一种苯甲酸衍生物的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种苯甲酸衍生物的制备方法，包括在包含腈水解酶的酶催化剂作用下，含水反应混合物中的苯甲腈衍生物水解生成所述苯甲酸衍生物。优选所述苯甲腈衍生物选自对氨甲基苯甲腈和对氯甲基苯甲腈。优选本发明所述腈水解酶为GenBank中编号为ABD98457.1的氨基酸序列。本发明可以高效地生产对氨甲基苯甲酸和对氯甲基苯甲酸，而且反应条件温和，对环境友好，操作简便。本发明提供的生物催化生产苯甲酸衍生物的方法具有很好的工业应用前景。
【专利说明】一种苯甲酸衍生物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属医药化工领域，涉及一种苯甲酸衍生物的制备方法。更具体的说，涉及一种对氨甲基苯甲酸或对氯甲基苯甲酸的制备方法。
【背景技术】
[0002]氨甲苯酸(对氨甲基苯甲酸)又名止血芳酸或PAMBA，白色鳞片状或结晶粉末。它是抗纤维蛋白溶解的促凝血药，其止血机理与对氨甲基环己酸相同，止血效果较对氨甲基环己酸强4~5倍；对一般慢性渗血的止血效果特别显著，可用于肺、肝、胰、前列腺、甲状腺、肾上腺等手术时的异常出血，紫癜、白血病、肺结核咯血等，也可用于链激酶或尿激酶过量引起的出血。
[0003]经文献检索，现有技术中报道的氨甲苯酸的合成方法可概括为以下三种:
[0004]—种是对氰基苯甲酸加氢。如文献Journal of OrganicChemistry, 24,115-116;1959 和文献 Collection of Czechoslovak ChemicalCommunication, 34 (3)，1108-10; 1969分别介绍了以雷尼钴或雷尼镍为催化剂，经氢气还原
得到产品氨甲苯酸。该合成路线需要使用氢气，反应压力较高，在生产上存在安全隐患，危险性较大。
[0005]第二种是对氯甲基苯甲酸或对溴甲基苯甲酸胺化。如《全国原料药工艺汇编》中记录，在氨水和碳酸铵(碳酸氢铵)的存在下，对氯甲基苯甲酸或对溴甲基苯甲酸胺化制备氨甲苯酸。该方法副产物多，收率低，反应后处理需分解除去未反应的碳酸铵，会有大量的氨气和二氧化碳溢出，且对氯甲基苯甲酸或对溴甲基苯甲酸的制备都会使用氯气或溴素，对环境污染严重。
[0006]第三种是对氰基氯苄水解再胺化。如CN201202718673介绍了一种以对氰基氯苄为原料，经过酸水解得到对氯甲基苯甲酸、再胺化的方法制备氨甲苯酸。该方法胺化步骤虽采用乌洛托品为催化剂，氨化母液可套用，但酸水解步骤产生大量废酸、废水，氨化步骤后处理繁琐，对pH值控制也要求苛刻，整条工艺不适合工业化生产。
[0007]上述现有技术中的方法制备对氨甲基苯甲酸时都不可避免存在一些问题，因此，本领域需要一种全新的制备对氨甲基苯甲酸的方法。
【发明内容】
[0008]利用腈水解酶，可以克服化学法生产氨甲苯酸的缺陷。生物催化是一种高效的催化体系，它可以催化得到许多传统化学方法不能或者不易合成得到的手性化合物，显示出优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性；而且，生物转化反应条件温和，反应产物纯度高、容易分离和纯化。生物催化在医药化工中间体的生产中已显示出巨大的发展潜力。
[0009]因此，本发明提供一种苯甲酸衍生物的制备方法，包括在包含腈水解酶的酶催化剂作用下，含水反应混合物中的苯甲腈衍生物水解生成所述苯甲酸衍生物。本发明的一个【具体实施方式】中，所述苯甲腈衍生物为对氨甲基苯甲腈和/或对氯甲基苯甲腈。[0010]在一种具体的实施方式中，所述腈水解酶为GenBank中编号为ABD98457.1的氨基酸序列；或者是在保持或提高所述腈水解酶活性的前提下，插入、缺失或替换ABD98457.1氨基酸序列中的一个或数个氨基酸所获得的氨基酸序列，或在ABD98457.1氨基酸序列的基础上加入标签或多肽等常规方法进行修饰而得到的氨基酸序列，或由基因库中搜索或常规突变方法得到的与ABD98457.1氨基酸序列相似度在80%以上的氨基酸序列。本领域技术人员公知的，所述ABD98457.1中共含369个氨基酸残基，且所述ABD98457.1由GenBank中编号为DQ444267.1的核苷酸序列翻译而得，所述DQ444267.1中共含1775个核苷酸。
[0011]本发明的发明人筛选和对比了多种腈水解酶催化对氨甲基苯甲腈生成对氨甲基苯甲酸，发现使用ABD98457.1为腈水解酶时对本发明中苯甲酸衍生物的制备特别有利，进而使得酶法工业生产相应的苯甲酸衍生物变得可行。
[0012]在另一种具体的实施方式中，所述酶催化剂为游离的腈水解酶、含腈水解酶的菌体细胞、固定在支持物上的腈水解酶、和固定在支持物上的含腈水解酶的菌体细胞中的一种或多种。所述支持物例如为聚合物基质(如藻酸盐珠子或聚丙烯酰胺凝胶颗粒)或不溶性载体(如硅藻土)，以便于所述酶催化剂的回收和再使用。所述游离的腈水解酶可以是从所述含腈水解酶的菌体细胞中经分离纯化或经部分纯化而得到。例如可参考专利US6870038敏捷食酸菌72W腈水解酶的固定化或用于细胞或分离的酶固定化的方法(Methods in Biotechnology,Vol.1:1mmobilization of Enzymes and Cells;GordonF.Bickerstaffj Humana Press, Totowaj NJj USA; 1997)。只要与本发明的内容不相冲突，则上述文献的内容结合于本发明中作为参考。
[0013]在本发明中，所述腈水解酶可以从天然菌敏捷食酸菌72W (Acidovoraxfacilis72ff, ATCC55746)中获取。在另外的【具体实施方式】中，所述腈水解酶为将GenBank中编号为DQ444267.1的碱基序列或者可翻译成上述氨基酸序列的碱基序列连接至载体上并转化进入微生物宿主细胞后表达得到。所述微生物宿主细胞选自:丛毛单胞菌、棒状杆菌、短杆菌、红球菌、固氮菌、柠檬酸杆菌、肠杆菌、梭状芽孢杆菌、克雷白氏杆菌、沙门氏菌、乳酸杆菌、曲霉、糖酵母、接合酵母、毕赤酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、汉森氏酵母、杜氏藻、德巴利民酵母、毛霉菌、球拟酵母、甲基`杆菌、芽孢杆菌、埃希氏杆菌、假单胞菌、根瘤菌和链霉菌，优选大肠杆菌。
[0014]本发明中，反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取所述苯甲酸衍生物。在一种具体的实施方式中，本发明所述方法还包括将催化反应完成后得到的反应混合物除去催化剂后加盐酸酸化并在O~20°C下结晶，得到所述苯甲酸衍生物。
[0015]在一个具体实施例中，所述反应混合物中的苯甲腈衍生物浓度为5mM~2M。
[0016]在另一个具体实施例中，所述反应混合物中产生的苯甲酸衍生物浓度为0.02~90wt%，优选为 0.02 ~40wt%。
[0017]本发明中，所述反应可以是从反应开始至反应结束均无需进行pH值控制，也可以是在反应过程中添加合适的酸或碱以保持合适的PH值。在一种具体的实施方式中，所述反应混合物的pH值保持在5.0~10.0，优选5.5~8.0 ;反应温度为O~65°C，优选5~35。。。
[0018]在另一个具体实施例中，所述酶催化剂在所述反应混合物中的量为0.1~250g/L，优选I~50g/L。[0019]本发明的方法提供了每克酶催化剂产生至少150克，优选至少300克，更优选至少450克对氨甲基苯甲酸或对氯甲基苯甲酸的催化剂生产率。
[0020]与现有技术相比，本发明可以高效地生产对氨甲基苯甲酸和对氯甲基苯甲酸，而且反应条件温和，对环境友好，操作简便。本发明提供的生物催化生产苯甲酸衍生物的方法具有很好的工业应用前景。
【具体实施方式】
[0021]下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
[0022]实施例1
[0023]本实施例为两种酶催化剂(含腈水解酶的菌体细胞和含腈水解酶的酶液)的制备过程。
[0024]根据NCBI 收录的臆水解酶(GenBank Accession Number:ABD98457.1)序列，合成其编码基因，并与表达载体pET-28a连接得到重组质粒pET28a-nl。在含50 μ L感受态细胞Ε.coli DH5a的EP管中加入10 μ L载体pET28a_nl，轻轻混匀，冰浴30min，转入42°C水浴中热击90s，快速转至冰浴中2min，取出后加入500 μ L无抗性LB培养基，37°C，180r/min摇床培养Ih后涂布于含30 μ g/mL卡那霉素的LB平板，37°C倒置培养16h后挑取单菌落，活化培养后使用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒进行双酶切检测鉴定阳性克隆。将含有阳性克隆的E.coli DH5a菌株置于甘油中，甘油在含菌株的培养液中的体积浓度为8%，且在冰箱中-20°C保存。
[0025]同样方式构建含有pET28a-nl的表达菌株E.coli BL21-pET28a_nl(DE3)，置于甘油中，甘油在含菌株的培养液中的体积浓度为8%，且在冰箱中-20°C保存。
[0026]取菌株E.coli BL21-pET28a-nl (DE3)，接种于 5mL 含有 30 μ g/mL 卡那霉素的 LB培养基的试管中，37°C，180r/min培养12h后，将培养液以体积比1:100的比例接种于新鲜的IOOmL含30 μ g/mL卡那霉素的LB培养基中，37°C培养1.5~2h，至菌液OD600约为0.6，再加入24mg/mL的IPTG溶液至IPTG终浓度为0.5mmol/L, 25°C > 100r/min诱导培养12h，然后4°C，4000r/min离心20min后弃上清，用蒸馏水悬浮菌体沉淀进行洗涤，同样条件下离心，即得到含腈水解酶的菌体细胞。
[0027]取Ig上述菌体细胞加入IOmL蒸馏水重悬，使用超声破碎仪破碎细胞30min，6000转/min离心lOmin，得到含腈水解酶的酶液。
[0028]实施例2
[0029]本实施例为含腈水解酶的菌体细胞催化对氨甲基苯甲腈生产对氨甲基苯甲酸。
[0030]在2mL pH值为7.0的磷酸缓冲溶液中加入对氨甲基苯甲腈300mg，加入实施例1中的菌体细胞0.lg，在37°C进行生物转化反应3小时，反应完全后，液相检测对氨甲基苯甲酸浓度，收率为98%。
[0031]实施例3
[0032]本实施例为含腈水解酶的菌体细胞催化对氯甲基苯甲腈生产对氯甲基苯甲酸。
[0033]在2mL pH值为7.0的缓冲溶液中加入对氯甲基苯甲酸腈300mg，加入实施例1中的菌体细胞0.lg，在37°C进行生物转化反应3小时，反应完全后，液相检测对氯甲基苯甲酸浓度，收率为98%。
[0034]实施例4
[0035]本实施例为含腈水解酶的菌体细胞催化对氨甲基苯甲腈生产对氨甲基苯甲酸。
[0036]在IOOmL pH值为7.0的缓冲溶液中加入对氨甲基苯甲酸腈20g，加入实施例1中的菌体细胞10g，在37°C进行生物转化反应3小时，反应完全后，除去固体的催化剂，将反应液用盐酸酸化，10°C下结晶，获得对氨甲基苯甲酸27g，转化率100%，收率为95%。
[0037]实施例5
[0038]本实施例为固定化细胞(含腈水解酶的菌体细胞)的制备。
[0039]步骤A，将实施例1中得到的含腈水解酶的菌体细胞加水分散并于3000r/min离心lOmin，倒掉上清，用水洗涤2~3次后称重，加入0.1M的NaAc溶液溶解，使菌体细胞的终浓度为50wt%。
[0040]步骤B，取1.1g海藻酸钠缓慢溶于22.9g的水里，溶解温度50°C，加完后温度调至70°C使胶完全溶解，室温冷却。
[0041]步骤C，向冷却后的胶内加入16mL步骤A中得到的浓度为50wt%的菌体细胞溶液，并磁力搅拌混匀形成混合液。
[0042]步骤D，滴加混合液形成颗粒。使用恒速泵，泵管道入口插入混合液中，出口导向
0.2M的CaAc2溶液。流速低至可使`得混合液从管道出口流出时形成单一、不连续的颗粒，悬空滴入CaAc2溶液中。使用磁力搅拌，使得CaAc2溶液的混合菌体颗粒不沉降并在CaAc2溶液中固定，混合液流加完后，继续揽祥lh。
[0043]步骤E，将步骤D中的颗粒置于84mL的0.2M的CaAc2溶液中，加入0.44g浓度为50%的戊二醛搅拌Ih。
[0044]步骤F，加入3.5g浓度为12.5%的聚乙烯亚胺，搅拌Ih后，清洗多次，除去细胞颗粒表面的物质。保存在4°C和0.2M的CaAc2溶液中备用。
[0045]实施例6
[0046]本实施例为固定化细胞催化对氨甲基苯甲腈生产对氨甲基苯甲酸。
[0047]在IOmL pH值为7.0的缓冲溶液中加入对氨甲基苯甲酸腈2g，加入实施例5中的固定化细胞4g，在37°C进行生物转化反应5小时，反应完全后，液相检测对氨甲基苯甲酸浓度，收率为98%。除去固体的催化剂，将反应液用盐酸酸化，10°C下结晶，获得对氨甲基苯甲酸2.7g，转化率100%,收率为95%。
[0048]实施例7
[0049]本实施例为含腈水解酶的酶液催化对氨甲基苯甲腈生产对氨甲基苯甲酸。
[0050]在ImL pH值为7.0的磷酸缓冲溶液中加入对氨甲基苯甲腈300mg，加入实施例1中的酶液lmL，在37°C进行生物转化反应3小时，反应完全后，液相检测对氨甲基苯甲酸浓度，收率为98%。
【权利要求】
1.一种苯甲酸衍生物的制备方法，其特征在于，在包含腈水解酶的酶催化剂作用下，含水反应混合物中的苯甲腈衍生物水解生成所述苯甲酸衍生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腈水解酶为GenBank中编号为ABD98457.1的氨基酸序列；或者是在保持或提高所述腈水解酶活性的前提下，插入、缺失或替换ABD98457.1氨基酸序列中的一个或数个氨基酸所获得的氨基酸序列，或在ABD98457.1氨基酸序列的基础上加入标签或多肽等常规方法进行修饰而得到的氨基酸序列，或由基因库中搜索或常规突变方法得到的与ABD98457.1氨基酸序列相似度在80%以上的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酶催化剂为游离的腈水解酶、含腈水解酶的菌体细胞、固定在支持物上的腈水解酶、和固定在支持物上的含腈水解酶的菌体细胞中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述腈水解酶从天然菌敏捷食酸菌72W中获取，或者所述腈水解酶为将GenBank中编号为DQ444267.1的碱基序列或者可翻译成权利要求2所述氨基酸序列的碱基序列连接至载体上并转化进入微生物宿主细胞后表达得到；所述微生物宿主细胞选自:丛毛单胞菌、棒状杆菌、短杆菌、红球菌、固氮菌、柠檬酸杆菌、肠杆菌、梭状芽孢杆菌、克雷白氏杆菌、沙门氏菌、乳酸杆菌、曲霉、糖酵母、接合酵母、毕赤酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、汉森氏酵母、杜氏藻、德巴利民酵母、毛霉菌、球拟酵母、甲基杆菌、芽孢杆菌、埃希氏杆菌、假单胞菌、根瘤菌和链霉菌，优选大肠杆菌。
5.根据权利要求1~4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将催化反应完成后得到的反应混合 物除去催化剂后加盐酸酸化并在O~20°C下结晶，得到所述苯甲酸衍生物。
6.根据权利要求1~4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述反应混合物中苯甲腈衍生物的浓度为5mM~2M。
7.根据权利要求1~4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述反应混合物中产生的苯甲酸衍生物的浓度为0.02~90wt%，优选为0.02~40wt%。
8.根据权利要求1~4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述反应混合物的pH值保持在5.0~10.0，优选5.5~8.0 ;反应温度为O~65°C，优选5~35°C。
9.根据权利要求1~4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述酶催化剂在所述反应混合物中的量为0.1~250g/L，优选I~50g/L。
10.根据权利要求1~9中任意一项所述的方法，其特征在于，所述苯甲腈衍生物为对氨甲基苯甲腈和/或对氯甲基苯甲腈。
【文档编号】C12P13/00GK103757068SQ201410012864
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】陈振明, 朱兆火, 周硕, 张双玲, 李子剑, 赖敦岳, 李伟 申请人:浙江台州清泉医药化工有限公司, 杭州师范大学, 江苏清泉化学有限公司