重组微生物及其用途

重组微生物及其用途
【专利摘要】将细菌遗传改造以产生3-羟基丙酸盐(3-HP)。该细菌是一氧化碳营养产乙酸细菌。该细菌使用用于固定CO/CO2的Wood-Ljungdahl途径而产生乙酰辅酶A。引入来自含有此类酶的细菌的丙二酰辅酶A还原酶。另外，还可引入乙酰辅酶A羧化酶。3-HP的生产可通过乙酰辅酶A羧化酶的过度生产或通过生物素的过度生产得到改善。这可通过改善的启动子或更高的拷贝数或催化上更有效的酶来实现。
【专利说明】重组微生物及其用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于通过对包含C0和/或C02的底物的微生物发酵生产3-羟基丙酸 盐[3-Hydroxypropionate, 3-HP]的重组微生物和方法。

【背景技术】
[0002] 3-羟基丙酸盐[3-HP]是平台化学品，充当用于生产聚合物材料的前体和化学原 料。聚（3-羟基丙酸）[P(3_HP)]是具有有希望的特征例如罕见的高热稳定性的生物可降 解聚合物。
[0003] 3-HP可用于获得许多有价值的工业化学品，包括：用于制造油漆、纸张、粘合剂、 纺织品、特种涂料、油墨和超吸收性聚合物聚丙烯酸酯的丙烯酸；用作溶剂、粘合剂、化妆品 或制备地毯和纺织品中使用的聚对苯二甲酸丙二酯的1，3-丙二醇；用于制备食物、用作饲 料添加剂和营养工业中的防腐剂的3-轻基丙醒（3-hydroxypropinaldehyde)。
[0004] 3-HP被美国能源部列为第三重要的可再生化学品，并且对于3-HP的全球市场缺 口估计为每年363万吨（Paster et al，2003, USD0E报告：48_ 49)。
[0005] 本发明的目的是提供用于通过微生物发酵生产3-HP的重组微生物和方法，所述 方法可提供超过已知方法的一个或多个优点，或至少为公众提供有用的选择。


【发明内容】

[0006] 总的来说，本发明尤其提供了用于通过对包含C0和/或co2的底物的微生物发酵 生产3-HP的方法，以及在此类方法中使用的重组微生物。它组合两种不同的0)2固定途径 以产生单一代谢产物。
[0007] 在第一个方面，本发明提供了能够通过对包含C0和/或0)2的底物发酵产生3-HP 以及任选的一种或多种其他产物的厌氧产乙酸重组微生物。
[0008] 在一个特定实施方案中，微生物被改造为适于表达3-HP生物合成途径中的一种 或多种酶（或其一个或多个亚基），所述酶并非天然存在于用于获得所述重组微生物的亲 本微生物中。在另一个实施方案中，微生物被改造为适于过表达3-HP生物合成途径中的一 种或多种酶（或其一个或多个亚基），所述酶天然存在于用于获得所述重组微生物的亲本 微生物中。在一个实施方案中，微生物被改造为适于表达3-HP生物合成途径中的一种或多 种酶（或其一个或多个亚基），所述酶并非天然存在于亲本微生物中，并且过表达3-HP生物 合成途径中的一种或多种酶（或其一个或多个亚基），所述酶天然存在于亲本微生物中。
[0009] 在一个实施方案中，所述一种或多种酶选自：丙二酰辅酶A还原酶（EC 1. 2. 1. 75);乙酰辅酶A羧化酶（ACC)(EC6. 4. 1. 2);以及其中任何一种的功能等价变体。
[0010] 在一个实施方案中，所述亲本微生物能够发酵包含C0和/或co2的底物，以产生 乙酰辅酶A，但不能将乙酰辅酶A转化为3-HP，并且重组微生物被改造为适于表达涉及乙酰 辅酶A转化为3-HP的一种或多种酶（或其一个或多个亚基）。
[0011] 在一个实施方案中，所述微生物包含被改造为适于增加所述亲本微生物天然包含 的一种或多种核酸的表达的一种或多种外源核酸，并且所述一种或多种核酸编码上文提及 的酶中的一种或多种（或其一个或多个亚基）。
[0012] 在一个实施方案中，被改造为适于增加表达的一种或多种外源核酸是调节元件。 在一个实施方案中，所述调节元件是启动子。
[0013] 在一个实施方案中，所述启动子是组成型启动子。在一个实施方案中，所述启动子 选自Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。
[0014] 在一个实施方案中，该微生物包含编码并被改造为适于表达上文提及的酶中的一 种或多种（或其一个或多个亚基）的一种或多种外源核酸。在一个实施方案中，该微生物 包含编码并被改造为适于表达酶中的至少两种（或其一个或多个亚基）的一种或多种外源 核酸。
[0015] 在一个实施方案中，所述一种或多种外源核酸是编码上文提及的酶中的一种或多 种的任何组合的核酸构建体或载体，在一个特定实施方案中，是编码上文提及的酶中的一 种或多种的任何组合的质粒。
[0016] 在一个实施方案中，所述外源核酸是表达质粒。
[0017] 在一个实施方案中，所述亲本微生物选自厌氧产乙酸菌。
[0018] 在一个特定实施方案中，所述亲本微生物选自一氧化碳营养产乙酸细菌， 在一个实施方案中，选自自产乙醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum)、扬氏梭 菌（Clostridiumljungdahlii)、拉氏梭菌（Clostridiumragsdalei)、食撰基化物 梭菌（Clostridiumcarboxidivorans)、德氏梭菌（Clostridiumdrakei)、奠味梭 菌（Clostridiumscatologenes)、乙酸梭菌（Clostridiumaceticum)、蚁酸乙酸梭 菌（Clostridiumformicoaceticum)、大梭菌（Clostridiummagnum)、食甲基 丁酸杆 菌（Butyribacteriummethylotrophicum)、伍氏乙酸杆菌（Acetobacteriumwoodii) > 巴氏嗜喊菌（Alkalibaculumbacchii)、Blautiaproducta、游泥真杆菌（Eubacterium limosum)、热乙酸穆尔氏菌（Moorellathermoacetica)、热自养穆尔氏菌（Moorella thermautotrophica)、卵形鼠抱菌（Sporomusaovata) >Sporomusasilvacetica、球形鼠 抱菌（Sporomusasphaeroides)、普氏产醋杆菌（Oxobacterpfennigii)和凯伍热厌氧菌 (Thermoanaerobacterkiuvi)〇
[0019] 在一个实施方案中，所述亲本微生物是自产乙醇梭菌或扬氏梭菌。在一个特定实 施方案中，所述微生物是自产乙醇梭菌DSM23693。在另一个特定实施方案中，所述微生物是 扬氏梭菌DSM13528 (或ATCC55383)。
[0020] 在一个实施方案中，所述亲本微生物缺乏编码丙二酰辅酶A还原酶和/或乙酰辅 酶A羧化酶或者其一个或多个亚基的一种或多种基因。
[0021] 在第二个方面，本发明提供了编码一种或多种酶（或其一个或多个亚基）的核酸， 当在微生物中表达时，其允许该微生物通过对包含C0和/或C02的底物的发酵产生3-HP。
[0022] 在一个实施方案中，所述核酸编码两种或更多种酶（或其一个或多个亚基），当在 微生物中表达时，其允许该微生物通过对包含⑶的底物的发酵产生3-HP。
[0023] 在一个实施方案中，所述酶选自丙二酰辅酶A还原酶和乙酰辅酶A羧化酶，以及其 任何一种或多种的功能等价变体。
[0024] 在一个实施方案中，所述核酸以任何次序包含编码丙二酰辅酶A还原酶、乙酰辅 酶A羧化酶或其任何一种或多种的功能等价变体的核酸序列。
[0025] 在一个实施方案中，编码丙二酰辅酶A还原酶的核酸具有SEQIDN0:1或 GI: 163848165,Caur2614的序列，或者是其功能等价变体。
[0026] 在一个实施方案中，编码乙酰辅酶A羧化酶的核酸包含序列SEQIDN0:18、 20、22 和 24(或CLJU_c42100-40，GI:9447826-31 和GI:163847210-11，Caur_1647-48， GI: 163849262,Caur_3739,GI: 163848951，Caur_3421，GI: 163846951，Caur_1378)，或其任 何一种或多种的功能等价变体。乙酰辅酶A羧化酶可包含多个亚基。需要时，这些可在一 种或多种核酸上编码。
[0027] 在一个实施方案中，本发明的核酸还包含启动子。在一个实施方案中，所述启动子 允许所述基因在其控制下的组成型表达。在特定实施方案中，使用Wood-Ljungdahl簇启动 子。在另一个特定实施方案中，使用磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。在一个特定 实施方案中，所述启动子来自自产乙醇梭菌。
[0028] 在第三个方面，本发明提供了包含第二个方面的一种或多种核酸的核酸构建体或 载体。
[0029] 在一个特定实施方案中，所述核酸构建体或载体是表达构建体或载体。在一个特 定实施方案中，所述表达构建体或载体是质粒。
[0030] 在第四个方面，本发明提供了包含第七个方面的核酸中的任何一种或多种或者第 三个方面的载体或构建体的宿主生物。
[0031] 在第五个方面，本发明提供了包含如本发明的第三个方面中提及的表达构建体或 载体以及甲基化构建体或载体的组合物。
[0032] 优选地，该组合物能够产生根据本发明的第一个方面的重组微生物。
[0033] 在一个特定实施方案中，所述表达构建体/载体和/或甲基化构建体/载体是质 粒。
[0034] 在第六个方面，本发明提供了通过包括使用本发明的第一个方面的重组微生物发 酵包含C0和/或C02的底物的微生物发酵，用于生产3-HP以及任选的一种或多种其他产 物的方法。
[0035] 在一个实施方案中，该方法包括下述步骤：
[0036] (a)向含有本发明的第一个方面的一种或多种微生物的培养物的生物反应器中提 供包含C0和/或0)2的底物；和
[0037] (b)使生物反应器中的培养物厌氧发酵，以产生3-HP。
[0038] 在一个实施方案中，该方法包括下述步骤：
[0039] (a)在由工业过程产生的含C0和/或C02的气体释放到大气中之前，捕获所述气 体；
[0040] (b)通过含有本发明的第一个方面的一种或多种微生物的培养物厌氧发酵含C0 和/或C02的气体，以至少产生3-HP。
[0041] 在所述方法方面的特定实施方案中，所述微生物维持在水性培养基内。
[0042] 在所述方法方面的特定实施方案中，所述底物的发酵在生物反应器中发生。
[0043] 优选地，所述包含C0和/或C02的底物是包含C0和/或C02的气态底物。在一 个实施方案中，所述底物包含工业废气。在某些实施方案中，所述气体是钢铁厂废气或合成 气。
[0044] 在特定实施方案中，所述底物是包含⑶的底物。
[0045] 在其中所述底物包含C02但不含C0的本发明的实施方案中，所述底物优选地还包 含h2。
[0046] 在一个实施方案中，所述底物包含C0和C02。在一个实施方案中，所述底物包含 0)2和H2。在另一个实施方案中，所述底物包含0)、0)2和H2。
[0047] 在一个实施方案中，所述底物通常含有较大比例的C0,例如按体积计至少约20% 至约100%C0,按体积计20 %至70 %C0,按体积计30 %至60 %C0,以及按体积计40 %至 55%C0。在特定实施方案中，所述底物包含按体积计约25%、或约30%、或约35%、或约 40%、或约 45%、或约 50%C0、或约 55%C0、或约 60%C0。
[0048] 在某些实施方案中，该方法还包括从发酵液中回收3-HP以及任选的一种或多种 其他产物的步骤。
[0049] 在第七个方面，本发明提供了通过第六个方面的方法产生的3-HP。
[0050] 在另一个方面中，本发明提供了用于产生本发明的第一个方面的微生物的方法， 所述方法包括用一种或多种外源核酸转化亲本微生物，使得该微生物能够通过对包含C0 和/或C02的底物的发酵，产生3-HP以及任选的一种或多种其他产物，其中所述亲本微生 物不能通过对包含C0和/或C02的底物的发酵产生3-HP。
[0051] 在一个特定实施方案中，用经改造适于表达3-HP生物合成途径中的一种或多种 酶的一种或多种外源核酸转化亲本微生物，所述一种或多种酶并非天然存在于所述亲本微 生物中。在另一个实施方案中,用经改造适于过表达3-HP生物合成途径中的一种或多种酶 的一种或多种核酸转化亲本微生物，所述一种或多种酶天然存在于所述亲本微生物中。在 另一个实施方案中，将亲本微生物用经改造适于表达3-HP生物合成途径中的一种或多种 酶（所述一种或多种酶并非天然存在于所述亲本微生物中）并且过表达3-HP生物合成途 径中的一种或多种酶（所述一种或多种酶天然存在于亲本微生物中）的一种或多种外源核 酸转化。
[0052] 在某些实施方案中，所述一种或多种酶是如本文所描述。
[0053] 在某些实施方案中，所述亲本微生物是如上文所描述。
[0054] 根据一个实施方案，本发明提供了用于将C0或C02转化成3-羟基丙酸盐（3-HP) 的方法。将含C0和/或含0)2的气态底物传送至含有在培养基中的一氧化碳营养产乙酸 细菌的培养物的生物反应器，使得所述细菌将C0和/或C02转化为3-HP。所述一氧化碳营 养产乙酸细菌被遗传改造为表达丙二酰辅酶A还原酶。它们还表达不论是天然的还是外源 的乙酰辅酶A羧化酶。将3-HP从所述生物反应器中回收。
[0055] 根据另一个实施方案，本发明提供了分离的、遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细 菌，其包含编码丙二酰辅酶A还原酶的核酸。所述核酸对于所述宿主细菌而言是外源的。该 细菌表达丙二酰辅酶A还原酶，并且该细菌获得将三个C0或0)2分子固定到一个3-羟基 丙酸盐（3-HP)分子内的能力。丙二酰辅酶A还原酶通常与SEQIDNO: 1的核苷酸序列编 码的氨基酸序列至少85%相同。
[0056] 该细菌还可包含编码乙酰辅酶A羧化酶的外源核酸。乙酰辅酶A羧化酶通常 与SEQIDN0:18-21的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少85%相同。核酸可与启动子 可操作地连接。核酸可已经是密码子优化的。所述核酸或所编码的羧化酶可来自非硫、 光合作用细菌。该细菌可选自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食羰基化物梭菌、德氏 梭菌、粪味梭菌、乙酸梭菌、蚁酸乙酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏乙酸杆菌、巴氏 嗜碱菌、Blautiaproducta、游泥真杆菌、热乙酸穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、 Sporomusasilvacetica、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧菌。所述外源核酸的供 体细菌可以是非硫、光合作用细菌，例如橙色绿屈挠菌（Chloroflexusauranticus)、生金 球形菌属（Metallosphaera)和硫化叶菌属（Sulfolobus)种。
[0057] 遗传改造的细菌可通过在包含气态碳源的培养基中生长而培养。所述碳源可包含 C0和/或C02，其可用作能源或碳源中的任一种或两者。该细菌可任选地在严格的厌氧条 件下生长。所述碳源可包含工业废弃物或废气。
[0058] 本发明还可在广义上被说成单独地或共同地包含在本申请的说明书中个别或共 同提及或指出的部分、元素和特征，以及包含所述部分、元素或特征的两个或更多个的任何 或所有组合，并且当在本文中提及在本发明涉及的领域中具有已知等价物的特定整数时， 此类已知等价物应被认为如同单独提出一样纳入本文。

【专利附图】

【附图说明】
[0059] 应从其所有新颖的方面加以考虑的本发明的这些及其他方面将通过下述参考附 图的描述变得显而易见，所述描述仅作为示例给出，在所述附图中：
[0060] 图1 :用于由3个C0或0)2分子可持续生产1个3-HP分子的两种C0 2固定途径的 组合。

【具体实施方式】
[0061] 对优选实施方案的下述描述是在广义上给出的。本发明还由在本文下文的标题 "实例"下给出的公开内容来进一步阐明，所述公开内容提供了支持本发明的实验数据、本 发明的多个方面的具体实例和实施本发明的方式。
[0062] 本发明人已能够令人惊讶地改造一氧化碳营养产乙酸微生物，以通过发酵包含C0 和/或C02的底物来产生3-羟基丙酸盐（3-HP)。这提供了用于生产3-HP的可替代方式， 所述可替代方式可具有优于当前用于生产3-HP的方法的益处。此外，它提供了使用来自工 业过程的一氧化碳的方式，所述一氧化碳原本将被释放到大气中并污染环境。
[0063] 在改造本发明的微生物时，本发明人已能够令人惊讶地组合两种单独的0)2固定 途径，如图1中示出的。这提供了使用包含C0的底物和/或包含C02的底物产生3-HP的 可持续发酵。两种固定〇)2的途径因此被连接起来以产生所需的产物。
[0064] 在一个实施方案中，本发明描述了通过组合两种单独的0)2固定途径（图1)，将三 个〇)2分子固定到一个3-HP分子内，所述两种途径是允许固定两个C02分子的产乙酸菌的Wood-Ljungdahl途径，以及允许固定另一个C02分子的3-HP循环的起始碳固定步骤。C02 还可替换为一氧化碳（C0)，因为Wood-Ljungdahl途径的关键酶--C0脱氢酶（C0DH)能够 在生物水煤气变换反应（C0+H20〈->C02+H2)中将C0转化成C02和能量。可使用C0和0)2的 任何混合物。当使用单独的(302时,可能需要供应以氢气（Hydrogen)或电形式的能量，而 C0可充当碳源和能源两者。
[0065] 虽然本发明人已在自产乙醇梭菌中证实了本发明的效力，但本发明可应用于更广 泛的厌氧产乙酸微生物以及对包含C0和/或co2的底物的发酵，如本文上文和进一步讨论 的。
[0066] 如本文提及的，"发酵液"是至少包含营养培养基和细菌细胞的培养基。
[0067] 如本文提及的，"穿梭微生物"是在其中表达甲基转移酶并且不同于目的微生物的 微生物。
[0068] 如本文提及的，"目的微生物"是在其中表达在包括表达构建体/载体上的基因并 且不同于穿梭微生物的微生物。这也被称为宿主微生物。
[0069] 术语"主要发酵产物"意指以最高浓度和/或产率产生的一种发酵产物。可存在 一种或多种发酵产物。最普遍的可以是或可以不是最有商业价值的。
[0070] 当在提及发酵过程中使用时，术语"增加效率"、"增加的效率"等等包括但不限于 增加下列中的一种或多种：催化发酵的微生物生长速率、在升高产物浓度下的生长和/或 产物生产率、所产生的所需产物的体积/所消耗底物的体积、所需产物的生产率或生产水 平、以及与发酵的其他副产物相比较所产生的所需产物的相对比例。
[0071] 短语"包含一氧化碳的底物"和相似术语应理解为包括其中一氧化碳可被一种或 多种细菌菌株利用以例如用于生长和/或发酵的任何底物。
[0072] 短语"包含一氧化碳的气态底物"以及相似短语和术语包括含有一定水平的一氧 化碳的任何气体。在某些实施方案中，所述底物含有按体积计至少约20 %至约100%C0,按 体积计20 %至70%C0,按体积计30 %至60%C0,以及按体积计40 %至55%C0。在特定 实施方案中，底物包含按体积计约25%、或约30%、或约35%、或约40%、或约45%、或约 50%C0、或约 55%C0、或约 60%C0。
[0073] 虽然包含C0的底物并不必须要包含任何氢，但4的存在不应不利于依照本发明 方法的产物形成。在特定实施方案中，氢的存在导致醇生产的总体效率改善。例如，在特定 实施方案中，所述底物可包含大约2:1、或1:1或1:2的H2:C0比。在一个实施方案中，所述 底物包含按体积计约30 %或更少的H2、按体积计20 %或更少的H2、按体积计约15 %或更少 的4、或者按体积计约10%或更少的4。在其他实施方案中，所述底物流包含低浓度的H2， 例如小于5%、或小于4%、或小于3%、或小于2%、或小于1 %或基本上不含氢。所述底物 还可含有一些C02，例如按体积计约1%至约80%C02、或按体积计1%至约30%C02。在一 个实施方案中，所述底物包含按体积计小于或等于约20%C02。在特定实施方案中，所述底 物包含按体积计小于或等于约15%C02、按体积计小于或等于约10%C02、按体积计小于或 等于约5 %C02或基本上不含C0 2。
[0074] 短语"包含二氧化碳的底物"和相似术语应理解为包括其中二氧化碳可被一种或 多种细菌菌株利用以例如用于生长和/或发酵的任何底物。包含二氧化碳的底物还可包含 氢和/或一氧化碳。
[0075] 短语"包含二氧化碳的气态底物"以及相似短语和术语包括含有一定水平的二氧 化碳的任何气体。在某些实施方案中，底物含有按体积计至少约10%至约60%C02，按体积 计20%至50%C02，按体积计30%至60%C02，以及按体积计40%至55%C02。在特定实施 方案中，所述底物包含按体积计约20%、或约25%、或约30%、或约35%、或约40%、或约 45%、或约50%0)、或约55%0)、或约60%0) 2。
[0076] 优选地，包含C02的底物还将包含一定水平的C0或112。在特定实施方案中，所述 底物包含至少约1:1、或至少约1:2、或至少约1:3、或至少约1:4、或至少约1:5的0)2:11 2比 例。
[0077] 在下文的描述中，以递送并发酵"含有C0和/或0)2的气态底物"来描述本发明的 实施方案。然而，应当理解气态底物可以替代形式提供。例如，可提供溶解于液体中的含有C0和/或co2的气态底物。基本上，将液体用含有一氧化碳的气体饱和，并且随后将该液体 加入生物反应器中。这可使用标准方法来实现。例如，可使用微泡分布发生器（Hensirisak etal,Scale-upofmicrobubbledispersiongeneratorforaerobicfermentation； AppliedBiochemistryandBiotechnology，Volume101，Number3/2002 年 10月）。又例 如，含有CO的气态底物可吸附到固体载体上。使用术语"包含CO和/或C02的底物"等时 包括了此类替代方法。
[0078] 在本发明的特定实施方案中，含C0气态底物（或包含C02、或C0和co2、或〇)2和 H2以及C0的气态底物）是工业废气（offgas或wastegas)。"工业废气"应在广义上理 解为为包括由工业过程产生的包含C0和/或C02的任何气体，并且包括因铁金属产品制造、 非铁产品制造、石油精炼过程、煤炭气化、生物质气化、电力生产、碳黑生产和焦炭制造而产 生的气体。进一步的例子可在本文其他地方提供。
[0079] 除非上下文另有要求，否则如本文使用的，短语"发酵"、"发酵过程"或"发酵反应" 等意欲包含所述过程的生长期和产物生物合成期两者。如本文进一步描述的，在一些实施 方案中，生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，向发酵反应中添加金 属或组合物应理解为包括向这些反应器中的任一或两者中的添加。
[0080] 术语"生物反应器"包括由一个或多个容器和/或塔或管道排列组成的发酵装置， 所述发酵装置包括连续搅拌釜式反应器（CSTR)、固定化细胞反应器（ICR)、滴流床反应器 (TBR)、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器或者适合于气体-液体接触的其他容器或其他 装置。在一些实施方案中，生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，当 提及向生物反应器或发酵反应中添加底物时，应理解为包括适当时向这些反应器中的任一 或两者中的添加。
[0081] "外源核酸"是源于待将它们引入其中的微生物之外的核酸。外源核酸可源自任何 适当来源，包括但不限于待将它们引入其中的微生物，与待将它们引入其中的生物不同的 微生物菌株或物种，或者它们可以是人工或重组方法制备的。当生物是遗传改造的或重组 体时，它含有与不同于天然存在于微生物中的序列的序列邻近的序列。在一个实施方案中， 外源核酸代表天然存在于待将它们引入其中的微生物中的核酸序列，并且将它们引入以增 加特定基因的表达或过表达特定基因（例如，通过增加所述序列（例如基因）的拷贝数，或 引入强启动子或组成型启动子以增加表达）。在另一个实施方案中，外源核酸代表并非天然 存在于待将它们引入其中的微生物中的核酸序列，并且所述外源核酸允许表达并非天然存 在于微生物内的产物或增加微生物中天然基因的表达（例如在引入调节元件例如启动子 的情况下）。外源核酸可被改造为适于整合到待将它引入其中的微生物的基因组内，或保持 染色体外的状态。外源序列可来自异源来源，例如另一个种、属、科或界。在任何情况下，如 此产生的细菌是非天然存在的，具有例如因序列差异或因拷贝数差异而不同于天然存在的 细菌的遗传互补。
[0082] 应当理解本发明可使用其序列不同于本文具体示例的序列的核酸来实施，条件是 它们执行基本上相同的功能。对于编码蛋白质或肽的核酸序列，这意指所编码的蛋白质或 肽具有基本上相同的功能。对于代表启动子序列的核酸序列，变体序列将具有促进一种或 多种基因表达的能力。此类核酸在本文中可被称为"功能等价变体"。例如，核酸的功能等 价变体包括等位基因变体、基因的片段、包括突变（缺失、插入、核苷酸置换等）和/或多态 性的基因等。来自其他微生物的同源基因也可视为本文具体示例的序列的功能等价变体的 实例。
[0083] 这些包括在诸如扬氏梭菌、橙色绿屈挠菌、生金球形菌属或硫化叶菌属种的物种 中的同源基因，其细节在网站例如Genbank或NCBI上可公开获得。短语"功能等价变体"还 应视为包括其序列因针对特定生物的密码子优化而改变的核酸。本文中核酸的"功能等价 变体"优选与经鉴定的核酸具有至少大约70%、优选大约80%、更优选大约85%、优选大约 90%、优选大约95%或更高的核酸序列同一性。
[0084] 还应当理解本发明可使用其序列不同于本文具体示例的氨基酸序列的多肽实施。 这些变体在本文中可被称为"功能等价变体"。蛋白质或肽的功能等价变体包括这样的蛋白 质或肽，即所述蛋白质或肽与经鉴定的蛋白质或肽享有至少40%、优选50%、优选60%、优 选70%、优选75%、优选80%、优选85%、优选90%、优选95%或更高的氨基酸同一性并且 具有与目的肽或蛋白质基本上相同的功能。此类变体在它们的范围内包括蛋白质或肽的片 段，其中所述片段包含截短形式的多肽，其中缺失可以是1至5、至10、至15、至20、至25个 氨基酸，并且可在多肽的任一末端处从1位残基延伸到25位残基，并且其中缺失可为所述 区域内的任何长度；或可在内部位置处。本文中具体多肽的功能等价变体还应视为包括由 其他细菌菌种中的同源基因表达的多肽，例如如先前段落中示例的。
[0085] 如本文使用的"基本上相同的功能"意指核酸或多肽能够进行它是其变体的核酸 或多肽的功能。例如，本发明的酶的变体将能够与该酶一样催化相同的反应。然而，它不应 视为意指变体具有与它是其变体的多肽或核酸相同的活性水平。
[0086] 可使用很多已知方法评价功能等价变体是否具有与它是其变体的核酸或多肽基 本上相同的功能。然而，例如，由ffligler等人（2002,J.Bacteriol. 184:2404 - 2410)或Kroeger等人（2011，Anal.Biochem. 411:100-5)概述的方法可分别用于测量丙二酰辅酶A 还原酶和乙酰辅酶A羧化酶的活性。
[0087] 当用于本发明时，"过表达"以及相似术语和短语应在广义上视为包括在相同条件 下与亲本微生物的蛋白质表达水平相比较，一种或多种蛋白质表达的任何增加。它不应视 为意指蛋白质以任何特定水平表达。
[0088] "亲本微生物"是用于生成本发明的重组微生物的微生物。亲本微生物可以是在自 然界中存在的微生物（即，野生型微生物），或已被预先修饰但不表达或不过表达本发明中 题述酶中的一种或多种的微生物。因此，本发明的重组微生物已被修饰，以表达或过表达在 亲本微生物中不表达或不过表达的一种或多种酶。
[0089] 术语核酸"构建体"或"载体"和相似术语应在广义上视为包括适合用作载体 (vehicle)以将遗传材料转移到细胞内的任何核酸（包括DNA和RNA)。该术语应视为包括 质粒、病毒（包括细菌噬菌体）、粘粒和人工染色体。构建体或载体可包括一种或多种调节 元件、复制起点、多克隆位点和/或可选择标记。在一个特定实施方案中，构建体或载体被 改造为适于允许表达由该构建体或载体编码的一种或多种基因。核酸构建体或载体包括裸 核酸以及用一种或多种试剂配制的核酸，以促进向细胞的递送（例如脂质体缀合的核酸， 包含所述核酸的生物）。
[0090] "3-HP生物合成途径"是允许下列转化的酶促途径：乙酰辅酶A至丙二酰辅酶A至 丙二酸半醛至3-HP的转化。除非上下文另有明确要求，否则提及3-HP生物合成途径中的 酶应视为包括提及该酶的任何一个或多个亚基。仅作为实例，乙酰辅酶A羧化酶可包含四 个亚基。
[0091] 微牛物
[0092] 如本文上文讨论的，本发明提供了能够通过发酵包含C0和/或C02的底物，产生 3-HP以及任选的一种或多种其他产物的重组微生物。
[0093] 在一个特定实施方案中，所述微生物被改造为适于表达3-HP生物合成途径中的 一种或多种酶（或其一个或多个亚基），所述一种或多种酶并非天然存在于用于获得该微 生物的亲本微生物中。在另一个实施方案中，所述微生物被改造为适于过表达3-HP生物合 成途径中的一种或多种酶（或其一个或多个亚基），所述一种或多种酶天然存在于亲本微 生物中。
[0094] 在一个实施方案中，所述亲本微生物能够发酵包含C0的底物，以产生乙酰辅酶A， 但不能将乙酰辅酶A转化为3-HP，并且所述重组微生物被改造为适于表达参与乙酰辅酶A 转化为3-HP的一种或多种酶（或其一个或多个亚基）。在一个实施方案中，所述亲本微生 物能够将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A，但不能将丙二酰辅酶A转化为3-HP。在另一个 实施方案中，所述亲本微生物能够将丙二酰辅酶A转化为3-HP，但不能将乙酰辅酶A转化为 丙二酰辅酶A。
[0095] 在一个实施方案中，所述3-HP生物合成中的一种或多种酶选自：丙二酰辅酶A还 原酶、乙酰辅酶A羧化酶以及其任何一种或多种的功能等价变体。
[0096] 所述微生物可被改造为适于通过很多重组方法表达或过表达一种或多种酶（或 其一个或多个亚基），所述重组方法包括例如，增加该微生物内的天然基因的表达（例如通 过引入更强的启动子或组成型启动子以驱动基因的表达），通过引入编码并被改造为适于 表达该酶的外源核酸来增加编码特定酶的基因拷贝数，引入编码并被改造为适于表达并非 天然存在于亲本微生物内的酶的外源核酸。
[0097] 在某些实施方案中，可转化所述亲本微生物，以提供所述亲本微生物天然包含的 一种或多种基因的表达增加或过表达与引入非亲本微生物天然包含的一种或多种基因的 组合。例如，编码3-HP生物合成途径中的一种或多种酶的一种或多种基因是所述亲本微 生物天然包含的，但它可能不包括编码该途径中的一种或多种其他酶的一种或多种其他基 因。所述微生物可例如被改造，以过表达天然的乙酰辅酶A羧化酶，并且引入编码用于将 丙二酰辅酶A转化为3-HP的酶（例如丙二酰辅酶A还原酶）的丙二酰辅酶A还原酶基因。 或者，所述微生物可被改造，以过表达天然的丙二酰辅酶A还原酶，并且引入编码乙酰辅酶 A羧化酶的基因。技术人员将知道在本发明中使用的多种其他组合。
[0098] 仅作为例子，丙二酰辅酶A还原酶的示例性序列信息在本文中以SEQIDNO: 1的 形式提供，并且还使用登录号YP_001636209. 1/Caur_2614,GI: 163848165在公共数据库上 提供。作为另外的例子，乙酰辅酶A羧化酶的示例性序列信息在本文中以SEQIDN0:18-21 的形式提供，并且还使用登录号NC_014328. 1-33. l/CLJU_c42100-40，GI:9447826-31和GI:163847210-11，Caur_1647-48，YP_001635254. 1-55. 1 ;GI:163849262,Caur_3739, YP_001637306. 1；GI:163848951, Caur_3421, YP_001636995. 1；GI:163846951, Caur_1378, YP_001634995. 1在公共数据库上提供。可使用天然存在的酶或合成的酶。通常，该酶与由 根据SEQ ID NO: 1或18-21的核酸编码的序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少 88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
[0099] 在本发明的微生物中使用的酶（以及编码它们的任何相应基因）可源自任何适当 来源，包括细菌的不同属和种或其他生物。然而，在一个实施方案中，丙二酰辅酶A还原酶 是源自橙色绿屈挠菌、扬氏梭菌、生金球形菌属或硫化叶菌属种的酶。在一个实施方案中， 丙二酰辅酶A还原酶具有上文示例的氨基酸序列，或它是其功能等价变体。在一个实施方 案中，乙酰辅酶A羧化酶是源自扬氏梭菌、橙色绿屈挠菌、生金球形菌属或硫化叶菌属种的 酶。在一个实施方案中，乙酰辅酶A羧化酶具有上文示例的氨基酸序列，或它是其功能等价 变体。
[0100] 丙二酰辅酶A还原酶（EC 1.2. 1.75)属于短链还原酶（SDR)组，并且可得自细 菌如绿色非硫光养细菌（绿弯菌门（Chloroflexi))橙色绿屈挠菌（YP_001636209. 1 ; AAS20429.1)、聚集绿曲挠丝状菌（Chloroflexus aggregans)(YP_002462600. 1)、 毛样颤绿菌（Oscillochloris trichoides) (WP_006561105. 1)、卡斯特玫瑰弯菌 (Roseiflexus castenholzii)(YP_001433009.1)或玫瑰弯菌属种（Roseiflexus sp. )(YP_001277512. 1)，以及a变形菌纲（alpha-proteobacteria)如赤杆菌属 种（Erythrobacter sp.)(WP_0〇7l6368〇)和如Y变形菌纲（WP_0〇9〇l9528.l、 WP_007234918. 1、WP_009021869. 1、WP_009470571. 1)，并且可得自嗜热嗜酸古细菌如泉古 头寇硫化叶菌（Crenarchaeotes Sulfolobus tokodaii)(NP_378167.1)、好客嗜酸两面 菌（Acidianus hospitalis) (YP_004459517. 1)、铜生金球形菌（Metallosphaera cuprina) (YP_004410014. 1)、勤奋生金球形菌（Metallosphaera sedula)(YP_001190808. 1)、 硫横矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus) (NP_343563. 1)、黄石生金球形菌 (Metallosphaera yellowstonensis)(WP_009071519. 1)、冰岛硫化叶菌（Sulfolobus islandicus)(YP_002844727.1;YP_002833533.1;YP_002830795.1)、嗜酸热硫化叶 菌（Sulfolobus acidocaldarius) (YP_256941. 1 ;YP_256733. 1)，以及如深处古生球菌 (Archaeoglobus profundus)(YP_003401535. 1),和Candidatus Chloracidobacterium thermophilum(YP_004863680. 1)或Caldiarchaeum subterraneum(BAJ47902. 1)。
[0101] 乙酰辅酶A羧化酶（EC1.2. 1.75)属于生物素依赖性羧化酶组，并且可得 自细菌如绿色非硫光养细菌（绿弯菌门）如橙色绿屈挠菌（YP_001635254. 1-55. 1 ; YP_001637306. 1 ;YP_001636995. 1 ;YP_001634995. 1)，或一氧化碳营养产乙酸菌如扬氏梭 菌（NC_014328. 1-33.1)。
[0102] 在一个实施方案中，该微生物包含被改造为适于增加所述亲本微生物天然包含的 一种或多种核酸的表达的一种或多种外源核酸，并且所述一种或多种核酸编码上文提及的 酶中的一种或多种（或其一个或多个亚基）。在一个实施方案中，被改造为适于增加表达的 一种或多种外源核酸是调节元件。在一个实施方案中，所述调节元件是启动子。在一个实 施方案中，启动子是优选在适当发酵条件下具有高度活性的组成型启动子。还可使用诱导 型启动子。在优选实施方案中，所述启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸转乙酰酶/ 乙酸激酶操纵子启动子。本领域技术人员应当理解可指导表达（优选在适当发酵条件下高 水平表达）的其他启动子可有效作为示例实施方案的替代物。当启动子处于使得它驱动下 游编码序列表达的位置时，它被称为可操作地连接的。
[0103]在一个实施方案中，该微生物包含编码并被改造为适于表达上文提及的酶中的一 种或多种（或其一种或多种亚基）的一种或多种外源核酸。在一个实施方案中，该微生物 包含编码并被改造为适于表达所述酶中的至少两种（或其一个或多个亚基）的一种或多种 外源核酸。
[0104]在一个特定实施方案中，该微生物包含编码丙二酰辅酶A还原酶或其功能等价变 体的一种或多种外源核酸。在一个特定实施方案中，该微生物包含编码乙酰辅酶A羧化酶 或其功能等价变体的一种或多种外源核酸。乙酰辅酶A羧化酶可由4个亚基组成，其中每 个亚基由不同基因编码。这些基因可被组合在单一核酸中或者一起编码完整酶的两种或更 多种核酸中。此外，特定亲本微生物可含有针对这些亚基中的仅一个、两个或三个的基因。 因此，本发明包含使用一种或多种外源核酸改造所述微生物，以仅表达所述亚基中的一个、 两个或三个。类似地，它包含改造微生物以过表达所述亚基中的一个或多个，如果所述基因 是所述微生物天然包含的。还设想了天然亚基基因的过表达和任何缺失亚基基因的引入的 组合。
[0105]在一个实施方案中，丙二酰辅酶A还原酶是由包含SEQIDNO: 1的核酸或其功能 等价变体编码。在一个实施方案中，乙酰辅酶A羧化酶是由包含SEQIDN0:18、19、20和21 的一种或多种核酸或者其中任何一种或多种的功能等价变体编码。或者，该酶可由如可公 开获得的数据库中所述的核酸序列编码，例如上文所列出的。
[0106]该微生物可包含一种或多种外源核酸。当希望用两种或更多种遗传元件（例如基 因或调节元件（例如启动子））转化亲本微生物时，它们可被包含在一种或多种外源核酸 上。
[0107]在一个实施方案中，所述一种或多种外源核酸是编码上文提及的酶中的一种或多 种的任何组合的核酸构建体或载体（在一个特定实施方案中，是质粒）。
[0108]所述外源核酸在转化亲本微生物后可保留在染色体外或可整合到亲本微生物的 基因组内。因此，它们可包括另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列被改造为适于协助 整合（例如，允许同源重组和靶向整合到宿主基因组内的区域）或染色体外构建体的表达 和复制（例如复制起点、启动子和其他调节元件或序列）。
[0109]在一个实施方案中，编码如本文上文提及的一种或多种酶（或其一个或多个亚 基）的外源核酸还将包含被改造为适于促进由外源核酸编码的一种或多种酶的表达的启 动子。在一个实施方案中，所述启动子是优选在适当发酵条件下具有高度活性的组成型启 动子。还可使用诱导型启动子。在优选实施方案中，所述启动子选自Wood-Ljungdahl基因 簇和磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子。本领域技术人员应当理解可指导表达（优选在适当 发酵条件下高水平表达）的其他启动子有效作为示例实施方案的替代物。
[0110] 在一个实施方案中，外源核酸是表达质粒。
[0111] 在一个实施方案中，亲本微生物选自厌氧产乙酸菌。
[0112] 在一个特定实施方案中，所述亲本微生物选自一氧化碳营养产乙酸细菌。在某 些实施方案中，该微生物选自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食羰基化物梭菌、德氏 梭菌、粪味梭菌、乙酸梭菌、蚁酸乙酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏乙酸杆菌、巴氏 嗜碱菌、Blautiaproducta、游泥真杆菌、热乙酸穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、 Sporomusasilvacetica、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧菌。
[0113] 在一个特定实施方案中，所述亲本微生物选自产乙醇、产乙酸梭菌，包括以 下种：自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和拉氏梭菌以及相关分离物。这些包括但不限于下述 菌株：自产乙醇梭菌JAI_1T(DSM10061)[AbriniJ，NaveauH，NynsE-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov. ,ananaerobicbacteriumthatproducesethanolfrom carbonmonoxide.ArchMicrobiol1994, 4:345-351]，自产乙醇梭菌LBS1560 (DSM19630) [SimpsonSD，ForsterRL，TranPT,RoweMJ,WarnerIL:Novelbacteriaandmethods thereof.国际专利 2009,W0/2009/064200]，自产乙醇梭菌LBS1561 (DSM23693)，杨氏梭菌 PETCt(DSM13528 =ATCC55383)[TannerRS,MillerLM,YangD:Clostridium. 1jungdahlii sp.nov.,anAcetogenicSpeciesinClostridialrRNAHomologyGroupI.IntJSyst Bacteriol1993,43:232-236]，杨氏梭菌ERI-2(ATCC55380)[GaddyJL:Clostridium stainwhichproducesaceticacidfromwastegases.美国专利 1997, 5, 593, 886]， 杨氏梭菌C_01(ATCC55988)[GaddyJL，ClausenEC，KoC_W:Microbialprocessfor thepreparationofaceticacidaswellassolventforitsextractionfrom thefermentationbroth?美国专利，2002,6,368,819]，杨氏梭菌 0-52(ATCC55989) [GaddyJL，ClausenEC,KoC-W:Microbialprocessforthepreparationofacetic acidaswellassolventforitsextractionfromthefermentationbroth.美 国专利，2002,6,368,819]，拉氏梭菌P11t(ATCCBAA-622)[HuhnkeRL，LewisRS，Tanner RS:IsolationandCharacterizationofnovelClostridialSpecies.国际专利 2008， TO2008/028055]，相关分离物例如 "C.coskatii"[Zahnetal-Novelethanologenic speciesClostridiumcoskatii(美国专利申请号US20110229947)]和"梭菌属种"(Tyurin etal.，2012,J.BiotechRes. 4:1-12)，或突变株例如拉氏梭菌 0TA-1 (Tirado-Acevedo 0.ProductionofBioethanolfromSynthesisGasUsingClostridium1jungdahlii. PhDthesis，北卡罗莱纳州立大学，2010)。这些菌株在梭菌rRNA簇I内形成亚簇，并且它 们的16SrRNA基因超过99%相同，具有相似的约30%的低GC含量。然而，DNA-DNA重新组 合和DNA指纹实验显不这些菌株属于种[HuhnkeRL，LewisRS，TannerRS:Isolationand CharacterizationofnovelClostridialSpecies?国际专利 2008,TO2008/028055]。
[0114] 该簇的所有种均具有相似的形态和大小（对数生长的细胞为0.5-0. 7x3-5um)， 是嗜温的（最适生长温度为30-37 °C)和严格厌氧菌[TannerRS^illerLM，Yang D:Clostridium1jungdahliisp.nov. ,anAcetogenicSpeciesinClostridialrRNA HomologyGroupI.IntJSystBacteriol1993, 43:232-236；AbriniJ,NaveauH,Nyns E-J:Clostridiumautoethanogenum,sp.nov. ,ananaerobicbacteriumthatproduces ethanolfromcarbonmonoxide.ArchMicrobiol1994,4:345-351;HuhnkeRL,Lewis RS，TannerRS:IsolationandCharacterizationofnovelClostridialSpecies. 国际专利2008,W0 2008/028055]。此外，它们均共享相同的主要的系统发育性状，例 如相同的pH范围（pH4-7. 5,最适起始pH为5. 5-6)，以含CO气体的强自养生长并伴 随相似的生长速率，和以乙醇和乙酸作为主要发酵终产物的相似的代谢谱，以及在某些 条件下形成少量的2,3-丁二醇和乳酸。[131111611^，]\1；[1161'111，￥31^0:(]1〇81：1'1(1；[11111 1jungdahliisp.nov. ,anAcetogenicSpeciesinClostridialrRNAHomologyGroup I.IntJSystBacteriol1993, 43:232-236；AbriniJ,NaveauH,NynsE-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov. ,ananaerobicbacteriumthatproducesethanolfrom carbonmonoxide.ArchMicrobiol1994, 4:345-351;HuhnkeRL,LewisRS,Tanner RS:IsolationandCharacterizationofnovelClostridialSpecies.国际专利 2008, W02008/028055]。对于所有三个种还观察到吲哚产生。然而，所述种的区别在于多种糖（例 如鼠李糖、阿拉伯糖）、酸（例如葡糖酸、柠檬酸）、氨基酸（例如精氨酸、组氨酸）或其他底 物（例如甜菜碱、丁醇）的底物利用。此外，发现一些种对于某些维生素（例如硫胺素、生 物素）是营养缺陷型的，而其他种则不是。
[0115] 在一个实施方案中，所述亲本菌株使用C0作为其唯一碳源和能源。
[0116] 在一个实施方案中，所述亲本微生物是自产乙醇梭菌或扬氏梭菌。在一个特定实 施方案中，所述微生物是自产乙醇梭菌DSM23693。在另一个特定实施方案中，所述微生物是 扬氏梭菌DSM13528 (或ATCC55383)。
[0117] 在一个实施方案中，所述亲本微生物缺乏编码丙二酰辅酶A还原酶或乙酰辅酶A 羧化酶（或其一个或多个亚基）的一种或多种基因。
[0118] 核酸
[0119] 本发明还提供了用于生成本发明的重组微生物的核酸和核酸构建体。
[0120] 在一个实施方案中，所述核酸包含编码3-HP生物合成途径中的一种或多种酶（或 其一个或多个亚基）的一种或多种序列，当在微生物中表达时，其允许该微生物通过发酵 包含C0和/或C02的底物产生3-HP。在一个特定实施方案中，本发明提供了编码两种或更 多种酶（或其一个或多个亚基）的核酸，当在微生物中表达时，其允许该微生物通过发酵包 含C0和/或C02的底物产生3-HP。
[0121] 在一个特定实施方案中，该酶选自丙二酰辅酶A还原酶、乙酰辅酶A羧化酶以及其 中任何一种或多种的功能等价变体。
[0122] 在一个实施方案中，本发明的核酸以任何次序包含编码丙二酰辅酶A还原酶、乙 酰辅酶A羧化酶或其中任何一种或多种的功能等价变体的一种或多种核酸序列。
[0123] 在一个实施方案中，本发明的核酸以任何次序包含编码乙酰辅酶A羧化酶的一个 或多个亚基或其中任何一种或多种的功能等价变体的一种或多种核酸序列。
[0124] 编码上述酶中每一种的示例性氨基酸序列和核酸序列在本文中提供，或者可获自 如上文提及的GenBank。然而，考虑到在本文中、在GenBank及其他数据库中所含有的信息 和遗传密码，技术人员应当容易地知道编码所述酶或其功能等价变体的可替代核酸序列。
[0125] 在一个实施方案中，丙二酰辅酶A还原酶具有如上文描述的序列或是其功能等价 变体。
[0126] 在一个实施方案中，编码乙酰辅酶A羧化酶的核酸序列具有如上文描述的序列或 是其功能等价变体。
[0127] 在一个实施方案中，本发明的核酸还包含启动子。在一个实施方案中，所述启动子 允许所述基因在其控制下的组成型表达。然而，还可采用诱导型启动子。技术人员应当容易 地知道用于本发明的启动子。优选地，启动子可指导在适当发酵条件下的高水平表达。在 特定实施方案中，使用Wood-Ljungdahl簇启动子。在另一个实施方案中，使用磷酸转乙酰 酶/乙酸激酶启动子。在另一个实施方案中，使用丙酮酸盐：铁氧还蛋白氧化还原酶启动 子、Rnf复合体操纵子启动子或ATP合酶操纵子启动子。在一个特定实施方案中，所述启动 子来自自产乙醇梭菌。
[0128] 本发明的核酸在转化亲本微生物后可保留在染色体外或可被改造为适于整合到 所述微生物的基因组内。因此，本发明的核酸可包括另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸 序列被改造为适于协助整合（例如，允许同源重组和靶向整合到宿主基因组内的区域）或 染色体外构建体的稳定表达和复制（例如复制起点、启动子和其他调节序列）。
[0129] 在一个实施方案中，所述核酸是核酸构建体或载体。在一个特定实施方案中，所述 核酸构建体或载体是表达构建体或载体，然而，本发明包含其他构建体和载体例如用于克 隆的那些。在一个特定实施方案中，所述表达构建体或载体是质粒。
[0130] 应当理解，出所述启动子外，本发明的表达构建体/载体还可包含任意数目的调 节元件，以及需要时适合于表达其他蛋白质的另外的基因。在一个实施方案中，所述表达构 建体/载体包括一个启动子。在另一个实施方案中，所述表达构建体/载体包括两个或更 多个启动子。在一个特定实施方案中，对于待表达的每种基因，所述表达构建体/载体包括 一个启动子。在一个实施方案中，所述表达构建体/载体包括一个或多个核糖体结合位点， 优选用于每种待表达基因的核糖体结合位点。
[0131] 本领域技术人员应当理解本文描述的核酸序列和构建体/载体序列可含有标准 接头核苷酸，例如核糖体结合位点和/或限制性位点所需的那些接头核苷酸。此类接头序 列不应解释为是必需的并且不对所定义的序列产生限制。
[0132] 本发明的核酸和核酸构建体，包括表达构建体/载体，可使用任意数目的本领域 中已知的技术进行构建。例如，可使用化学合成或重组技术。此类技术记载于例如Sambrook etal(MolecularCloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratory Press,ColdSpringHarbor,NY, 1989)。进一步的示例性技术记载于在下文实施例部分中。 基本上，各个基因和调节元件彼此可操作地连接，使得可表达所述基因以形成所需蛋白质。 本领域普通技术人员应当理解用于本发明的合适载体。然而，例如，下述载体可以是合适 的：PMTL80000载体、pMPl、pJIR750以及下文实施例部分中示例的质粒。
[0133] 应当理解本发明的核酸可采取任何适当的形式，包括RNA、DNA或cDNA。
[0134] 本发明还提供了包含本文描述的核酸中的任何一种或多种的宿主生物，特别是微 生物，并且包括病毒、细菌和酵母。
[0135] 所述一种或多种外源核酸可作为裸核酸递送至亲本微生物，或可用一种或多种试 剂配制以促进转化过程（例如脂质体缀合的核酸，其中包含核酸的生物）。适当时，所述一 种或多种核酸可以是DNA、RNA或其组合。限制性抑制剂可用于某些实施方案中；参见例如 Murray,N.E.etal. (2000)Microbial.Molec.Biol.Rev. 64, 412. ) 〇
[0136] 可使用任何数目的本领域中已知的用于产生重组微生物的技术，由亲本微生物和 一种或多种外源核酸制备本发明的微生物。仅作为实例，转化（包括转导或转染）可通过 电穿孔、超声处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态或者缀合来实现。合适的转化 技术记载于例如SambrookJ，FritschEF，ManiatisT:MolecularCloning:Alaboratory Manual,ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour, 1989 中。
[0137] 在某些实施方案中，由于待转化的微生物中有活性的限制系统，必须甲基化待引 入微生物内的核酸。这可使用多种技术包括下文描述的技术来完成，并且在下文实施例部 分中进一步示例。
[0138] 例如，在一个实施方案中，本发明的重组微生物是通过包括下述步骤的方法产生： 将下述引入穿梭微生物内：（i)如本文描述的表达构建体/载体，和（ii)包含甲基转移酶 基因的甲基化构建体/载体；表达甲基转移酶基因；从穿梭微生物中分离一种或多种构建 体/载体；以及将一种或多种构建体/载体引入目的微生物内。
[0139] 在一个实施方案中，步骤B的甲基转移酶基因是组成型地表达的。在另一个实施 方案中，步骤B的甲基转移酶基因的表达是被诱导的。
[0140] 所述穿梭微生物是促进对构成所述表达构建体/载体的核酸序列的甲基化的微 生物，优选是限制性阴性微生物。在特定实施方案中，所述穿梭微生物是限制性阴性大肠杆 菌（E.coli)、枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis)或乳酸乳球菌（Lactococcuslactis)。
[0141] 甲基化构建体/载体包含编码甲基转移酶的核酸序列。
[0142] -旦将表达构建体/载体和甲基化构建体/载体引入穿梭微生物内，就诱导甲基 化构建体/载体上存在的甲基转移酶基因。诱导可以是通过任何合适的启动子系统，尽管 在本发明的一个特定实施方案中，甲基化构建体/载体包含诱导型lac启动子，并且是通过 添加乳糖或其类似物，更优选异丙基-P-D-硫代半乳糖苷（IPTG)进行诱导。其他合适的 启动子包括ara、tet或17系统。在本发明的另一个实施方案中，甲基化构建体/载体启动 子是组成型启动子。
[0143] 在一个特定实施方案中，所述甲基化构建体/载体具有特异性针对所述穿梭微生 物的种类的复制起点，使得所述甲基化构建体/载体上存在的任何基因在所述穿梭微生物 中表达。优选地，所述表达构建体/载体具有特异性针对目的微生物的种类的复制起点，使 得所述表达构建体/载体上存在的任何基因在目的微生物中表达。
[0144] 甲基转移酶的表达导致所述表达构建体/载体上存在的基因的甲基化。根据许多 已知方法中的任何一种，随后可从所述穿梭微生物中分离所述表达构建体/载体。仅作为 实例，下文描述的实施例部分中所述的方法可用于分离表达构建体/载体。
[0145] 在一个特定实施方案中，两种构建体/载体被同时分离。
[0146] 可使用任意数目的已知方法将所述表达构建体/载体引入所述目的微生物内。然 而，例如，可使用下文实施例部分中所述的方法。因为所述表达构建体/载体是甲基化的， 所以所述表达构建体/载体上存在的核酸序列能够被纳入目的微生物内并成功表达。
[0147] 应想到可将甲基转移酶基因引入穿梭微生物内并过表达。因此，在一个实施方案 中，所得的甲基转移酶可使用已知方法收集，并且在体外用于甲基化表达质粒。随后可将 所述表达构建体/载体引入目的微生物内用于表达。在另一个实施方案中，将所述甲基转 移酶基因引入穿梭微生物的基因组内，随后将所述表达构建体/载体引入所述穿梭微生物 内，从所述穿梭微生物中分离一种或多种构建体/载体,并且随后将所述表达构建体/载体 引入所述目的微生物内。
[0148] 应想到可组合如上定义的所述表达构建体/载体和所述甲基化构建体/载体，以 提供物质的组合物。此类组合物在避开限制性障碍机制以产生本发明的重组微生物中特别 有用。
[0149] 在一个特定实施方案中，所述表达构建体/载体和/或所述甲基化构建体/载体 是质粒。
[0150] 本领域普通技术人员应当理解用于产生本发明的微生物的许多合适的甲基转移 酶。然而，例如，可使用枯草芽孢杆菌噬菌体OT1甲基转移酶和下文实施例中所述的甲基 转移酶。在一个实施方案中，所述甲基转移酶具有SEQIDN0:6的氨基酸序列，或是其功能 等价变体。考虑到所需甲基转移酶的序列和遗传密码，编码合适甲基转移酶的核酸是容易 想到的。在一个实施方案中，编码甲基转移酶的核酸是如下文实施例中所述（例如SEQID NO:26的核酸，或它是其功能等价变体）。
[0151] 被改造为适于允许甲基转移酶基因表达的任意数目的构建体/载体均可用于生 成所述甲基化构建体/载体。然而，例如，可使用下文实施例部分中所述的质粒（例如，SEQ IDN0:7)。
[0152] 牛产方法
[0153] 本发明提供了通过包括使用本发明的重组微生物发酵包含C0和/或C02的底物 的微生物发酵，用于生产3-HP以及任选的一种或多种其他产物的方法。优选地，3-HP是主 要发酵产物。本发明的方法可用于减少来自工业过程的总大气碳排放。
[0154] 优选地，所述发酵包括使用本发明的重组微生物厌氧发酵生物反应器中的底物以 至少产生3-HP的步骤。
[0155] 在一个实施方案中，该方法包括下述步骤：
[0156] (a)向含有本发明的一种或多种微生物的培养物的生物反应器中提供包含C0和/ 或〇)2的底物；和
[0157] (b)厌氧发酵生物反应器中的培养物，以至少产生3-HP。
[0158] 在一个实施方案中，该方法包括下述步骤：
[0159] (a)在因工业过程产生的含C0和/或0)2气体释放到大气中之前，捕获所述气体；
[0160] (b)通过含有本发明的一种或多种微生物的培养物厌氧发酵所述含C0和/或C02 气体，以至少产生3-HP。
[0161] 在一个实施方案中，底物包含C0。在一个实施方案中，底物包含C0和C02。在另 一个实施方案中，底物包含〇)2和h2。在另一个实施方案中，底物包含〇)2和C0以及h2。
[0162] 在本发明的一个特定实施方案中，由微生物发酵的气态底物是含有C0的气态底 物。所述气态底物可以是作为工业过程的副产物而获得的含C0废气，或来自一些其他来源 例如来自汽车尾气。在某些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品制造例如钢铁厂、非 铁产品制造、石油精炼过程、煤炭气化、电力生产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。 在这些实施方案中，可在含C0气体被排放到大气中之前，使用任何方便的方法从所述工业 过程中将其捕获。C0可以是合成气（包含一氧化碳和氢的气体）的组分。由工业过程产生 的C0通常被燃烧掉以产生co2，因此本发明可特别用于减少co2温室气体排放并产生用作 生物燃料的丁醇。取决于含C0的气态底物的组成，可能还需要在将其引入发酵之前对其进 行处理，以去除任何不需要的杂质例如尘粒。例如，可使用已知方法对气态底物进行过滤或 洗漆。
[0163] 在本发明的特定实施方案中，由微生物发酵的气态底物是包含0)2和112的气态底 物。所述含co2/H2底物可以是作为工业过程的副产物而获得的废气。在某些实施方案中，所 述工业过程选自氢生产。在某些实施方案中，所述包含(30 2和H2的气态底物可以是混合气 流，其中将源自一种或多种工业过程的气流的至少一部分与至少一部分〇) 2或112混合，以优 化所述气态底物的co2:H2比例。这对于富含〇)2或112的工业气流而言可以是特别有益的。 产生可以用作〇) 2和h2底物或〇)2和112混合底物的来源的副产物气流的工业过程的实例包 括焦炭制造、精炼过程、氨生产过程、甲醇生产过程、乙酸生产、天然气精炼厂和发电厂。
[0164] 应当理解，为了发生细菌生长以及气体至包含3-HP的产物的转化，需要将合适的 液体营养培养基与含C0和/或〇)2的底物气体进料给生物反应器。所述底物和培养基可 以连续、分批或分批补料的形式进料给生物反应器。营养培养基含有足以允许使所用的微 生物生长的维生素和矿物质。适合于使用C0和/或co2发酵以产生一种或多种产物的厌 氧培养基是本领域中已知的。例如，合适的培养基记载于Biebel(2001)中。在本发明的一 个实施方案中，所述培养基是如下文实施例部分中所述。
[0165] 需要在发生支持所述气体至包含3-HP的产物的转化的发酵的适当条件下进行发 酵。应考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电 位、搅拌速度（如果使用连续搅拌釜式反应器）、接种物水平、确保液相中的C0和/或C02 不变成限制性的最大气体底物浓度以及避免产物抑制的最大产物浓度。
[0166] 此外，通常需要增加底物流的C0和/或C02浓度（或气态底物中的C0和/或C02 分压），并且因此增加其中C0和/或co2是底物的发酵反应的效率。在增加的压力下的操 作允许C0和/或C02从气相转移至液相的速率得到显著提高，其中C0和/或C0 2可被微生 物作为碳源摄取，以生产包含3-HP的产物。这又意味着当将生物反应器保持在高压而不是 大气压力下时，可减少保留时间（被定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速）。 最佳反应条件将部分取决于所用的本发明的具体微生物。然而，一般而言，优选在高于大气 压的压力下进行发酵。同样，因为给定的C0和/或C02到至少3-HP的转化率在某种程度上 是底物保留时间的函数，而且实现所需的保留时间又决定了所需的生物反应器体积，所以 加压系统的使用可极大地减少所需的生物反应器体积，从而减少发酵设备的资金成本。根 据美国专利第5, 593, 886号中给出的实施例，反应器体积可与反应器操作压力的增加成线 性比例地减小，即在10个大气压下操作的生物反应器只需为在1个大气压下操作的生物反 应器体积的十分之一。
[0167] 例如，在高压下进行气体至乙醇发酵的益处已有记载。例如，W002/08438描述了 在30psig和75psig的压力下进行的气体至乙醇的发酵，分别提供150g/l/天和369g/l/ 天的乙醇生产率。然而，发现在大气压下使用类似的培养基和输入气体组合物进行的示例 发酵每天每升产生1/10至1/20的乙醇。
[0168] 还期望含C0和/或C02气态底物的引入速率能够确保液相中的C0和/或C0 2浓 度不变成限制性的。这是因为C0和/或〇)2受限的条件的后果可能是一种或多种产物被 培养物消耗。
[0169] 用于进料给发酵反应的气流的组成可对该反应的效率和/或成本具有显著影响。 例如，〇 2可降低厌氧发酵过程的效率。在发酵前或发酵后的发酵过程各阶段中处理不需要 或不必要的气体可增加对此类阶段的负担（对于包含其中气流在进入生物反应器前被压 缩的产物，不必要的能量被用于压缩在发酵中不需要的气体）。因此，可能需要处理底物流， 特别是源自工业源的底物流，以去除不需要的组分并增加所需组分的浓度。
[0170] 在某些实施方案中，将本发明的细菌培养物维持在水性培养基中。优选地，水性培 养基是最低厌氧微生物生长培养基。合适的培养基是本领域已知的，并且例如在美国专利 第5, 173, 429号和第5, 593, 886号以及W0 02/08438中有描述，以及如本文下文实施例部 分中所述。
[0171] 3-HP，或含有3-HP和/或一种或多种其他产物的混合流，可通过本领域中已知的 方法从发酵液中回收，所述方法例如分馏或蒸发、渗透蒸发、汽提和萃取发酵，包括例如液 液萃取。
[0172] 在本发明的某些优选实施方案中，3-HP和一种或多种产物通过下述方法从发酵液 中回收：从生物反应器中连续移出发酵液的一部分，从发酵液中分离微生物细胞（方便地 通过过滤），并且从发酵液中回收一种或多种产物。醇类可方便地例如通过蒸馏进行回收。 丙酮可例如通过蒸馏进行回收。所产生的任何酸类均可例如通过吸附在活性炭上进行回 收。优选地将分离的微生物细胞送回至发酵生物反应器。还优选地将已移出任何醇和酸后 剩余的无细胞渗透物送回至发酵生物反应器。可向无细胞渗透物中添加另外的营养素（例 如B族维生素），以在将营养培养基送回至生物反应器之前补充所述营养培养基。
[0173] 此外，如果如上所述调整发酵液的pH以增强乙酸至活性炭的吸附，则在将所述发 酵液送回生物反应器前，应将pH重新调整至与发酵生物反应器中的发酵液相似的pH。
[0174] 可使用任何适当的方法包括但不限于渗透蒸发、反渗透和液液萃取技术，在发酵 后回收3-HP。
[0175]实施例
[0176] 现在将参考下述非限制性实施例更详细地描述本发明。
[0177] 实施例1
[0178] 组合两种(1)2固定途径，产乙酸菌的线性Wood-Ljungdahl途径以及在绿色非硫细 菌和古细菌中发现的3-HP循环（Thauer，2007,Science, 318:1732-33)，以获得朝向平台化 学品3-羟基丙酸盐（3-HP)的可持续途径。该途径允许将3个C0或0)2分子固定到一个 3-HP分子内。选择一氧化碳营养产乙酸生物自产乙醇梭菌，并且用来自非硫光合作用菌橙 色绿屈挠菌的执行起始〇) 2固定步骤的基因进行代谢改造（图1)。
[0179] -氧化碳营养产乙酸菌例如自产乙醇梭菌或扬氏梭菌能够通过固定两个C0或C02 分子并且使它们融合以形成乙酰辅酶A来自养生长。非硫光合作用细菌例如橙色绿屈挠菌 能够在循环过程中固定C02。它们使用乙酰辅酶A作为起点，并将其融合到通过乙酰辅酶A 羧化酶(EC. 6. 4. 1. 2)催化的ATP依赖性步骤中以形成丙二酰辅酶A，所述丙二酰辅酶A随 后可通过丙二酰辅酶A还原酶（EC1. 2. 1. 75)的作用被还原为3-HP，即该循环的中心中间 产物（Huegleretal，2002，J.Bacteriol.l84:2404-10)。将丙二酰辅酶A还原酶基因，酶 (GI: 163848165,Caur_2614 ;YP_001636209. 1)引入一氧化碳营养生物内，以形成将三个C0 或C02分子固定到3-HP内的新代谢途径。经鉴定，乙酰辅酶A羧化酶已作为脂肪酸生物合成 的一部分存在于宿主生物内（自产乙醇梭菌：SEQIDN0:18-21 ;扬氏梭菌：CLJU_c42100-4 0,GI: 9447826-31，NC_014328. 1-33. 1)，但除必需的丙二酰辅酶A还原酶之外，还可引入橙 色绿屈挠菌乙酰辅酶A羧化酶（GI: 163847210-11，Caur_1647-48，YP_001635254. 1-55. 1 ; GI:163849262,Caur_3739,YP_001637306. 1 ；GI:163848951,Caur_3421,YP_001636995. 1 ；GI: 163846951,Caur_1378,YP_001634995. 1) 〇
[0180]材料与方法
[0181] 微牛物和牛长备件
[0182] 自产乙醇梭菌DSM23693是源自DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心（The GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures),Inhoffenstra旦e7 B, 38124Braunschweig，德国）的自产乙醇梭菌DSM10061的衍生物。
[0183]大肠杆菌XLl-BlueMRF'Kan购自Stratagene(SantaClara，CA95051_7201，USA)。
[0184] 将大肠杆菌在好氧条件下培养，而所有其他菌株均在血清瓶中的50ml液体培养 基中以果糖（异养生长）或在顶空中以30psi含C0钢铁厂气体（收集自Glenbrook，NZ的 NewZealandSteel场所；组成：44%C0、32%N2、22%C02、2%H2)(自养生长）严格厌氧地 生长。
[0185] 根据表1-3中给出的配方，使用标准厌氧技术（HungateRE:Arolltubemethod forcultivationofstrictanaerobes,inNorrisJRandRibbonsDff(eds. ),Methods inMicrobiology,vol. 3B.AcademicPress,NewYork, 1969:117-132；ffolfeRS:Microbial formationofmethane.AdvMicrobPhysiol1971,6:107-146)制备培养基。对于固体培 养基，加入 1. 2%Bacto琼脂（BD,FranktonLakes,NJ07417,USA)。
[0186] 除非另有说明，所有菌株均在37°C下生长。
[0187] 表1 :PETC_MES培养基（自产乙醇梭菌pH5. 6)

【权利要求】
1. 一种用于将CO和/或CO 2转化成3-羟基丙酸盐（3-HP)的方法，所述方法包括： 将含C0和/或含C02的气态底物传送至含有在培养基中的一氧化碳营养产乙酸细菌 的培养物的生物反应器，使得所述细菌将C0和/或C02转化为3-HP，和 从所述生物反应器中回收3-HP， 其中所述一氧化碳营养产乙酸细菌被遗传改造为表达丙二酰辅酶A还原酶。
2. 经分离的、遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌，其包含编码丙二酰辅酶A还原酶 的核酸，由此所述细菌表达丙二酰辅酶A还原酶，并且所述细菌能够将三个C0或0)2分子 固定到一个3-羟基丙酸盐（3-HP)分子内。
3. 根据权利要求2所述的经分离的、遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌，其还包含 编码来自非硫、光合作用细菌的乙酰辅酶A羧化酶的核酸，其中所述核酸与启动子可操作 地连接。
4. 根据权利要求2所述的经分离的、遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌，其选自自 产乙酉享梭菌（Clostridium autoethanogenum)、扬氏梭菌（Clostridium 1 jungdahlii)、拉 氏梭菌（Clostridium ragsdalei)、食撰基化物梭菌（Clostridium carboxidivorans)、 德氏梭菌（Clostridium drakei)、奠味梭菌（Clostridium scatologenes)、乙酸梭 菌(Clostridium aceticum)、虫义酸乙酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、大梭 菌（Clostridium magnum)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum) > 伍氏乙酸杆菌（Acetobacterium woodii)、巴氏嗜喊菌（Alkalibaculum bacchii)、 Blautia producta、游泥真杆菌（Eubacterium limosum)、热乙酸穆尔氏菌（Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌（Moorella thermautotrophica)、卵形鼠抱菌 (Sporomusa ovata)、Sporomusa silvacetica、球形鼠抱菌（Sporomusa sphaeroides)、普 氏产醋杆菌（Oxobacter pfennigii)和凯伍热厌氧菌（Thermoanaerobacter kiuvi)。
5. 根据权利要求4所述的经分离的、遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌，其为选自 扬氏梭菌和自产乙醇梭菌的梭菌属种。
6. 根据权利要求3所述的经分离的、遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌，其中所 述非硫、光合作用细菌选自扬氏梭菌、生金球形菌属（Metallosphaera)和硫化叶菌属 (Sulfolobus)种。
7. 根据权利要求3所述的经分离的、遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌，其中所述 非硫、光合作用细菌是橙色绿屈挠菌（Chloroflexus auranticus)。
8. 根据权利要求2所述的经分离的、遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌，其中所述 编码丙二酰辅酶A还原酶的核酸已进行了密码子优化。
9. 一种培养根据权利要求2所述的经分离的、遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌 的方法，其包括使所述细菌在包含气态碳源的培养基中生长，其中所述碳源包含C0和/或 C02。
10. -种培养根据权利要求2所述的经分离的、遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌 的方法，其包括使所述细菌在包含能源的培养基中生长，其中所述能源包含C0和/或C02。
11. 根据权利要求9或10所述的方法，其中所述培养是严格厌氧的。
12. 根据权利要求9或10所述的方法，其中所述碳源包含工业废弃产物或废气。
13. 根据权利要求9或10所述的方法，其中所述细菌还包含编码来自非硫、光合作用细 菌的乙酰辅酶A羧化酶的外源核酸，其中所述核酸与启动子可操作地连接。
14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述丙二酰辅酶A还原酶来自非硫、光合作用细 菌。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述丙二酰辅酶A还原酶来自橙色绿屈挠菌。
16. 根据权利要求2所述的经分离的、遗传改造的一氧化碳营养产乙酸细菌，其中所述 丙二酰辅酶A还原酶与由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少85%相同。
【文档编号】C12N15/53GK104508136SQ201380040793
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年5月30日 优先权日:2012年5月30日
【发明者】陈铱婷, M·科普克 申请人:新西兰郎泽科技公司