一种控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种对绵羊毛色基因检测的试剂盒，特别是一种控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒。本发明的控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒内有序列分别为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2的两条引物核苷酸和标准质粒载体SEQIDNO：3核苷酸序列。检测试剂盒提供了一种快速、简便、准确的新检测手段，摆脱了测序仪等大型仪器设备的依赖，而且操作步骤简单，普通兽医临床人员易于熟练掌握应用。
【专利说明】—种控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种对绵羊毛色基因检测的试剂盒，特别是一种控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]绵羊、山羊被毛颜色种类很多，其遗传现象也十分复杂。绵羊毛、山羊绒、羔皮、
裘皮等的颜色均具有重要的经济意义，例如，白色山羊绒比其他颜色的山羊绒价格高。
毛色还是品种的重要标志，有些品种的毛色对适应自然环境还起着重要的作用。对细毛羊养羊业来讲，人们的主要目的是为了获得白色优质细毛。近年来，由于国际市场对不经人工染色的天然有色毛织品兴趣增加，有色毛(黑色、褐色)的价格比白色毛贵30%~40%。因此，澳大利亚正在培育黑色美利奴羊，目前数量已达5万只左右。绵、山羊被毛纤维的颜色是由直径约0.1~0.3 y m的深色素颗粒形成的，参见:赵有璋.羊生产学(第二版)[M].北京.中国农业出版社.2007。绵羊、山羊毛色的形成主要取决于黑色素及其衍生物的有无与多少，参见:里德U.N，魏H.著.病理学总论与各论.武忠弼主译.北京:人民卫生出版社，1996，129-131.，
而毛色的种类主要取决于黑色素的种类和分布情况，见:方美英.猪的毛色遗传[J].中国畜牧杂志，2002,38(2):51-52.。黑色素是一种不溶于水与几乎所有溶剂的无定型小颗粒生物色素，合成和储存场所是黑素小体，参见:Li XL, Zheng GR, Zhou RY, etal.Evolution and differentiation ofMSHR gene in different Species[J]J Hered,2007,98(2):165-168 ;Klungland H, Vage D1.Pigmentary switches in domesticanimal species [J] Ann N Y Acad Sci，2003，994:331-338?，并由多个基因共同作用以及环境因素影响而形成，见:Sturm RA, Teasdele RD, Box NF.Human pigmentationgenes !identification, structure and consequences of polymorphic variation[J]Gene.2001,277:49-62.。黑色素有两种，一种为真黑色素，以黑色和褐色两种形式存在，不含硫原子；另一种是褐黑色素，以黄色和红色两种形式存在，见:师科荣，王爱国，邓学梅.猪毛色性状遗传机制研究进展[J]养猪，2003，4:24-28.，含硫原子，易溶于碱性溶液。真黑色素跟褐黑色素都是由酪氨酸和苯丙氨酸经一系列酶的催化形成的，合成过程的每个阶段都受到了很多信号分子与特定成分的调节和限制，见:伍革民，彭光旭.动物黑色素研究进展[J]甘肃畜牧兽医，2005，1:39-41。近年来，大量试验成果表明，与黑色素合成调控相关的基因有很多，如 TYR、MC1R、C-KIT、MSH、ACIH、ATRN、Agout1、LYST, EDN、Dmbxl 及 MGF等，其中Agouti就是一个重要的黑色素调控基因，参见:师科荣，王爱国，李宁等.中国地方猪种黑素皮质激素受体I基因(MClR)的单核苷酸多态性.中国科学C辑，2004，34 (2):144-149.。Parsons等通过经典遗传学方式分析得知Agouti基因座与被毛显性白色相关，参见:Parsons Y.M, Fleet M.R, Cooper D.ff.1nvestigation of the gene responsible forrecessive pig mentation in Australian Merino sheep.ProcAssocAdvancAnimBreed.Genet,1997,6th~10th:447-451.；Parsons Y.M, Fleet M.R, Cooper D.ff.1solation of theovine Agouti coding sequence.Pigment Cell Research, 1999, 12(7):394-397.。Royo等研究Xalda羊Agouti基因在皮肤中mRNA的表达量，发现白色个体Agouti表达量高，见:Royo L.J, Alvarez I,Arranz J.J, Fernandez I, Rodriguez A, Perez-Pardal L, GoyacheF.Differences in the expression ofthe ASIP gene are involved in the recessiveblack coat colour pattern in sheep:evidence from the rare Xalda sheep breed.Animal Genetics, 2008, 39 (3):290-293.。Norris 等研究表明在 Soay、澳洲美利奴羊中显性白色是由于一段包含ASIP编码基因、AHCY编码区和ATCH启动子序列多拷贝的190Kb串联片段，由于多拷贝的ATCH启动子启动多拷贝的Agouti基因高表达而形成，参见:NorrisBelinda J, Whan Vicki A.A gene duplication affecting expression of the ovineASIP gene is responsible for white and black sheep.Genome Research, 2008,18(8):1282-1293.。因而开展Agouti基因拷贝数变异检测对于开展绵羊毛色分子标记辅助选择育种的研究具有指导意义。[0003]目前检测拷贝数变异CNV的方法包括:基于芯片和DNA测序的高通量分析方法的比较基因组杂交技术(CGH芯片)、BAC芯片技术、SNP分型芯片和寡核苷酸芯片技术等，此外还有基于PCR技术的靶向分析的多重扩增探针杂交技术和依赖于连接的多重探针扩增技术以及高分辨率TILING芯片以及基于芯片技术的MAPH(程玉强，郭卫星，程树群.基因拷贝数异常的研究进展.中国细胞生物学学报，2011，33 (7):789-795.)。目前的新方法的基础也是基于DNA测序建立的，但以上方法都不适用于常规实验室操作。SouthernBlot 也能用于测定基因拷贝数，参见:QIU Jie-ren, XU Ying, YU Fu-gen.Determiningthe Copy Number of Exogenous Gene in Transgenic Plant by SYBR Green Real-timeQuantitative PCR.Agricultural Science Technology, 2011,12 (6):829-831 ;李緩，任长虹，吴永红，叶巧，石锦平，屈武斌，郑晓飞，刘虎岐，张成岗.多重PCR在质粒拷贝数检测中的应用.中国生物工程杂志，2011,31(6):93-98.，但其操作繁琐且很难绝对定量。Norris等设计一种检测Agouti基因拷贝数的非对称性竞争PCR方法，该设计是基于测序技术通过测定竞争性PCR扩增同一起始位点到连接点峰图面积A242或5断裂点峰图面积A238，通过 A242/(A242+A238)比值来确定拷贝数，参见:Norris Belinda J, Whan Vicki A.A geneduplication affecting expression of the ovine ASIP gene is responsible forwhite and black sheep.Genome Research, 2008,18(8):1282-1293 ;Henshall JM, WhanVA,Norris BJ.Reconstructing CNV genotypes using segregation analysis !combiningpedigree information with CNV assay.Genetics Selection Evolution, 2010, 42 (34):2-8.。但这种方法比较复杂，临床兽医难以熟练掌握操作性技术，并且需要测序仪等大型仪器，因此不适用于常规实验室。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种可克服现有技术不足，可用于检测控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异的试剂盒。
[0005]本发明的控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒内有序列分别为SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2的两条引物核苷酸和标准质粒载体SEQ ID NO:6核苷酸序列。
[0006]为方便使用，本发明的控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒内还可放置有相关试剂，如:SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(含 Ex Taq HS, dNTPMixture, Mg2+, Tli RNaseH, SYBR? Green I)和 ROX Reference Dye II,等。
[0007]本发明试剂盒的最佳使用方法是:PCR最佳反应体系为18 iiL，其中包含SYBRPremix Ex Taq (2 X) 9 U L, Rox Reference Dye0.4 U L, SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 引物(10 u tM/ u L) # 0.8 u L, ddH206 u L,模板 DNAl u L。PCR 条件:95°C预变性 3min ;95°C变性10s，60°C复性延伸30s，共40个循环，然后加溶解曲线阶段，65°C升温至95°C，根据溶解曲线判断产物特异性和Ct值。
[0008]本发明试剂盒的使用方法是首先将已知浓度的pMD19_Agouti标准质粒倍比稀释5个梯度，选取其中5个浓度梯度作为计算Ct值标准曲线的线性回归方程的荧光定量PCR扩增反应的模板，然后分别中加入试剂盒中的引物核苷酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:
2和SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(含 Ex Taq HS, dNTP Mixture,Mg2+, TliRNaseH, SYBR? Green I)和 ROX Reference Dye II 后，在荧光定量 PCR 上进行 PCR 扩增，PCR扩增产物根据溶解曲线判断产物特异性，根据不同浓度标准质粒的Ct值计算Ct值标准曲线的线性回归方程。然后将待检羊只的DNA为荧光定量PCR模板，然后再分别中加入试剂盒中的引物核苷酸序列 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 和SYBR? Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)(含 Ex Taq HS, dNTP Mixture, Mg2+，Tli RNaseH, SYBR? Green I)和 ROXReference Dye II后，在荧光定量PCR上进行PCR扩增，PCR扩增产物根据溶解曲线判断产物特异性，将获得的待测样品的Ct值代入Ct值标准曲线的线性回归方程计算待测样品拷贝数。
[0009]本发明实质上是一种Agouti基因拷贝变异检测试剂盒，这一检测试剂盒提供了一种快速、简便、准确的新检测手段。本发明改进了现有技术中Agouti基因拷贝变异检测中的缺点。由于该方法引入了特异性扩增引物和SYBR Green Buffer体系,使得Agouti基因拷贝变异检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，并避免了漏检和误检。用大量已知不同Agouti基因拷贝数的标本和进行比对实验并对产物进行测序验证，结果证实，本试剂盒特异性较好，吻合度为100%。本发明的试剂盒经过多次不同的重复实验证实，具有良好的重复性和稳定性。在实验样本基因组DNA应用本发明中试剂盒中的特异引物进行扩增后，可直接应用荧光定量PCR仪分析仪进行拷贝数变异分析，而无需现有技术中Agouti基因拷贝变异检测方法在PCR扩增后在大型测序仪中进行毛细电泳检测后还需要应用不对称竞争性PCR技术进行拷贝数变异分析，从而摆脱了测序仪等大型仪器设备的依赖，而且操作步骤简单，普通兽医临床人员易于熟练掌握应用。总之，本发明较上述已有Agouti基因拷贝变异检测方法准确、快速、简便、成本低、实用，具有很好的实用价值和市场价值。
[0010]由前述内容可知，本发明所涉及的检测方法是建立利用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测Agouti基因拷贝数变异的简单方便的方法，采用这本发明的用于检测Agouti基因拷贝数变异可克服现有技术不足。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为质粒DNA和待测样本基因组DNA PCR扩增Agouti片段电泳图，显示常规PCR扩增特异性片段，2%的琼脂糖凝胶电泳，经PCR扩增后，其扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳在紫外灯下观察，可看到与目的片段大小一致的电泳条带，从右到左依次是DNA分子量Marker (IOObp DNA Ladder Marker)、pMD19_Agouti 和待测绵羊 Agouti 基因实时突光定量PCR扩增产物的结果。图中Marker为DNA分子量Marker，1、2为样本基因组DNA扩增产物，3、4为质粒DNA扩增产物。
[0012]图2为pMD19-Agouti质粒标准品标准曲线，显示pMD19_Agouti质粒标准品标准曲线，图中:横坐标表示pMD19-Agouti质粒标准品的DNA浓度，纵坐标表示循环阈值(Ct值)。
[0013]表1显示待测绵羊Agouti基因实时荧光定量PCR扩增反应Ct值和基因拷贝数。【具体实施方式】
[0014]绵羊Agouti基因拷贝变异检测标准品标准线性回归方程的制备
(1)引物设计和合成
参照绵羊 Agouti 基因 DNA 序列(Genbank N0.EU420023.1)和 mRNA 序列(GenbankN0.NM001134303.1)在内含子3和外显子4之间的一段保守序列，运用primer5.0软件设计一对特异性引物，引物序列(5' —3' )SEQ ID NO:1:GTTAAGTGTTGATGGCGGAG ；SEQ IDNO:2:GTTCTTCATCGGAGCCTTTC，扩增长度193bp，以构建标准质粒pMD19_Agouti。所有引物均由上海生工合成并采用LLTRAPAGE纯化方式纯化。
[
【权利要求】
1.一种控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒，其特征在于试剂盒内有序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的两条引物核苷酸和pMD19- Agouti标准质粒载体SEQ ID NO: 3核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒，其特征在于试剂盒内还放置有 SYBR? Premix Ex Taq? (Tli RNaseH Plus)(含 Ex Taq HS, dNTPMixture, Mg2+, Tli RNaseH, SYBR? Green I)和 ROX Reference Dye II。
3.根据权利要求1和2所述的试剂盒的使用方法，其特征是:PCR最佳反应体系为18μ?，其中包含 SYBR Premix Ex Taq (2 X) 9 μ?,--οχ Reference Dye 0.4 μ?, SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 引物(10μΜ/μ L)各(λ 8 μ?, ddH20 6 μ?，模板 DNA I μ?，PCR 条件:95 °〇预变性3 min ；95 °C变性10 s，60 1:复性延伸30 S，共40个循环，然后加溶解曲线阶段，65°C升温至95 °C，根据溶解曲线判断产物特异性和循环阈值Ct。
4.权利要求1或2所述的控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒的使用方法，其特征在于首先将权利要求1中已知浓度的pMD19- Agouti标准质粒倍比稀释6个梯度，选取其中5个浓度梯度作为计算Ct值标准曲线的线性回归方程的荧光定量PCR扩增反应的模板，然后分别中加入权利要求1所述所述试剂盒中的引物核苷酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 和权利要求 2 中所述的 SYBR? Premix Ex Taq? (Tli RNaseH Plus)(含 ExTaq HS, dNTP Mixture,Mg2+, Tli RNaseH, SYBR? Green I)和 ROX Reference Dye II 后，在荧光定量PCR上进行PCR 扩增，PCR扩增产物根据根据溶解曲线判断产物特异性，根据不同浓度标准质粒的Ct值计算Ct值标准曲线的线性回归方程；再以待检羊只的DNA为荧光定量PCR模板，然后分别中加入权利要求1所述所述试剂盒中的引物核苷酸序列SEQ ID NO:I 和 SEQ ID NO:2 和权利要求 2 中所述的 SYBR? Premix Ex Taq? (Tli RNaseH Plus)(含Ex Taq HS, dNTP Mixture,Mg2+, Tli RNaseH, SYBR? Green I)和 ROX Reference Dye II 后，在荧光定量PCR上进行PCR扩增，PCR扩增产物根据根据溶解曲线判断产物特异性，将获得的待测样品的Ct值代入权利要求4所得的Ct值标准曲线的线性回归方程计算待测样品拷贝数。
【文档编号】C12Q1/68GK103740825SQ201410009422
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月8日 优先权日:2014年1月8日
【发明者】岳耀敬, 杨博辉, 郭婷婷, 刘建斌, 韩吉龙, 孙晓萍, 郭健, 牛春娥, 冯瑞林 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所