一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法，该方法的步骤如下：1）接种用主要器具准备；2）烟苗培育；3）接种用细菌液的准备；4）离体叶脉片的采集处理；5）在接种器具上放置离体叶脉片；6）接种病菌；7）接种后处置。本发明的优点是：1.接种发病过程时间短，占用空间场地少，方法简易便捷，无需高难度的技术操作，工作效率高；2.本发明利用较大的烟叶，容易反映出结果病情的差异，烟叶的取材也较有保证；发病症状与田间症状一致，清晰易识别，重现性好，接种发病局部条件容易控制，容易实现技术方法的标准化。
【专利说明】一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业技术和生物技术。具体是一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法。
【背景技术】
[0002]在植物病害控防研究中，许多基础问题的研究或重要理论问题的研究均离不开人工接种发病这基本手段。植物病害人工发病可以在活体植株上接种，也可在植物离体器官材料上接种。采用活体植株接种发病的研究结果，虽然更能反映寄主-病菌互作的本貌，但在活体上接种，往往需要较多的时间和空间场地，耗费较多的精力和财力，而且在许多情况下，局部条件控制的难度较大；而采用植物离体器官材料接种发病，往往需要较少的时间和空间需求，简单易行，接种发病的局部条件较容易控制，容易提高试验的规模与效率；许多植物病理学问题，采用离体材料接种发病手段进行研究，也能达到研究目的，或者说，采用在离体材料上接种与在活体植株上接种的研究结果是一致的。因此，在稻瘟病、稻纹枯病、小麦赤霉病、小麦白粉病、大豆锈病、马铃薯晚疫病、葡萄霜霉病、以及瓜类疫病、瓜类霜霉病、多种作物炭疽病等许多重要植物病害研究中，均有采用离体接种方法进行有关研究。
[0003]烟草青枯病全球普遍发生，是烟草生产的毁灭性病害，该病害的病原菌(Ralstonia solanacearum)也是当前国际上研究植物病原细菌致病机制的模式系统之一。在烟草青枯病的有关研究中，也有许多采用离体叶接种人工发病的应用案例，但长期以来，烟草青枯病离体叶人 工发病，主要采用如下的技术方法。
[0004]用注射器将青枯病菌菌液通过细小的针头注入叶片组织内，或者通过无针头方式将菌液压渗入叶片组织内，并以接种点附近组织的色泽变化为主要依据，判别接种发病的结果。虽然该接种方法体系很有效，但也存在一些明显的弊病:1)操作技术难度大，要将细菌液准确地压渗入或者注入到厚度与针头直径几乎等同的较薄的烟草叶片组织内，不但需要训练有素的操作者，操作的效率也较为低下；2)接种结果主要表现为在接种点附近组织的局部坏死，与该病害的系统侵染症状有一定的差距。在高节奏的当代工作中，往往要求应用的技术方法工作起来简易便捷，并能高效率、高通量和高准确性，上述的弊病显然使得当前的烟草离体接种方法难以适应要求。
[0005]烟草青枯病的主要症状表现为萎蔫，同时还可以引起输导系统及其附近组织的坏死，叶片的输导组织分布在叶脉上，输导系统及其附近组织的坏死，可导致叶脉外观上呈褐色至黑色的坏死，这种症状特征应在人工接种发病中加以利用，但至今未见有将这种清晰的症状表现，在人工发病实践中的加以应用并建立配套技术。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法。
[0007]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
[0008]一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法，主要内容是将较大的烟草叶片，裁切成保留主叶脉的长片条(简称离体叶脉片)，利用一套简单的器具接种烟草青枯病菌，导致离体叶脉片组织坏死而表现出清晰的发病症状，人工发病方法的步骤如下:
[0009]1.接种用主要器具准备:接种用的主要器具包括:大方盘、小方盘、玻璃罩、倾斜放置的工作面板；用洁净剂将这些器具洗涤干净后备用。
[0010]2.烟苗培育:按常规方法培育烟苗，常规水肥管理，烟草叶片长度大于20cm即能使用。
[0011]3.接种用细菌液的准备:将烟草青枯病菌移植到NA等一般细菌培养基平板上，NA培养基的成分:牛肉膏3克，蛋白胨10克，琼脂18克，蔗糖10克，水1000ml，30°C培养48小时后，用无菌水将培养基平板上生长的细菌菌落洗涤悬浮，并将此细菌悬浮液转入干净的容器内，用无菌水将细菌量调配成108cfu/ml的浓度级别，作为接种用细菌液。
[0012]4.离体叶脉片的采集处理:用干净剪刀剪取步骤2烟草植株上的叶片，用干净的容器装回室内，在自来水下轻轻冲洗干净叶片表面，用干净的裁切工具将叶片裁切成保留主叶脉的离体叶脉片备用。
[0013]5.在接种器具上放置离体叶脉片:
[0014]1)组装接种用主要器具，方法是:取出步骤I备好的组件，将小方盘置于大方盘内的中间，取2个干净的普通橡皮筋分别套在工作面板的上下两头，并将工作面板置于小方盘内成稳定的倾斜状态。
[0015]2)放置离体叶脉片:取步骤4备好的离体叶脉片，顶端朝上，基端朝下，平行摆放于工作面板上，并挑起橡皮筋将离体叶脉片的两端夹稳。
[0016]6.接种病菌:取步骤3准备的细菌液注入步骤5操作完备后的小方盘内，液面浸没离体叶脉片的基端切口。
[0017]7.接种后处置:步骤6操作完备后，取玻璃罩将小方盘以及盘内的工作面板和离体叶脉片全部罩在大方盘上，并往大方盘内注入薄层清水，使玻璃罩内部封闭并形成罩内稳定的高湿状态；然后将整套装置放于具备正常散射光的普通室内培养，培养温度维持在28 ~30℃。
[0018]接种结果导致离体叶脉片出现非常清晰的叶脉坏死以及脉间组织的坏死症状，一般接种后2天开始表现症状，5~7天后整个叶脉片全部坏死。
[0019]本发明的优点是:
[0020]1)采用较大的烟草叶片，发病结果病情轻重的差异容易得到体现；而且烟草植株可供利用的叶片数量较多，持续期较长；
[0021]2)实际实施仅用叶脉条而非全叶片，有利于在有限的器具空间内接种更多的寄主材料；
[0022]3)接种发病过程时间短，占用空间场地少；
[0023]4)发病症状与田间症状一致，清晰易识别，重现性好；
[0024]5)方法简易便捷，无需高难度的技术操作，工作效率高；
[0025]6)接种发病局部条件容易控制，过程管理简单，容易实现接种方法的标准化。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1是本发明的离体叶脉片的处置方式示意图。[0027]图中，A部示意离体叶片整片固定在工作面板及其基端插入水面下的状态；B部示意离体叶脉片的式样及其基端插入水面下的状态。
[0028]图2是本发明的一组离体叶脉片接种青枯病菌的发病表现过程。
[0029]图中，A部是发病前表现；B~F部是发病后依次从病情轻到病情重的症状表现。
[0030]图3是本发明离体叶脉片接种青枯病发病表现的其它样例。
[0031]图中，A、B部示意在叶脉清晰坏死的同时，脉间叶肉组织也坏死；C、D部示意整个叶脉片几乎全部坏死；E、F是一组接种清水空白对照的前后表现，E是接种发病前，F是与样例C和D病情程度同期的表现。
[0032]图4是本发明接种用器具示意图。
[0033]图中，a是大方盘，b是小方盘，c是玻璃罩，d是倾斜放置的工作面板，e是橡皮筋；A部是器具各组件装配完毕示意图；B部是A部去掉玻璃罩c后的侧面观式样图；C部是B部的正面观；D部是在工作面板d放置离体叶脉片并罩上玻璃罩后的整套器具正面观。
【具体实施方式】
[0034]下面结合附图与实施例对本发明作进一步描述。
[0035]发明人发现，在烟草离体叶片上接种青枯病菌，无需用注射器强行压注方式导入病菌到叶片组织内，只要简单 地将细菌液加在叶片基端的主脉切口上，细菌便由切口侵入叶片的叶脉组织内，快速导致叶脉组织坏死，出现与田间症状一致的清晰发病表现。
[0036]为了将烟草青枯病菌细菌液持续稳定地加在叶片基端切口上，只需要将叶片基端切口浸入含有青枯病菌的液体内即行。为了将插在细菌液中的叶片稳定竖起，并充分展开以利于发病观察，需要将叶片展开固定在一个工作面板上，如图1的A部所示；发明人发现，采用这种方式接种的结果，叶片主叶脉坏死症状特别明显；而由于烟草叶片较大，占据面积大，为了突出主叶脉的发病反应，本发明设计为切取包含主叶脉的烟草离体叶脉片作材料，如图1的B部所示；这样有利于在有限的器具面积内接种更多的寄主材料，提高效率；实际上，切取较大的烟草叶片的叶脉片作材料还有2个优势，一是较大的叶脉片从始发病到严重发病，有较多的病情变异空间，因而非常适合用来开展病情差异的试验研究(如比较测定不同菌株致病力的大小等)；二是在烟草整个生育期中，叶片较大者占大多数，由于经裁切后都能适合本发明的使用，使得接种工作的烟叶取材在时间上和数量上不容易受到局限。
[0037]—般接种2天后可见叶脉出现坏死，初期往往是主脉基部先发病，如图2的B部所示；往后坏死向上扩展，主脉与侧脉不断坏死，如图2的C、D部所示；直至主脉与侧脉全部坏死，在叶脉坏死的同时，也逐步伴随着脉间叶肉组织的坏死，如图2的E、F部所示和图3的A、B部所示；最后整个叶脉片全部坏死，如图3的C、D部所示；整个过程主叶脉坏死现象非常清楚。
[0038]接种导致病情发展的轻重或快慢，往往与如下一些接种条件等有关，I)接种用菌株，不同的菌株导致结果病情有差异。2)接种用细菌液的浓度，用低于2.5X108cfu/ml浓度的细菌液接种，同样可导致发病，但发病速度变慢；而用高于2.5X108cfu/ml浓度的细菌液接种，结果发病更快，不过采用过高浓度的细菌液接种，会导致发病过快过重，结果容易掩盖一些发病的差异细节，从而影响结果定量化的准确性，而且要获得很高浓度的细菌液，病菌培养工作量要增加。3)接种后的培养温度,在低于27°C条件下培养，同样可导致发病，但发病速度变慢；在高于30°C条件下培养，发病速度有所变快，但温度过高会加快烟草离体叶片衰老，也不利于操作者在研究过程中的跟踪观察。
[0039]病情轻重可用主叶脉坏死长度等指标来衡量。
[0040]实施例1
[0041]一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法，在烟苗品种云烟87离体叶脉片上接种烟草青枯病菌菌株Rso-1 ;按如下步骤操作:
[0042]1.接种用主要器具准备:用作接种的主要器具包括:如图4所示的大方盘a、小方盘b、玻璃罩C、倾斜放置的工作面板d等组件，本实施例器具的用材与大小:大方盘a为长X宽X高=40 X 30 X 3cm的普通方盘；小方盘b为长X宽X高=29 X 22 X 3cm的普通方盘；玻璃罩c为长X宽X高=31 X 25 X 20cm的有机玻璃罩；工作面板d为24X 24cm的普通玻璃板，用玻璃胶在玻璃板的下方，永久粘牢一条24X8cm的小玻璃块作支撑，从而获得一块稳定而倾斜状态的工作面板。用洁净剂将这些组件洗涤干净后备用；
[0043]2.烟苗培育:按常规方法培育烟苗品种云烟87，常规水肥管理，烟草叶片长度大于20cm即能使用；
[0044]3.接种用细菌液的准备:将本实施例用菌株移植到NA培养基平板上，(NA培养基的成分:牛肉膏3克，蛋白胨10克，琼脂18克，蔗糖10克，水1000ml)，30°C培养48小时后，用无菌水将培养基平板上生长的细菌菌落洗涤悬浮，并将此细菌悬浮液转入干净的三角瓶内，用无菌水调配成2.5X108cfu/ml (菌落形成单位/ml)的细菌液，作接种用细菌液。
[0045]4.离体叶脉片的采集处 理:用干净剪刀，剪取步骤2烟草植株上的叶片，用干净的容器装回室内，在自来水下轻轻冲洗干净叶片表面，用干净的手术刀片将叶片裁切成保留主叶脉的的长片条(离体叶脉片)备用；
[0046]5.在接种器具上放置离体叶脉片:
[0047]I)组装接种用主要器具，方法是:取出步骤I备好的组件，将小方盘置于大方盘内的中间，取2个干净的普通橡皮筋分别套在工作面板的上下两头，并将工作面板置于小方盘内成稳定的倾斜状态，如图4的B、C部所示；
[0048]2)放置离体叶脉片:取步骤4备好的离体叶脉片，顶端朝上，基端朝下，平行摆放于工作面板上，并挑起橡皮筋将离体叶脉片的两端夹住固定；操作完备后的状态形如图1的B部所示；
[0049]6.接种病菌:取步骤3准备的本实施例菌株的接种细菌液500ml，注入步骤5操作完备后的小方盘内，液面浸没离体叶脉片的基端切口 ；
[0050]7.接种后处置:步骤6操作完备后，取玻璃罩将小方盘以及盘内的工作面板和离体叶脉片全部罩在大方盘上，并往大方盘内注入薄层清水，使玻璃罩内部封闭并形成罩内稳定的高湿状态，如图4的D部所示；然后将整套装置放于具备正常散射光的普通室内培养架上培养，培养温度维持在28~30°C范围。
[0051]结果表现出如图2—样清晰的叶脉坏死症状；接种后60小时离体叶片的主叶脉坏死长度为6.4cm。
[0052]实施例2
[0053]一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法，在烟苗品种云烟87离体叶脉片上接种烟草青枯病菌菌株Rso-2 ;按实施例1的步骤I至步骤7操作实施，结果表现出如图2 —样清晰的叶脉坏死症状；接种后60小时离体叶脉片的主叶脉坏死长度为7.0cm0
[0054]实施例3
[0055]一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法，在烟苗品种云烟87离体叶脉片上接种烟草青枯病菌菌株Rso-3 ;按实施例1的步骤I至步骤7操作实施，结果表现出如图2 —样清晰的叶脉坏死症状；接种后60小时离体叶脉片的主叶脉坏死长度为17.0cm0
[0056]实施例4
[0057]一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法，在烟苗品种云烟87离体叶脉片上接种烟草青枯病菌菌株Rso-4 ;按实施例1的步骤I至步骤7操作实施，结果表现出如图2 —样清晰的叶脉坏死症状；接种后60小时离体叶脉片的主叶脉坏死长度为11.6cm0
[0058]实施例5
[0059]一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法，在烟苗品种云烟87离体叶脉片上接种烟草青枯病菌菌株Rso-3 ;按实施例1的步骤I至步骤7操作实施,其中在步骤7)接种后，本实施例的培养温度为24~27°C，而不是实施例1的28~30°C，结果同样表现出如图2 —样清晰的 叶脉坏死症状；接种后60小时离体叶脉片的主叶脉坏死长度为10.8cm。
【权利要求】
1.一种利用离体叶脉片接种烟草青枯病的人工发病方法，其特征在于，将较大的烟草叶片，裁切成保留主叶脉的长片条，简称离体叶脉片，利用一套简单的器具接种烟草青枯病菌，导致离体叶脉片组织坏死而表现出清晰的发病症状； 方法的步骤如下: 1)接种用主要器具准备: 接种用的器具包括:大方盘、小方盘、玻璃罩、倾斜放置的工作面板；用洁净剂将这些器具洗涤干净后备用； 2)烟苗培育: 按常规方法培育烟苗，常规水肥管理，烟草叶片长度大于20cm即能使用； 3)接种用细菌液的准备: 将烟草青枯病菌移植到NA —般细菌培养基平板上，NA培养基的成分:牛肉膏3克，蛋白胨10克，琼脂18克，蔗糖10克，水1000ml，30°C培养48小时后，用无菌水将培养基平板上生长的细菌菌落洗涤悬浮，并将此细菌悬浮液转入干净的容器内，用无菌水调配成细菌浓度为2.5X 108cfu/ml，作接种用细菌液； 4)离体叶脉片的采集处理:用干净剪刀，剪取步骤2)烟草植株上的叶片，用干净的容器装回室内，在自来水下 轻轻冲洗干净叶片表面，用干净的裁切工具将叶片裁切成保留主叶脉的离体叶脉片备用； 5)在接种器具上放置离体叶脉片: ①组装接种用主要器具，方法是:取出步骤I)备好的组件，将小方盘置于大方盘内的中间，取2个干净的普通橡皮筋分别套在工作面板的上下两头，并将工作面板置于小方盘内成稳定的倾斜状态； ②放置离体叶脉片:取步骤4)备好的离体叶脉片，顶端朝上，基端朝下，平行摆放于工作面板上，并挑起橡皮筋将离体叶脉片的两端夹稳； 6)接种病菌:取步骤3)准备的接种用细菌液注入步骤5)操作完备后的小方盘内，液面浸没离体叶脉片的基端切口； 7)接种后处置:步骤6)操作完备后，取玻璃罩将小方盘以及盘内的工作面板和离体叶脉片全部罩在大方盘上,并往大方盘内注入薄层清水,使玻璃罩内部封闭并形成罩内稳定的高湿状态；然后将整套装置放于具备正常散射光的普通室内培养，培养温度维持在28~30。。。 接种结果导致离体叶脉片出现非常清晰的叶脉坏死以及脉间组织的坏死症状，接种后2天开始表现症状，5~7天后整个叶脉片全部坏死。
【文档编号】C12N1/20GK103789231SQ201410006435
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月7日 优先权日:2014年1月7日
【发明者】张君成, 陈江凝, 黄柳, 谭金乐 申请人:广西大学