y373、P374、S375、D376、I377、A378、V379、E380、W381、E382、S383、N384、 G385、Q386、P387、E388、N389、Y391、T393、S408、S424、C425、S426、V427、M428、H429、E430、 A431、L432、H433、N434、H435、Y436、T437、Q438、K439 和S440(EU编号）。
[0156] IgGl同种型的野生型人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
[0157] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGHYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO：03).
[0158] 具有突变L234A、L235A的IgGl同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序 列：
[0159] DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMTSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVFVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO：04).
[0160] 具有突变T366S、L368A和Y407V的IgGl同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下 氨基酸序列：
[0161] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPRFFQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO：05).
[0162] 具有突变T366W的IgGl同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
[0163] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO：06).
[0164] 具有突变L234A、L235A和T366S、L368A和Y407V的IgGl同种型的变体人Fc区的 多肽链具有以下氨基酸序列：
[0165] DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO：07).
[0166] 具有突变L234A、L235A和T366W的IgGl同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下 氨基酸序列：
[0167] DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO：08).
[0168] 具有突变P329G的IgGl同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
[0169] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO：09).
[0170] 具有突变L234A、L235A和P329G的IgGl同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下 氨基酸序列：
[0171] DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO：10).
[0172] 具有突变P239G和T366S、L368A和Y407V的IgGl同种型的变体人Fc区的多肽链 具有以下氨基酸序列：
[0173] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO：11).
[0174] 具有突变P329G和T366W的IgGl同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸 序列：
[0175] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO：12).
[0176] 具有突变12344、12354、？3296和13665、13684和￥407￥的1§61同种型的变体人 Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
[0177] DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO：13).
[0178] 具有突变L234A、L235A、P329G和T366W的IgGl同种型的变体人Fc区的多肽链具 有以下氨基酸序列：
[0179] DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO：14).
[0180] IgG4同种型的野生型人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
[0181] ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGK(SEQIDNO：15).
[0182] 具有突变S228P和L235E的IgG4同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸 序列：
[0183] ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGK(SEQIDNO：16).
[0184] 具有突变S228P、L235E和P329G的IgG4同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下 氨基酸序列：
[0185] ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGK(SEQIDNO：17).
[0186] 术语"Fc受体"、简称"FcR"指与Fc区结合的受体。在一个实施方案中，FcR是 天然序列人FcR。此外，在一个实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(Fcy受体），且 包括FeyRI、FeyRII和FeyRIII亚类的受体，包括其等位基因变体和可变剪接变体。 FcyRII受体包括FcyRIIA( "激活受体"）和FcyRIIB( "抑制受体"），其具有主要在其 胞质结构域中不同的相似的氨基酸序列。FcR综述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9(1991)457-492;Capel等，Immunomethods4(1994)25-34;deHaas等，J.Lab.Clin. Med. 126(1995)330-341中。本文的术语"FcR"涵盖其他FcR。该术语还包括负责将母体 IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn(见例如Guyer等，J.Immunol. 117(1976)587 ;Kim等，J. Immunol. 24 (1994)249)。
[0187] 术语"Fcy受体"、简称"FcyR"或"FcgammaR"指结合IgG抗体Fc区且由FcyR 基因编码的蛋白质家族的任意成员。在人类中，此家族包括但不限于：FcyRI(CD64)， 包括同种型FcyRIA、FcyRIB和FcyRIC;FcyRII(CD32)，包括同种型FcyRIIA(包 括同种异型H131 和R131)、FcyRIIB(包括FcyRIIB-1 和FcyRIIB-2)和FcyRile; 和FcyRIII(CD16)，包括同种型FcyRIIIA(包括同种异型V158 和F158 ;Swiss-Prot 入口P08637 ;N-端-MRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSY FIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGR KYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQ-C-端；SEQID NO: 18)和FcyRIIlb(包括同种异型FcyRIIB-NA1 和FcyRIIB-NA2)(见例如Jefferis 等，Immunol.Lett. 82 (2002) 57-65,整体引入作为参考）；以及FcyR同种型或同种异型。 FcyR可以来自任意生物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcyR包括但不 限于FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)、FcyRIII(CD16)和FcyRIII-2 (CD16-2)，以及或 FeyR同种型或同种异型。Fc区-FeyR相互作用所涉及的氨基酸残基是234-239 (下铰 链区）、265-269 (B/C环）、297-299 (D/E环）和 327-332 (F/G环）（Sondermann等，Nature 406(2000)267-273)。导致减少的对FeyRI、FeyRIIA、FeyRIIB和 / 或FeyRIIIA的 结合/亲和力的氨基酸突变包括N297A(伴有降低的免疫原性和延长的半寿期结合/亲 和力）（R〇utledge等，Transplantation6〇(l995)847;Friend等，Transplantation 68(1999) 1632;Shields等，J.Biol.Chem. 276 (1995) 6591)、残基 233-236(Ward和 Ghetie,Ther.Immunol. 2 (1995) 77;Armour等，Eur.J.Immunol. 29 (1999) 2613) 〇 一些不例 性氨基酸取代描述于US7, 355, 008和US7, 381，408中。
[0188] 术语"新生儿Fc受体"、简称"FcRn"指结合IgG抗体Fc区且至少部分由FcRn基 因编码的蛋白质。FcRn可以来自任意生物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领 域已知，功能性FcRn蛋白质包含常称为重链和轻链的两条多肽。轻链是0-2-微球蛋白， 重链由FcRn基因编码。除非本文另有说明，FcRn或FcRn蛋白质指FcRn重链与0-2-微 球蛋白的复合物。Fc区与FcRn的相互作用氨基酸残基在CH2和CH3结构域的连接处附近。 Fc区-FcRn接触残基全都在单条IgG重链内。所涉及的氨基酸残基是248、250-257、272、 285、288、290-291、308-311和314(全都在CH2结构域中）及氨基酸残基385-387、428和 433-436 (全都在CH3结构域中）。导致增加的对FcRn的结合/亲和力的氨基酸突变包括 T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等，J.Biol.Chem. 276 (2001) 6591)。
[0189] 在物种间保守的FcRn的氨基酸残基是Fc区中的310和435位的组氨酸残 基。这些残基造成Fc区FcRn相互作用的pH依赖性（见例如Victor,G?等，Nature Biotechnol. 15 (1997) 637-640) ;Dall'Acqua，W.F?等J.Immunol. 169 (2002) 5171-5180)。 减弱与FcRn的相互作用的Fc区突变可以降低抗体半寿期。
[0190] 术语"铰链区"指抗体重链多肽的连接CH1结构域和CH2结构域的部分，例如从 根据Kabat的EU编号系统的约216位至约230位。铰链区通常是由两条具有相同氨基 酸序列的多肽组成的二聚体分子。铰链区通常包含约25个氨基酸残基，且具有允许抗原 结合区独立移动的柔性。铰链区可以细分为三个结构域：上、中和下铰链区（Roux等，J. Immunol. 161(1998)4083)。
[0191] 铰链区通常是由两条具有相同氨基酸序列的多肽组成的二聚体分子。铰链区通常 包含约25个氨基酸残基，且具有允许抗原结合区独立移动的柔性。铰链区可以细分为三个 结构域：上、中和下铰链区（见Roux等，J.Immunol. 161 (1998) 4083)。
[0192] 术语Fc区的"下铰链区"指紧接着铰链区C端的一段氨基酸残基，即根据Kabat的 EU编号的Fc区的残基233至239。
[0193] 术语"野生型Fc区"指与见于自然界中的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序 列。野生型人Fc区包括天然人IgGIFc区（非A和A同种异型）、天然人IgG2Fc区、天然人 IgG3Fc区和天然人IgG4Fc区，及其天然存在的变体。
[0194] 术语"药物组合物"指这样的制剂，其处于这样的形式，以致允许包含在其中的活 性成分的生物学活性有效，且其不包含对将施用该制剂的对象具有不可接受的毒性的额外 成分。
[0195] "可药用载体"指药物组合物中除活性成分外的成分，其对对象无毒性。可药用载 体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0196] 术语"多肽"指天然产生或合成产生的由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物。少 于约20个氨基酸残基的多肽可以称为"肽"，而由两条或多条多肽组成或包含一条超过100 个氨基酸残基的多肽的分子可以称为"蛋白质"。多肽还可以包含非氨基酸成分，如糖基、 金属离子或羧酸酯。非氨基酸成分可以由其中表达该多肽的细胞加入，且可以随细胞类型 而不同。本文根据其氨基酸骨架结构或编码其氨基酸骨架结构的核酸来定义多肽。加入物 (如糖基）通常不指明，但可以存在。
[0197] 术语"氨基酸序列标记"指具有特定结合特性的通过肽键相互连接的氨基酸残 基的序列。在一个实施方案中，氨基酸序列标记是亲和或纯化标记。在一个实施方案中， 氨基酸序列标记选自Arg标记、His标记、Avi标记、His-Avi标记、Flag标记、3xFlag标 记、Strep标记、Nano标记、SBP标记、c-myc标记、S标记、妈调蛋白结合肽、纤维素结合 结构域、几丁质结合结构域、GST标记和MBP标记。在一个实施方案中，氨基酸序列标记 选自SEQIDN0:19(RRRRR)、SEQIDN0:20(RRRRRR)、SEQIDN0:21(Avi标记）、SEQID NO: 22 (His-Avi标记）、SEQIDNO: 23 (HHHHHH)、SEQIDNO: 24 (KDHLIHNVHKEFHAHAHNK)、 SEQIDNO:25(DYKDDDDK)、SEQIDNO:26(DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK)、SEQID NO:27(AWRHPQFGG),SEQIDNO:28(WSHPQFEK),SEQIDNO:29(MDVEAWLGAR),SEQID N0:30(MDVEAWLGARVPLVET),SEQIDNO:31(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP), SEQIDNO:32(EQKLISEEDL),SEQIDNO:33(KETAAAKFERQHMDS),SEQIDNO:34(KRRWKKNFI AVSAANRFKKISSSGAL)、SEQIDNO:35(纤维素结合结构域）、SEQIDNO:36(纤维素结合结 构域）、SEQIDNO:37(TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ)、SEQ IDNO: 38(GST标记）和SEQIDNO: 39(MBP标记）。
[0198] 术语"酶切割位点"指可由蛋白酶特异性切割的通过肽键相互连接的氨基酸残基 的序列。在一个实施方案中，蛋白酶是IgA蛋白酶、颗粒酶B、Tev蛋白酶、PreScission蛋 白酶、凝血酶、因子l〇a、Ides蛋白酶或肠激酶。
[0199] 术语"IgA蛋白酶"指衍生自淋病奈瑟氏菌（Neisseriagonorrhoeae)的具有包含 以下序列之一的识别位点的蛋白酶，其中"丨"表示所切割的键的位置：
【权利要求】
1. 用于产生作为n聚体具有生物活性的多肽的方法，所述方法包括以下步骤： a) 培养包含编码根据式I的融合多肽的核酸的细胞 (Bn-CS0-Is-CSp-FC-CS q-It-CSr-Bm)u (式 I) 其中 B表示作为n聚体具有生物活性的多肽， FC表示重链Fc区多肽， CS表示切割位点，和 I表示间插氨基酸序列， 其中，n = 1且m = 0,或n = 0且m = 1， 其中，如果n = 1，则〇 = 0或1，并且如果〇 = 0,则p = 0或1，并且如果〇 = 1，则p =〇,并且s = 0或1，并且q = 0,并且t = 0,并且r = 0， 其中，如果m = 1，则q = 0或1，并且如果q = 0,则r = 0或1，并且如果q = 1，则r =〇,并且t = 0或1，并且〇 = 0,并且s = 0,并且p = 0， 其中，u = 1或2， 其中FC基本上不结合Fc受体， b) 从细胞或培养基回收融合多肽， c) 可选地用蛋白酶切割融合多肽， 从而产生作为n聚体具有生物活性且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成非限定 的聚集体/多聚体的多肽。
2. 根据式I的融合多肽： (Bn-CS0-Is-CSp-FC-CS q-It-CSr-Bm)u (式 I) 其中B表示作为n聚体具有生物活性的多肽， FC表示重链Fc区多肽， CS表示切割位点，和 I表示间插氨基酸序列， 其中，n = 1且m = 0,或n = 0且m = 1， 其中，如果n = 1，则〇 = 0或1，并且如果〇 = 0,则p = 0或1，并且如果〇 = 1，则p =〇,并且s = 0或1，并且q = 0,并且t = 0,并且r = 0， 其中，如果m = 1，则q = 0或1，并且如果q = 0,则r = 0或1，并且如果q = 1，则r =〇,并且t = 0或1，并且〇 = 0,并且s = 0,并且p = 0， 其中，u = 1或2， 其中FC基本上不结合Fc受体。 3. n聚体多肽，其通过切割由根据权利要求1的方法获得的融合多肽来获得。
4. 根据权利要求1的方法或根据权利要求2的融合多肽或根据权利要求3的n聚体 多肽，特征在于B选自IL17、TWEAK、TNF和其他TNF家族成员、TLla、IL18、IL18R、IL33和 IL33R的组。
5. 根据权利要求1或4的方法或根据权利要求2或4的融合多肽，特征在于FC是选自 人IgGl重链多肽、人IgG2重链多肽、人IgG3重链多肽、人IgG4重链多肽、鼠 IgGl重链多 肽、鼠 IgG2重链多肽、鼠 IgG3重链多肽、兔IgG重链多肽的组的重链多肽的变体。
6. 根据权利要求1、4或5中任一项的方法或根据权利要求2、4或5中任一项的融合多 肽，特征在于FC选自具有突变L234A、L235A和P329G的人IgGl重链多肽，具有突变S228P、 L235E和P329G的人IgG4重链多肽。
7. 根据权利要求1、4、5或6中任一项的方法或根据权利要求2、4、5或6中任一项的融 合多肽，特征在于u = 2,并且第一 Fc包含突变T366W且可选地包含突变S354C，并且第二 Fc包含突变T366S、L368A和Y407V且可选地包含突变Y349C。
8. 根据权利要求7的方法或根据权利要求7的融合多肽，特征在于： a) n = 1，并且m = 0,并且与第一 FC融合的B和与第二FC融合的B相同， b) n = 1，并且m = 0,并且与第一 FC融合的B和与第二FC融合的B不同， c) n = 0,并且m= 1，并且与第一 FC融合的B和与第二FC融合的B相同， d) n = 0,并且m= 1，并且与第一 FC融合的B和与第二FC融合的B不同。
9. 固定的根据权利要求2和4至8中任一项的融合多肽或根据权利要求3至4中任一 项的n聚体多肽作为亲和层析配体的用途。
10. 固定的根据权利要求2和4至8中任一项的融合多肽或根据权利要求3至4中任 一项的n聚体多肽在免疫测定中的用途。
11. 根据权利要求9至10中任一项的用途，特征在于融合多肽或n聚体多肽结合于固 相。
12. 药物组合物，其包含根据权利要求2和4至8中任一项的融合多肽或根据权利要求 3至4中任一项的n聚体多肽。
13. 根据权利要求2和4至8中任一项的融合多肽或根据权利要求3至4中任一项的 n聚体多肽在制备药物中的用途。
14. 根据权利要求2和4至8中任一项的融合多肽或根据权利要求3至4中任一项的 n聚体多肽作为免疫原的用途。
15. 根据权利要求2和4至8中任一项的融合多肽或根据权利要求3至4中任一项的 n聚体多肽用于通过将根据权利要求2和4至8中任一项的融合多肽或根据权利要求3至 4中任一项的n聚体多肽应用于实验动物来获得疾病的动物模型的用途。
16. 根据权利要求2和4至8中任一项的融合多肽或根据权利要求3至4中任一项的 n聚体多肽用于选择特异性结合B或B的n聚体的抗体的用途。
17. 根据权利要求2和4至8中任一项的融合多肽或根据权利要求3至4中任一项的 n聚体多肽用于产生B的二硫化物连接的2聚体的用途。
18. 根据权利要求1和4至8中任一项的方法，所述方法用于产生作为2聚体具有生物 活性且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成非限定的聚集体/多聚体的多肽，所述方法 包括以下步骤： a)培养包含编码根据式II的融合多肽的核酸的细胞 Bn-CSo-Is-CSp-FCiCSq-It-CSr-Bm:FC2 (式 II) 其中 B表示作为2聚体具有生物活性且在缺乏融合的Fc区的情况下表达时形成非限定的聚 集体/多聚体的多肽， FC1表示第一重链Fc区多肽， FC2表示第二重链Fc区多肽， CS表示切割位点，和 I表示间插氨基酸序列， 其中，n = 1且m = 0,或n = 0且m = 1， 其中，如果n = 1，则〇 = 0或1，并且如果〇 = 0,则p = 0或1，并且如果〇 = 1，则p =〇,并且s = 0或1，并且q = 0,并且t = 0,并且r = 0， 其中，如果m = 1，则q = 0或1，并且如果q = 0,则r = 0或1，并且如果q = 1，则r =〇,并且t = 0或1，并且〇 = 0,并且s = 0,并且p = 0， 其中第一 FC和第二FC通过一个或多个二硫键共价连接， 其中FC1和FC 2基本上不结合Fc受体。 b) 从细胞或培养基回收融合多肽， c) 可选地用蛋白酶切割融合多肽， 从而产生作为2聚体具有生物活性的多肽。
【文档编号】C12N15/79GK104508133SQ201380040175
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年7月31日 优先权日:2012年8月2日
【发明者】J·奥尔, M·巴德尔, S·登勒, S·洛伦茨, S·西伯尔 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司