一种同时检测水生动物五种dna病毒的多重荧光pcr试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种同时检测水生动物五种DNA病毒的多重荧光PCR试剂盒，包括缓冲液，还包括5对荧光PCR引物和5条分子信标探针和PCR引物，所述5对荧光PCR引物和5条分子信标探针分别对应斑点叉尾鮰病毒、流行性造血器官坏死病病毒、金鱼造血器官坏死病病毒、锦鲤疱疹病毒和真鲷虹彩病毒；所述荧光PCR引物和分子信标探针包括SEQIDNO.3-17的核苷酸序列；所述PCR引物包括SEQIDNO.1-2的核苷酸序列。本发明制备的同时检测水生动物五种DNA病毒的多重荧光PCR试剂盒，可以实现对所有感染水生动物的DNA病毒一次性快速检测，灵敏性增强，减少了单个样品的检测费用。
【专利说明】—种同时检测水生动物五种DNA病毒的多重荧光PCR试剂盒。
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】的荧光PCR试剂盒，具体涉及一种同时检测水生动物五种DNA病毒的多重荧光PCR试剂盒。
【背景技术】
[0002]我国是一个养殖业大国，也是一个水生动物及其产品进出口大国和消费大国，同时也是一个疫情疫病高发、频发的国家。随着可捕捞资源的急剧减少，水产养殖已成为我国为满足人民群众日益增长的蛋白质需求而不得不采用的重要举措。但病害损失严重制约着水产养殖业的健康可持续发展，养殖模式、生态环境变化以及病原体在多宿主间传播均影响水生动物疫病的流行，由病毒引起的疾病对现代水产品养殖造成了极大的危害，由于国内养殖方式高密度化，水生动物传染性疾病就像悬在养殖户头上的利剑，时时刻刻威胁着我国的渔业发展。同时，随着国际交往和国际贸易日趋频繁，水生动物及其产品的进出口贸易日渐增多，水生动物疫病传染的风险也随之加剧。近年来我国参与国际贸易活动与日剧增，每天有大量的水产品通关，满足了国内市场对海产品的需求，同样，国内养殖场的水产品也保障了供香港、澳门和通往国际市场的贸易供给。因此，国家的各个口岸是重要水生动物疫病传入和传出的高风险地区，水生动物疾病的检验检疫工作在防控流行病的传播中发挥着重要作用。水生动物疫病的病原检测要求检测方法具有灵敏、特异和经济的特点，但是，目前采用的分子生物学检测方法具有相对灵敏和特异的要求，面对各种病原的检测，所用方法只是针对一个标本，通过一个实验仅能对一个靶基因进行分析，不能将检测方法整合。如果采用多重PCR可以增加检测效率和降低检测经济成本，更重要的是提高检测方法的敏感性。
[0003]目前，世界各国严重关注的感染鱼类的病毒性传染病主要有13种，其中双链DNA病毒疫病有5种，快速和同步检出所有病毒是当前养殖鱼类和口岸水产品检测的迫切需求，由于病毒结构的差异，这是极具挑战的课题，DNA病毒与RNA病毒结构差异较大，同时检测这两大类病毒的难度也较大。经研究水生动物DNA病毒在DNA聚合酶基因的结构上有一定共性,可以尝试作为突破口，运用一种试剂盒同步检测所有DNA病毒。
【发明内容】
[0004]为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种同时检测水生动物五种DNA病毒的多重荧光PCR试剂盒，以实现对所有感染水生动物的DNA病毒一次性快速检测，灵敏性增强，减少了单个样品的检测费用。
[0005]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下:
[0006]一种同时检测水生动物五种DNA病毒的多重荧光PCR试剂盒，包括缓冲液，还包括5对荧光PCR引物和5条分子信标探针和PCR引物，所述5对荧光PCR引物和5条分子信标探针分别对应斑点叉尾鮰病毒、流行性造血器官坏死病病毒、金鱼造血器官坏死病病毒、锦鲤疱疹病毒和真鲷虹彩病毒；所述荧光PCR引物和分子信标探针包括SEQ ID N0.3-17的核苷酸序列；所述PCR引物包括SEQ IDN0.1-2的核苷酸序列。
[0007]优选的，所述分子信标探针SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.8, SEQ IDN0.11、SEQ IDN0.14、SEQ ID N0.17的核苷酸序列5’端和3’端分别与荧光基团和荧光淬灭基团相连。
[0008]优选的，所述5种分子信标探针分别为:
[0009]CCV-T:FAM-ACCCCGAAAATCCCAA-BHQ
[0010]EHNV-T: VIC-AGCCGCCCTCAAGAAC-BHQ[0011 ] GFHNV-T:NED - CCGCCAGTAACATGGA-BHQ
[0012]KHV-T: TET-GGCGTCTAGCCTCAACC-BHQ
[0013]RSIV-T:CY5-ACGCAGAGGGGCTACC-BHQ。
[0014]本发明根据水生动物疫病的病原DNA病毒的特点，发现所有水生动物DNA病毒的DNA聚合酶基因尽管差异较大，但是仍然具有的同源区片段，在这些同源区域设计引物可以通过PCR将所有这些病毒的DNA聚合酶基因得到扩增，然后可以采用多重荧光定量PCR方法将各种病毒基因扩增产物甄别，能够检测携带上述病原的水生动物疫病。与传统PCR和普通荧光PCR相比检测范围得到扩展，灵敏性增强，减少了单个样品的检测费用，通过单只反应管可以对样品是否含有上述五种病原情况做出判断。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为试剂盒制备及使用流程示意图。
[0016]图2为多重荧光PCR检测结果，其中I为GFHNV，2为RSIV，3为KHV，4为EHNV，5为 CCV。
【具体实施方式】
[0017]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0018]实施例1:PCR引物的设计和制备
[0019]对斑点叉尾鮰病毒DNA聚合酶靶基因序列(NCBI序列检索号GenBank N0.:NC_001493.1)、流行性造血器官坏死病病毒DNA聚合酶靶基因序列(NCBI序列检索号GenBank N0.:FJ433873.1)、金鱼造血器官坏死病病毒DNA聚合酶靶基因序列(NCBI序列检索号GenBank N0.: JQ815364.1 )、锦鲤疱疹病毒DNA聚合酶靶基因序列(NCBI序列检索号GenBank N0.:AY939862.1)和真鲷虹彩病毒DNA聚合酶靶基因序列(NCBI序列检索号GenBank N0.:AB007366.1)基因进行比较分析，设计出针对上述五种DNA病毒DNA聚合酶同源区的PCR兼并引物，包括SEQ ID N0.1_2所述的核苷酸序列:
[0020]Han-forward primer:5' -GAYTTYGCNWSNYTNTAYCC-3' (SEQID N0.1)
[0021]Han-reverse primer:5’-TCNGTRTCNCCRTA-3’ (SEQ ID N0.2)。
[0022]使用该引物做PCR可以将样品中痕量DNA片断进行扩增，使样品信号的到初级放大，经过测试，该引物可以对鱼类所有DNA病毒的聚合酶基因初步扩增。
[0023]实施例2:特异性引物及分子信标探针的合成
[0024](一)特异性引物的设计
[0025]分别根据斑点叉尾鮰病毒、流行性造血器官坏死病病毒、金鱼造血器官坏死病病毒、锦鲤疱疹病毒和真鲷虹彩病毒DNA聚合酶靶基因序列合成5对特异性引物。
[0026](二)分子信标探针靶序列的选择
[0027]对斑点叉尾鮰病毒、流行性造血器官坏死病病毒、金鱼造血器官坏死病病毒、锦鲤疱疹病毒和真鲷虹彩病毒DNA聚合酶靶基因序列的同源性进行比较，确定每种病毒杂交探针的选择范围，运用Primer5.0软件寻找所有可能的探针序列，筛选符合条件的探针序列，并运用BLAST软件分析探针的特异性，获得5条分子信标探针靶序列。
[0028]特异性引物和分子信标探针靶序列如下表1:
[0029]表1、特异性引物和分子信标探针靶序列对照表
[0030]
【权利要求】
1.一种同时检测水生动物五种DNA病毒的多重荧光PCR试剂盒，包括缓冲液，其特征在于，还包括5对荧光PCR引物和5条分子信标探针和PCR引物，所述5对荧光PCR引物和5条分子信标探针分别对应斑点叉尾鮰病毒、流行性造血器官坏死病病毒、金鱼造血器官坏死病病毒、锦鲤疱疹病毒和真鲷虹彩病毒；所述荧光PCR引物和分子信标探针包括SEQ IDN0.3-17的核苷酸序列；所述PCR引物包括SEQ ID N0.1-2的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的同时检测水生动物五种DNA病毒的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述分子信标探针 SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.1USEQ ID N0.14、SEQID N0.17的核苷酸序列5’端和3’端分别与荧光基团和荧光淬灭基团相连。
3.如权利要求1或2所述的同时检测水生动物五种DNA病毒的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述5种分子信标探针分别为:
CCV-T:FAM-ACCCCGAAAATCCCAA-BHQ
EHNV-T:VIC-AGCCGCCCTCAAGAAC-BHQ
GFHNV-T:NED_ CCGCCAGTAACATGGA-BHQ
KHV-T: TET-GGCGTCTAGCCTCAACC-BHQ
RSIV-T:CY5-ACGCA GAGGGGCTACC-BHQ。
【文档编号】C12Q1/70GK103773895SQ201410014663
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】兰文升, 刘荭, 王津津, 史秀杰, 郑晓聪, 贾鹏, 于力, 何俊强, 黄佳鸣 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心