水稻金属硫蛋白基因OsMT-1-2a的原核表达载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种水稻金属硫蛋白基因OsMT-1-2a的原核表达载体及其应用，该载体含有水稻OsMT-1-2a蛋白基因、T7启动子和终止子、核糖体结合位点RBS、His标签，OsMT-1-2a基因的上游为启动子，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列。获得的体外表达蛋白Pet-32A-OsMT-1-2a具有较强的清除超氧根离子和羟自由基的能力，为OsMT-1-2a在清除活性氧方面的功能及作用提供了可行途径，今后可通过基因工程的策略来提高OsMT-1-2a蛋白在植物体内的活性水平，以此来提高植物的抗逆性。
【专利说明】水稻金属硫蛋白基因OslH-1-2a的原核表达载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及水稻金属硫蛋白基因OsMT+2a的原核表达载体及其应用，属于基因工程领域。
【背景技术】
[0002]植物的生长发育需要合适的外在条件，当温度、湿度、水分、盐浓度等发生急剧变化，或大气污染、紫外线辐射、农药及病原体等作用于植物时，会使植物体内产生大量的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS),导致氧化胁迫反应。
[0003]植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促系统。酶促系统包括超氧化物歧化酶(S0D)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和过氧化物酶(POD)等。非酶类系统包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮等抗氧化剂。
[0004]大量的研究表明，诱导细胞内抗氧化机制可增加植物抗活性氧的能力，S0D、APX、CAT、GR、DHAR、GST和GPX的过量表达可有效清除植株体内的ROS水平，从而提高多种作物对非生物胁迫的抗性。
[0005]金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于生物体内的低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。植物金属硫蛋白由于其具有结合重金属离子(如&12+、2112+、0(12+、?132 +等)的能力，因此被认为在解除重金属离子毒害使植物免受氧化损伤方面起重要作用。
[0006]MT除对重金属具有解毒作用外，其在ROS的清除中也发挥着一定的作用。研究发现，甜瓜中对羟自由基的清除能力非常显著，棉花过表达植株不易遭受氧化胁迫，对双氧水和羟自由基具有明显的清除效果，水稻0sMT2b的RNAi植株会出现ROS水平异常累积，表皮细胞不正常死亡，体外表达的水稻0sMT-l-4b重组蛋白具有明显清除氧羟自由基和超氧根离子能力。
[0007]水稻基因组中共有11个金属硫蛋白基因，除0sMT2b和OsMT-Hb外，其它9个 基因否具有ROS清除能力并不清楚，我们在前期的研究中发现，在水稻ROS累积的突变
体0smad3中，与OsMT-Hb相似，另一个金属硫蛋白基因0sMT+2a (0s0101g49800)的表达量也明显下降，但是否具有清除ROS的能力并不清楚。
[0008]进一步通过相关实验证实0sMT+2ei在ROS清除中的作用后，可利用基因工程的策略来提高0sMT-l-2a在植物体内的活性水平以此来提高植物的抗逆性。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供水稻金属硫蛋白基因的原核表达载体，一种能产生金属硫蛋白的原核表达载体，该载体含有水稻0sMT+2a蛋白基因、T7启动子和终止子、核糖体结合位点RBS、His标签，OsMT-1~2a基因的上游为启动子，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列。[0010]本发明的另一目的是将水稻金属硫蛋白基因OsMT-1-2a的原核表达载体?et-?,2k-0sMT-l-2a应用于清除氧羟自由基和超氧根离子。
[0011]为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案:
1、水稻金属硫蛋白基因OsMT+2a的原核表达载体的构建:
1)根据GenBank上发表的OsMT-l_2a全长基因序列,设计如下特异性引物:
OsMT-1-2a_Y: GAATTCatgtcgtgctgcggaggaaactg
OsMT-1^a-V: CTCGAGcttgccgcagttgcaggggttgc
引物含有限制性内切酶I识别位点，含有限制性内切酶沿ο I识别位点；
2)从水稻花中提取RNA，并以RNA为模板用反转录酶合成cDNA，再以水稻花cDNA为模板，采用步骤I)中设计的特异引物，在PCR扩增体系中对基因的cDNA进行扩增，回收纯化基因片段，并将其连接到克隆载体pMD18-T上，通过酶切鉴定及序列测定验证获得克隆载体pMD18-fls#7W-2a ；
3)使用EcoRI和ZAo I对质粒pMD18-fls#7W-2a进行双酶切获得OsMT-1_2a基因片段，将其与经过同样双酶切的原核表达载体Pet-32A相连接，转化后抽提质粒进行酶切鉴定，进一步通过序列测定验证获得Pet-32A-0sMT-l_2a原核重组表达载体。
[0012]2、水稻金属硫蛋白基因0sMT-l_2a蛋白的`原核表达
使用热刺激法将MHOsMT-1-2a转入大肠杆菌现(DE3)中，在终浓度ImM IPTG下进行诱导表达；
3、水稻金属硫蛋白0sMT-l-2a蛋白纯化
收集菌体，进行超声破碎，过N1-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化，收集纯化后的蛋白，纯化后的蛋白用于下一阶段实验。
[0013]水稻金属硫蛋白0sMT-l_2a在清除超氧根离子和羟自由基方面的研究。
[0014]超氧根离子的清除实验采用超氧化物检测试剂盒(Superoxide Assay Kit),超氧根离子清除率根据反应生成的可溶性橙色物质在A450处吸光值的减少来计算；羟自由基的清除实验采用水杨酸法，羟自由基清除率根据生成的紫色物质在A510nm处的吸光值的减少来计算。
[0015]本发明构建了水稻金属硫蛋白基因0sMT+2a的原核表达载体，并进一步进行了体外表达和纯化。获得的体外表达蛋白Pet-32A-0sMT-l-2a具有较强的清除超氧根离子和羟自由基的能力，为0sMT-l-2a在清除活性氧方面的应用提供了可行途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明中基因扩增后的电泳示意图，其中M为Marker，泳道1-3均为OsMT-卜2a基因扩增产物；
图2为本发明中质粒pMD18-T-fls#7W-2a的和通ol双酶切电泳检测图，其中M为Marker，I和2泳道是经I和沿ο I双酶切的酶切产物；
图3为本发明原核表达载体Pet-32A-fls#7W-J?a的和通ο I双酶切电泳检测图，其中M为Marker，I和2泳道是经和沿ol双酶切的酶切产物。
[0017]图4为本发明原核表达载体?em0sMT+2a诱导表达后SDS-PAGE电泳检测图，其中M为蛋白质分子标记，I为含Pet-32A菌株的表达产物，2为含Pet-32A-0sMT-l_2a菌株表达产物裂解物沉淀，3为含Pet-32A-0sMT-l-2a菌株的表达产物裂解物上清。
[0018]图5为本发明原核表达载体?U2k-0sMT-:l-2a表达蛋白的上清及原始表达载体Pet-32A表达的蛋白的上清经N1-NIA纯化的电泳检测图，其中M为蛋白质分子标记，I为纯化后的含Pet-32A菌株的表达产物上清，2为纯化后的含Pet-32A-0sMT-l-2a菌株的表达产物上清。
[0019]图6为Pet_32A和Pet-32A-0sMT-l_2a表达产物对羟自由基清除能力的比较，黑线表示为原始表达载体Pet-32A表达后的产物(作对照)，灰线为Pet-32A-0sMT-l-2a表达载体表达产物；可以看出与Pet-32A相比，Pet-32A-0sMT-l-2a重组蛋白具有较明显的清除羟自由基的能力，且清除能力随重组蛋白浓度的提高而加强。
[0020]图7为Pet_32A和Pet-32A-0sMT-l_2a表达产物对超氧根离子的清除能力的比较，黑线表示为原始表达载体Pet-32A表达后的产物(作对照)，灰线为Pet-32A-0sMT-l-2a表达载体表达产物；可以看出与Pet-32A相比，Pet-32A-0sMT-l-2a重组蛋白具有较明显的清除超氧自由基的能力，且清除能力随重组蛋白浓度的提高而加强。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。
[0022]实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、反转录酶、RN A酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂购自invitrogen公司，超氧化物检测试剂盒(Superoxide Assay Kit)购自碧云天技术研究所，
其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。
[0023]所有引物序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0024]实施例1:原核表达载体Pet-32A-fls#7W-J?a的构建
Cl)引物设计:根据NCBI数据库中水稻中的0sMT+2a基因(登录号:D15602)序列和原核表达载体Pet-32A多克隆酶切位点，设计一对特异性引物:
OsMT-1-2a_Y: GAATTCatgtcgtgctgcggaggaaactg
OsMT-1^a-V: CTCGAGcttgccgcagttgcaggggttgc
引物含有限制性内切酶I识别位点，含有限制性内切酶沿ο I识别位点。
[0025](2)总RNA的提取
将水稻花从植株分离后，迅速放入液氮研磨至粉状，将研磨好的材料转入eppendorf管中，加入I mL Trizol,震荡混匀，加入0.2 mL氯仿，震荡混匀，12000rpm, 4°C离心IOmin,小心吸取上清，加入等体积的异丙醇，室温沉淀20min, 12000rpm,4°C离心lOmin。弃上清，75%乙醇洗涤沉淀2次。将样品置于冰上，晾干后加入20 μ L DEPC水溶解沉淀，溶解的RNA置于-70°C保存备用。[0026](3)cDNA 合成
以RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA，具体步骤为:取0.5 ml洁净eppendorf管，依次加入总RNA 11 μ I(约I μ g)、01igo(dT)l μ I ;65°C处理5 min后,转至冰上5 min ；向印卩611(10忖管中加入2蝴-]\11^缓冲液5 4 IUOmM dNTP I μ l、RNase抑制剂I μ 1，37°C处理5 min ;然后向eppendorf管中加入I μ I反转录酶；42°C处理60 min ；94°C 5 min使反转录酶失活，得到cDNA。
[0027](4 )扩增 OsMT-1_2a 片段
以cDNA为模板、使用弓丨物OsMT-卜2a-b'和OsMT-卜2a_?>'进行PCR扩增OsMT-1_2a片段，PCR 的 25 μ I 体系为:K0D 缓冲液(10*) 2.5 μ I, KOD 0.5 μ 1、cDNA 模板 2 μ 1、IOmMdNTP0.5μ 1,10 μ M 0sMT-l-2a-5/ 引物 I μ 1、10 μ M I 0sMT-l-2a-3/ 引物 I μ 1、使用无菌水补足25 μ I。反应条件为:94°C 5min，35个循环，94°C变性30s，55°C退火30s，68°C延伸20 s，68°C反应lOmin。PCR经2%的琼脂糖凝胶电泳检测发现，其长度与预期大小(249bp)一致(见图1)。
[0028](5) OsMT-1片段的回收
对PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段；使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。
[0029](6 ) OsMT-1~2a 片段加尾
取1.5 ml灭菌的eppendorf管,依次加入回收的PCR产物14 μ 1、10* Taq DNA聚合酶缓冲液 2 μ l、10mM dNTP 2 μ I, Taq DNA 聚合酶 2 μ I ;72°C处理 45 min ;先加 0.18 mL无菌水，再加20 μ I 3Μ醋酸钠，混匀，最后加入2倍体积的无水乙醇，-20°C沉淀60 min,12000rpm, 4°C离心lOmin。弃上清，75%乙醇洗涤沉淀2次。DNA晾干后加入20 μ L无菌水溶解沉淀，溶解的DNA置于_20°C保存备用。
[0030](7) OsMT-1~2a片段的T/Α克隆和测序
将回收片段连接到PMD18-T载体上，其具体步骤为:向1.5 ml离心管中分别加入:OsMT-1~2a 片段的 cDNA 5 μ 1、pMD18_T 载体 0.5 μ 1、10* Τ4 DNA 连接酶缓冲液 lul, T4DNA连接酶lul，加无菌水至10 ul，用封口膜封好；置于16°C连接4-6h。将100 μ I感受态肠杆菌万.co7i DH5a加入连接体系中混匀；混合液冰浴30 min，42°C热刺激90 s后，冰浴5 min;加入800μ1 LB液体培养基，37 °C、200 rpm摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后，常温3000 rpm离心2 min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml时，使用移液枪混匀，接入带有Amp抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37°C过夜培养；挑取菌落接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，收集菌体，采用质粒抽提试剂盒提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒pMD18-fls#r-7-J?a，具体方法为:向0.5 ml的离心管中分别加入:质粒 DNA (50ng/y I) 2 μ I, EcoRl 0.5 μ I, Xhol 0.5 μ IUOXbuffer
(H)2 μ 1，使用无菌水补足20 μ I ;37°C反应4h ;经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测发现，重组质粒pMDI可酶切出预期大小(249bp)的片段(见图2)，将酶切正确的重组质粒pMDl8-0sMT-l-2a进行测序验证插入基因的正确性。
[0031](8)原核表达载体的构建
使用EcoR I和沿ol对质粒pMD18T-fls#7W-23和载体Pet_32A进行双酶切，分别获得5’端带有和3’端带有ZAoI的0sMT+2a片段和Pet_32A载体，电泳后分别进行胶回收，16°C连接4-6h ;将100 μ I感受态肠杆菌疋coli DH5 α加入6 μ I连接体系中混匀；混合液冰浴30 min，42°C热刺激90s后，冰浴5 min;加入800 μ I LB液体培养基，37°C、200rpm摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后，常温3000 rpm离心I min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml时,使用移液枪混匀,接入带有Amp抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37°C过夜培养；挑取菌落接种于LB液体+Amp的培养基，37°C、180 rpm培养12h后，提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒Pet-32A-fls#r-7-J?a，具体方法为:向0.5 ml的离心管中分别加入:质粒DNA (50ng/ μ I) 2 μ I>EcoRl 0.5 μ I^Xhol0.5 μ IUOXbuffer (Η)2 μ I，使用无菌水补足20 μ I ;37°C反应4h ;经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测发现，重组质粒Pet-32A-fls#r-7-J?a可酶切出预期大小(249bp)的片段(见图3)。将酶切正确的重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序进行序列验证，最后获得原核表达载体VeHk-OsMT-卜2a。
[0032]实施例2:原核表达载体Vet-22k-OsMT-l_2a的原核表达
使用热刺激法将重组质粒VH-OsMT-Ha转化入大肠杆菌现(DE3)感受态细胞中，涂布于LB (Amp抗性)固体平板上，挑取Pet-32A-0sMT-l-2a的重组菌落于LB (Amp抗性)液体培养基中，37°C、200 rpm摇床培养过夜，按1:100的比例接种于相同的LB培养基上，37°C振摇培养至0D600为0.6，加入终浓度为lmmol/L的IPTG于37°C下诱导6h，6000rpm/min离心10 min收集菌体,超声破碎菌后分离上清和包涵体。经SDS-PAGE电泳分析发现，与空载体Pet-32A相比，Pet-32A-0sMT-l-2a重组菌体的蛋白中出现一个分子量约为32kD的明显的蛋白条带，与预测的蛋白分子量相符，主要存在于上清中，而对照菌株Pet-32A则在预期的23 kD处有一条明显的蛋白条带(见图4)。
[0033]实施例3:蛋白的纯化 鉴于原核表达载体Pet-32A在C段含有一段His-tag，所表达的蛋白C端含有6个组氨酸，因此可采用N1-NTA进行纯化。将500ml LB培养基制备的细菌加入50 ml裂解液(50mmol/L NaH2P04 和 300 mo I/L NaCl，8 mol/L Urea, 20 mmol/L 咪唑，ρΗ8.0)，室温下搅拌30 min，然后12000 r/min离心30min。取上清液，过N1-NTA树脂柱，先以洗涤液(50mmol /T, NaH2P04 和 300 mmol/L NaCl, 8 mol/Lurea, 20 mmol/L 咪唑，ρΗ8.0) 10 ml 洗漆两次，然后以洗脱液(50 mmol/L NaH2P04 和 300 mmol/L NaCl,250 mmol/L 咪唑，8 mol/L Urea, pH8.0)进行洗脱。经 SDS-PAGE 电泳分析发现，Pet-32A-0sMT-l_2a 菌体在 32 kD左右处有一条清晰条带，Pet-32A菌株表达的蛋白上清经纯化后在23 kD处有一条清晰的条带(见图5)。
[0034]实施例4:清除超氧根离子
超氧根离子的清除实验采用超氧化物检测试剂盒(Superoxide Assay Kit)。其原理是利用超氧化物可以还原水溶性的磺化四唑盐(WST-1)产生可溶性成橙色物质为基础来检测超氧化物的生成，试剂盒的检测试剂中添加了 Catalase等,可以清除过氧化氢等过氧化物对WST-1显色的干扰，使测定结果更加准确，具体的操作步骤参照试剂盒说明书，加入待测样品(纯化后的Pet-32A菌株、Pet-32A-0sMT-l-2a菌株表达的蛋白上清)的浓度为10 μ Μ，20μΜ，30μΜ，40μΜ和 50 μ Μ。
[0035]超氧根离子清除率=(A对照一 A3111定)/A对照
Am:没有加待测样品(以蒸馏水代替)A450处所测吸光值Aaijse:加入纯化的Pet-32A-0sMT-l-2a蛋白/Pet_32A蛋白在A450处所测吸光值 实施例5:清除羟自由基
羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕获Fenton反应体系中的羟自由基，生成的2，3 一二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在510nm处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。加入的待测样品(纯化后的Pet-32A菌株、Pet-32A-0sMT-l-2a菌株表达的蛋白上清)的浓度为10 μ M，20 μ Μ, 30 μ Μ, 40 μ M 和 50 μ Mo O[0036] 轻自由基清除率=(A对照一 A测定)/A对照
Am:没有加待测样品(以蒸馏水代替)所测吸光值
Amm:加入纯化的Pet-32A-0 sMT-l-2a蛋白/Pet_32A蛋白所测吸光值。
【权利要求】
1.一种水稻金属硫蛋白基因OsMT+2a的原核表达载体，其特征在于:该载体含有水稻OsMT+2a蛋白基因、T7启动子和终止子、核糖体结合位点RBS、His U签,OsMT-l_2a基因的上游为启动子，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列；所述flsi/TW-為蛋白基因来源于水稻，其GenBank登录号为D15602。
2.如权利要求1所述水稻金属硫蛋白基因OsMT-l-2a的原核表达载体的构建方法，其步骤如下: 1)根据GenBank上发表的OsMT-l_2a全长基因序列,设计如下特异性引物:
OsMT-1-2a_Y: GAATTCatgtcgtgctgcggaggaaactg
OsMT-1^a-V: CTCGAGcttgccgcagttgcaggggttgc 引物含有限制性内切酶I识别位点，含有限制性内切酶沿ο I识别位点； 2)从水稻花中提取RNA，并以RNA为模板用反转录酶合成cDNA，再以水稻花cDNA为模板，采用步骤I)中设计的特异引物，在PCR扩增体系中对基因的cDNA进行扩增，回收纯化基因片段，并将其连接到克隆载体PMD18-T上，通过PCR和酶切检测获得克隆载体pMD18-fls#7W-2a ； 3)使用EcoRI和ZAo I对质粒pMD18-fls#7W-2a进行双酶切获得OsMT-1_2a基因片段，将其与经过同样双酶切的原核表达载体Pet-32A相连接，转化后抽提质粒进行酶切鉴定，进一步通过序列测定验证获得Pet-32A-0sMT-l_2a原核重组表达载体。
3.如权利要求1所述水稻金属硫蛋白基因0sMT-l-2a的原核表达载体的应用，其特征在于在清除氧羟自由基和超氧根离子中的应用，超氧根离子的清除实验采用超氧化物检测试剂盒(Superoxide Assay Kit),超氧根离子清除率根据反应生成的可溶性橙色物质在A450处吸光值的减少来计算；羟自由基的清除实验采用水杨酸法，羟自由基清除率根据生成的紫色物质在A510nm处的吸光值的减少来计算。
【文档编号】C12N15/70GK103740746SQ201410002981
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年2月14日 优先权日:2014年2月14日
【发明者】胡丽芳, 贺浩华, 刘世强, 朱昌兰, 边建民, 彭小松, 贺晓鹏, 傅军如, 陈小荣, 欧阳林娟 申请人:江西农业大学