一种宛氏拟青霉菌f1-23以及利用其处理含甲醛工业废水的方法
【专利摘要】本发明属于微生物及应用，特别是指一种宛氏拟青霉菌F1-23以及利用其处理含甲醛工业废水的方法。将宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC?No.M2013471或将固定有宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC?No.M2013471的载体接入含甲醛工业废水中，混合振荡处理或充分接触后降解含甲醛工业废水中的甲醛；所述的工业废水中甲醛的含量低于6.0g/L。本发明解决了现有微生物降解的甲醛浓度低等问题，具有微生物降解甲醛能力高、遗传性好、可通过菌体固定和循环处理降解高浓度含甲醛的工业废水等优点。
【专利说明】一种宛氏拟青霉菌F1-23以及利用其处理含甲醛工业废水的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物及应用，特别是指一种宛氏拟青霉菌F1-23以及利用其处理含甲醛工业废水的方法。
【背景技术】
[0002]甲醛(HCH0)，常温下为具有刺激性和窒息性的无色气体，商品为其水溶液，世界上产量最高的十种化学品之一。其水溶液在农业、林业、畜牧业、生物学和医药中普遍用作消毒、防腐和熏蒸剂。甲醛对人体有害，主要是因为甲醛可以和人体中的蛋白质结合，改变蛋白质内部结构并使其凝固，因而具有杀伤力。目前，除甲醛的方法主要有化学反应方法、物理吸附技术、臭氧负离子技术、纳米光催化技术、等离子技术等；这些方法都存在降解不彻底、降解时间长、成本高等缺点(Saeed M., 2005.World Journal of Microbiology andBiotechnology.21:1299-1301.)微生物法则以生态环境中的有益菌为材料降解甲醛，成本低，效果好，而且无二次污染。
[0003]本世纪初，采用微生物降解甲醛就日益受到广泛的关注。在微生物中广泛存在着一条甲醒氧化途径(Barber RD., 1998.Journal of MolecularBiology.280 (5): 775-784.),作用于这条途径的关键酶甲醒脱氢酶(formaldehydedehydrogenase, FADH，ECl.2.1.1)是中等锌链醇脱氢酶家族中的一个，存在于绝大多数原核以及所有的真核微生物中(Barber RD., 1996.Journal of Bacteriology.178
(5):1386-1393.)。对 于微生物的甲醛解毒具有重要作用，也是目前研究微生物降解甲醛的关键性环节。目前已有报道的甲醒降解菌大部分为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)(SaeedM., 2005.World Journal of Microbiology and Biotechnology.21:1299-1301;AdroerN., 1990.Applied Microbiology and Biotechnology.33:217-220;谢文娟，等.2011.微生物学通报.38(11):1626-1631;徐云等.2010.环境科学.31 (10):2481-2486;李章良等.2011.环境工程学报.5 (11):2547-2551.)，这些微生物所能降解的浓度较低，一般为
0.1-ο.8g/L，而工业废水的甲醛浓度含量一般为3g/L，这就需要选育耐受浓度更高、降解能力更强的菌株。
[0004]传统的微生物人工选育方法有诱变育种、杂交育种(包括原生质体融合)和基因工程育种。其中诱变育种最为广泛，是采用物理或化学因素处理微生物细胞群体，促使其中少数细胞中的遗传物(DNA)结构发生变化，从而引起微生物遗传性状发生改变，然后从群体中筛选出优良突变株的过程。通过现有的育种方法已经获得部分降解高浓度甲醛的突变株，而这些方法仍将成为菌种选育的重要策略。
[0005]目前，报道较多的是甲醛废水可通过需氧(Hidalgo A.，2002.AppliedMicrobiology and Biotechnology.58 (2): 260-263.)或厌氧方式(Mingbo QU., 1997.Biotechnology and Bioengineering.55 (5-6): 727-736;OmiI F.,1991.EnzymeMicrobiol.24 (5-6):255-262.)进行生物降解，主要采用活性污泥对甲醛废水进行处理(王志海等，2009.中国给水排水.25 (I):55-57;徐仲均等.2008.环境工程学报.2
(9): 1174-1176; Eiroa M., 2005.Bioresource Technology.96 (17): 1914-1918.),而关于应用微生物固定化技术降解甲醛废水的报道几乎没有。用微生物固定化技术处理污水与其他治理技术相比，具有提高污染物的去除效率，减轻后续污泥处置的负担，有利于沉淀过程的泥水分离，对有毒物质的承受能力强、稳定性好等特点。因此，微生物固定化技术已成为国内外废水处理领域的研究热点(王里奥等，2004.重庆大学学报.27 (3):125-129;张蕾等，2009.湖北第二师范学院学报.26 (2):39-42.)。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一是提供一种宛氏拟青霉菌F1-23。
[0007]本发明的目的之二是提供利用宛氏拟青霉菌F1-23处理含甲醛工业废水的方法。
[0008]本发明的整体技术构思是:
[0009]一种宛氏拟青霉菌 Fl-23 (paecilomyces variotii F1-23),其保藏编号为 CCTCCN0.M2013471。
[0010]利用宛氏拟青霉菌处理含甲醛工业废水的方法，将宛氏拟青霉菌Fl-23 CCTCCN0.M2013471或将固定有宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.M2013471的载体接入含甲醛工业废水中，混合振荡处理或充分接触后降解含甲醛工业废水中的甲醛；所述的工业废水中甲醛的含量低于6.0g/L。
[0011]甲醛浓度过高，也会抑制宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.M2013471的降解性能，因此甲醛溶液的浓度不能高于6.0g/L。
[0012]上述微生物已于2013年10月13日提交中国典型培养物保藏中心(简称CCTCCM^藏，其保藏编号为CCTCC N0.M2013471，该保藏单位的地址位于湖北省武汉市武汉大学内。
[0013]上述微生物的形态特征为:化能异养；嗜温；趋酸。25°C培养5d，菌落平薄，粗糙，稍呈颗粒状；外缘为白色，内部为棕黑色；干燥无渗出液，表面有不规则的辐射皱折沟纹。菌丝中没有横隔膜；孢囊孢子(4-5) X (2-3) ym，椭圆形，呈囊状结构。
[0014]本发明的具体技术构思还有:
[0015]宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.M2013471的固体培养基采用如下单位质量的组分组成:
[0016]葡萄糖10-30 ;牛肉膏 2-4 ；KC10.5 ;MgS04.7Η201 ;FeS04.7Η200.I ;琼脂 18-20 ;水1000 ；pH=7.2-7.5 ；
[0017]宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.Μ2013471的液体培养基采用如下单位质量份数的组分组成:
[0018]葡萄糖10-30 ;牛肉膏 2-4 ；KC10.5 ；MgS04.7H201 ；FeS04.7Η200.I ；水 1000 ；ρΗ=7.2-7.5。
[0019]所述的含甲醛工业废水进行降解甲醛处理前，还包括一预处理步骤，该预处理步骤用于降低工业废水中的COD、BOD及金属离子的浓度。
[0020]所述的含甲醛工业废水的预处理可以采用多种现有技术实现，考虑到应用和时间的成本，并且经活性污泥处理后的废水对宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.M2013471的影响不大，预处理步骤优选采用如下工艺实现:[0021]A、采集活性污泥
[0022]从污水处理厂采集活性污泥；
[0023]B、混合振荡培养
[0024]将活性污泥与含甲醛的工业废水混合，进行振荡培养；
[0025]C、静置沉降
[0026]将步骤B中振荡培养后的产物静置沉降，将沉淀物回收再利用，上清液用于甲醛的降解处理。
[0027]所述的载体是指对宛氏拟青霉菌CCTCC N0.M2013471的菌体具有高度吸附能力的多孔性材质。所述的载体优选采用但不局限于中空纤维、高岭土、多孔玻璃、活性炭、硅胶。
[0028]所述的宛氏拟青霉菌CCTCC N0.M2013471在载体上的固定包括如下步骤:
[0029]a、将载体置于含有宛氏拟青霉菌CCTCC N0.M2013471的液体培养基中进行培养；
[0030]b、宛氏拟青霉菌CCTCC N0.M2013471吸附于载体上完成菌体的固定化。
[0031]降解甲醛能力的测定方法如下，利用此方法作为筛选宛氏拟青霉菌F1-23CCTCCN0.M2013471的评价基础。
[0032]甲醛的测定，甲醛在pH=5.5-7.0条件下与乙酰丙酮及铵离子反应生成黄色物质，在波长414nm有吸收峰，与标准系列比较定量。
[0033](I)硫酸标准滴定溶液的标定(用无水碳酸钠标定法):配置0.5mol/L的硫酸标准滴定溶液时，取98%的浓硫酸72ml，沿盛有蒸馏水的烧杯壁缓慢注入水中；待溶液温度降至室温，再加蒸馏水定容至1L，摇匀。标定浓度时，称取经60°C烘至恒重的基准无水碳酸钠
1.lg，置250ml碘量瓶中，加蒸馏水50ml使溶解。加甲基红-溴甲酚绿混合指示液1_2滴，用配制的硫酸滴定液滴定。待溶液由绿色变为紫红色时，煮沸2min。冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色时，记录硫酸滴定液的用量。取三次平行测定结果的平均值为最终结果，平行样间的误差不得大于0.1%。
[0034]以摩尔质量表示的硫酸滴定液浓度C，按下式计算:
[0035]c (mol/L) =m/ (0.1060X Y )
[0036]式中:m——无水碳酸钠质量，g ；
[0037]——硫酸滴定液体积，ml ；
[0038]0.1060-lmol/L硫酸滴定液Iml相当于0.1060g无水碳酸钠。
[0039](2)甲醛标准溶液的标定:甲醛与过量的中性亚硫酸钠溶液反应，生成氢氧化钠，以百里香酚酞作为指示剂，用硫酸标准滴定液滴定。测定时，与250ml锥形瓶中加入50ml亚硫酸钠溶液及2-3滴百里香酚酞指示液，用硫酸标准滴定溶液中和至蓝色刚刚消失。用减量法称取1.3-1.5g甲醛标准溶液，精确至0.0002g，放入上述锥形瓶中，用硫酸标准滴定溶液中和至蓝色刚刚消失为终点。取三次平行测定结果的算术平均值为测定结果。三次平行测定结果的误差不得高于0.1%。
[0040]以质量百分数表示甲醛含量X按下式计算:
[0041]X= y X c X 2 X 100 X 0.3003/m= Y X c X 6.006/m
[0042]式中:Y —滴定消耗硫酸标准滴定溶液的体积，ml ；
[0043]C—硫酸标准滴定溶液的试剂浓度，mol/L ；
[0044]m-试样的质量，g ;[0045]0.03003——与 1.0Oml 硫酸标准滴定溶液[c (1/2H2S04) =1.000mol/L]相当的甲
醛质量(g)。
[0046](3)甲醛标准曲线的测定:取干净试管6支，取0、0.05、0.10,0.15、0.20和0.25ml上述甲醛标准液于试管中，补加蒸馏水至5ml，添加乙酰丙酮lml，55°C水浴中煮沸15min，反应时间需严格控制。以空白管校正零点，于414nm处测定吸光值A，以浓度为横坐标，A值为纵坐标，绘制出标准曲线。
[0047]检测菌种时，将斜面菌体接入装有50ml实验培养基的250ml锥形瓶中，28°C、ISOrpm培养5d。发酵液过滤，滤液根据标准曲线测定剩余甲醛含量即可。
[0048]本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于:
[0049]1、本发明中的宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.M2013471在甲醛耐受性和降解能力上均有提高，分为提高了 22.2%和23.8%，遗传稳定性优良。
[0050]2、本发明采用具备较强吸附能力的载体固定中空纤维固定宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.M2013471，能在短时间内(2h)降解甲醛(3.725g/L)，这一浓度高于常见工业废水的甲醛含量(3%)。对于高浓度甲醛含量的工业废水，可以通过循环处理的方式解决。
[0051]3、另外，本发明运用微生物降解作为降解甲醛主要方式，在运行过程中不会产生二次污染，能够重复利用，节约生产成本，有利于规模化扩大。
[0052]本发明中所描述的已于2013年10月13日提交中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC N0.M2013`471。
【具体实施方式】
[0053]以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
[0054]实施例1
[0055]一种宛氏拟青霉菌 Fl-23 (paecilomyces variotii F1-23),其保藏编号为 CCTCCN0.M2013471。
[0056]利用宛氏拟青霉菌处理含甲醛工业废水的方法，将宛氏拟青霉菌F1-23CCTCCN0.M2013471或将固定有宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.M2013471的载体接入含甲醛工业废水中，混合振荡处理或充分接触后降解含甲醛工业废水中的甲醛；所述的工业废水中甲醛的含量低于6.0g/L。
[0057]宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.M2013471的固体培养基采用如下单位质量的组分组成:
[0058]葡萄糖10-30 ;牛肉膏 2-4 ；KC10.5 ;MgS04.7Η201 ;FeS04.7Η200.I ;琼脂 18-20 ;水1000 ；pH=7.2-7.5 ；
[0059]宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.Μ2013471的液体培养基采用如下单位质量份数的组分组成:
[0060]葡萄糖10-30 ;牛肉膏 2-4 ；KC10.5 ；MgS04.7H201 ；FeS04.7Η200.I ；水 1000 ；ρΗ=7.2-7.5。[0061]所述的含甲醛工业废水进行降解甲醛处理前，还包括一预处理步骤，该预处理步骤用于降低工业废水中的COD、BOD及金属离子的浓度。
[0062]所述的含甲醛工业废水的预处理可以采用多种现有技术实现，考虑到应用和时间的成本，并且经活性污泥处理后的废水对宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.M2013471的影响不大，预处理步骤优选采用如下工艺实现:
[0063]A、采集活性污泥
[0064]从污水处理厂采集活性污泥；
[0065]B、混合振荡培养
[0066]将活性污泥与含 甲醛的工业废水按照质量比为1:2的比例混合，在25 V、150rpm振荡培养4-6小时；
[0067]C、静置沉降
[0068]将步骤B中振荡培养后的产物静置沉降，将沉淀物回收再利用，上清液用于甲醛的降解处理。
[0069]采用上述方法制备的含有宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.M2013471的液体培养基对下列甲醛含量不同的工业废水进行处理结果如下:
[0070]1、甲醛浓度1.12g/L，菌体接种量10%，混合振荡12h，甲醛彻底降解。
[0071]2、甲醛浓度2.24g/L，菌体接种量10%，混合振荡36h，甲醛彻底降解。
[0072]3、甲醛浓度3.73g/L，菌体接种量10%，混合振荡36h，甲醛彻底降解。
[0073]4、甲醛浓度5.60g/L,菌体接种量10%，混合振荡36h，甲醛降解率69% ;菌体接种量20%，混合振荡36h，彻底降解甲醛。
[0074]实施例2
[0075]本实施例中菌种、菌种的培养及含甲醛工业废水的预处理如实施例1，将10根长IOcm的中空纤维(孔径为0.1 μ m)束成一捆，置入同一液体培养基中，在25°C、180转/分钟条件下培养3-5天，致使宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.M2013471吸附在中空纤维上，完成固定化过程。在无菌环境中，切碎附着有宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.M2013471 (生物量约为0.1g)的中空纤维，填充于中空的柱子(Ψ=13πιπι，L=IOcm)中；通过蠕动泵以0.45ml/min流速将浓度为3.725g/L的甲醛溶液注入柱子中，当液体流出柱子时，几乎不含甲醛。
[0076]采用上述装置处理含甲醛的工业废水2h后，用去离子水清洗柱子，之后可再次循环使用。
[0077]同时，试验了含甲醛浓度低于3.725g/L的甲醛溶液，将其流经该装置，在2h内均可以彻底降解溶液中的甲醛，且可以反复使用数次。
[0078]对于污染度较高的造纸厂废水，其甲醛含量高达5g/L，用上述装置处理该废水，在2h内甲醛降解为70%，即流出的废水中甲醛含量为1.5g/L ;再次将废水流经装置进行二次处理，即可彻底降解其甲醛。这一重复使用的优势是其他去除甲醛方法所不具备的。
[0079]菌体吸附的时间(即固定化时间)与载体种类有密切关系，具体参数如下表所示。
[0080]
【权利要求】
1.一种宛氏拟青霉菌F1-23，其特征在于其保藏编号为CCTCC N0.M2013471。
2.根据权利要求1所述的宛氏拟青霉菌F1-23，其特征在于宛氏拟青霉菌F1-23CCTCCN0.M2013471的固体培养基采用如下单位质量的组分组成:
葡萄糖 10-30 ;牛肉膏 2-4 ；KC10.5 ；MgS04.7H201 ；FeS04.7Η200.I ;琼脂 18-20 ；水1000 ；pH=7.2-7.5 ； 宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC ΝΟ.Μ2013471的液体培养基采用如下单位质量份数的组分组成:
葡萄糖 10-30 ;牛肉膏 2-4 ；KC10.5 ；MgS04.7H201 ；FeS04.7Η200.I ；水 1000 ；ρΗ=7.2-7.5。
3.利用宛氏拟青霉菌F1-23处理含甲醛工业废水的方法，其特征在于将宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.M2013471或将固定有宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.M2013471的载体接入含甲醛工业废水中，混合振荡处理或充分接触后降解含甲醛工业废水中的甲醛；所述的工业废水中甲醛的含量低于6.0g/L。
4.根据权利要求3所述的利用宛氏拟青霉菌F1-23处理含甲醛工业废水的方法其特征在于所述的含甲醛工业废水进行降解甲醛处理前， 还包括一预处理步骤，该预处理步骤用于降低工业废水中的COD、BOD及金属离子的浓度。
5.根据权利要求4所述的利用宛氏拟青霉菌F1-23处理含甲醛工业废水的方法其特征在于所述的预处理步骤包括如下步骤: A、采集活性污泥 从污水处理厂采集活性污泥； B、混合振荡培养 将活性污泥与含甲醛的工业废水混合，进行振荡培养； C、静置沉降 将步骤B中振荡培养后的产物静置沉降，将沉淀物回收再利用，上清液用于甲醛的降解处理。
6.根据权利要求3所述的利用宛氏拟青霉菌F1-23处理含甲醛工业废水的方法其特征在于所述的载体是指对宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.M2013471的菌体具有吸附能力的多孔性材质。
7.根据权利要求3或6所述的利用宛氏拟青霉菌F1-23处理含甲醛工业废水的方法其特征在于所述的载体选自中空纤维、高岭土、多孔玻璃、活性炭、硅胶中的一种。
8.根据权利要求3所述的利用宛氏拟青霉菌F1-23处理含甲醛工业废水的方法其特征在于所述的宛氏拟青霉菌F1-23CCTCC N0.M2013471在载体上的固定包括如下步骤: a、将载体置于含有宛氏拟青霉菌F1-23CCTCCN0.M2013471的液体培养基中进行培养; b、宛氏拟青霉菌F1-23CCTCCN0.M2013471吸附于载体上完成菌体的固定化。
【文档编号】C12N1/14GK103710273SQ201410012922
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】姚璐晔, 吴金男, 冀宏, 徐兵, 邢鋆, 高杏, 顾佳佳, 曹叶萍 申请人:常熟理工学院