抗凝血酶iii组合物的制造方法
【专利摘要】本发明涉及抗凝血酶III组合物的制造方法。具体而言，本发明提供一种含有具有复合体型N-糖苷连接糖链的抗凝血酶III分子的抗凝血酶III组合物的制造方法，其中所述的复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖未结合岩藻糖的结构。
【专利说明】抗凝血酶I I I组合物的制造方法
[0001]本申请是申请日为2004年10月8日、中国国家申请号为200480035813.9、发明名称为“抗凝血酶III组合物的制造方法”申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及含有具有复合体型N-糖苷连接的糖链的抗凝血酶III分子的抗凝血酶III组合物的制造方法，其中所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未结合岩藻糖的结构。
【背景技术】
[0003]血栓的形成会带来血流中断的危险。由于血栓形成引起的血流中断成为一种致命因素，活体可以通过几种机制来控制和调节血液凝固。即，通过丝氨酸蛋白酶直接灭活活化的凝血因子[The Thrombin, Volume I (Machovich R.主编)，pp.1-21，CRCPress, Boca Raton (1982)]，基于通过活化蛋白C来降解凝血因子V和凝血因子VIII的调控机制[Progress in Hemostasis and Thrombosis, Volume7 (Spaet T.H.主编)，pp.25-54, Grune&Stratton, New York (1984)],以及通过血液中的多种丝氨酸蛋白酶抑制剂对活化凝血因子的抑制机制。另外，还发现了以依赖活化X因子的方式存在的抑制
VII因子活化的组织因子抑制剂[Journal of Japanese Society on Thrombosis andHemostasis, 2, 550 (1991)]。其中最重要的机制是血液中多种丝氨酸蛋白酶抑制剂对活化凝血因子的抑制机制。 [0004]血液中存在多种丝氨酸蛋白酶抑制剂，其含量达到总血浆蛋白的10%。已知这些抑制剂中的4种抑制剂，即抗凝血酶II1、α I蛋白酶抑制剂、α 2巨球蛋白和肝素辅助因子II对于调节血液凝固是非常重要的。在这些因子中，抗凝血酶III尤其重要，占血浆抗凝血酶活性的70%。
[0005]抗凝血酶III是含有432个氨基酸的糖蛋白，其分子量大约为59，000至65，000，并且其分子中有 3 个二硫键，Cys8_Cysl28、Cys21_Cys95 和 Cys247_Cys430[Proc.Natl.Acad.Sci, USA, 80, 1845 (1983)]。通过这些键，在C端形成一个大的环状结构，在这个环状结构中存在有作为活性中心的Arg393-Ser394键(图1)。人抗凝血酶III的等电点为5.11。N糖苷连接糖链结合在抗凝血酶III的4个位点上，即从N端数第96个、第135个、第155个和第192个天冬酰胺残基(下文中分别称为Asn96、Asnl35、Asnl55和Asnl92)上。抗凝血酶III在人血浆中以两种异构形式存在，α型具有4个N糖苷连接的糖链，β型仅有3个N糖苷连接的糖链，却没有Asnl35上的糖链[Pathophysiol.Haemost.Thromb., 32, 143(2002)]，人血浆中的抗凝血酶III中，90-95%是α型，其余5-10%是β型。
[0006]结合在抗凝血酶III上的复合体型N-糖苷连接的糖链由N-乙酰氨基葡萄糖、唾液酸、半乳糖和甘露糖构成(图2)。人血浆中分布的抗凝血酶III的特性之一是它的糖链结构未经岩藻糖修饰。
[0007]抗凝血酶III已经被开发为一种血液凝固抑制剂，在全球广泛用于治疗先天性抗凝血酶III缺陷引起的血栓形成和伴有抗凝血酶III减少的多发性血管内血液凝固综合征。
[0008]诸如抗凝血酶III的血液制品使用混合的人血浆样品作为原料而生产。在日本，混合血浆在日本红十字会血浆分离中心制备，在进行6个月的储存后将大约5，000至10，000名志愿者的血浆样品混合而提供。事实上，为生产一批血液制品如Cross Eight M(日本红十字会)的干燥浓缩人血液凝血因子VIII制品，需要几批从上述混合血浆中获得的冷冻沉淀物，使用大约80，000名志愿者的血衆样品[Japanese Journal of Transfusion
Medicine, 48, 27 (2002)]。
[0009]混合血浆是使用献血者提供的血液样品作为原料生产的，已有报道日本献血者中人细小病毒B19阳性的比例估计为0.6-0.8%[Journal of Japan Society of BloodTransfusion, 42, 231( 1996)] ?因此,可以计算出与上述Cross Eight M等量的一份制品要被相当于大概480至640名献血者的人细小病毒B19阳性血液样品污染。人细小病毒B19是一种直径为18至26nm、没有被膜的小病毒，其即使在60°C进行热处理30分钟、在大约pH3下的酸处理、氯仿处理、表面活性剂处理和类似处理后仍保持其抗性[Science，2盤，114(1993)]，使得它不能被一般的病毒清除方法清除。因此，清除人细小病毒B19需要有通过清除被膜病毒专用的膜的过滤步骤，所述膜的孔径为几纳米至几十纳米。但是，人们认为使用孔径这样小的过滤步骤，即纳米过滤步骤很难被许多血浆分离制品的制造方法所米用[Japanese Journal of Transfusion Medicine, 48, 27 (2002)]。人们认为人细小病毒B19是传染性红斑的病因，在没有抗-B19抗体的健康人群中一般仅显示短暂的类似感冒的症状，但是在一些病例中引发慢性溶血性贫血。而且，据说在免疫缺陷患者中有时也可诱发严重的急性单纯红细胞发育不全。另外，有报道称没有抗-B19抗体的孕妇有时引起流产或导致未出生的婴儿水肿，15%的子宫内胎儿死亡B19 DNA检查的结果呈阳性[Lancet, 357, 1494 (2001)]。在Cross Eight M (日本红十字会)的干燥浓缩人凝血因子
VIII制品中，1997年9月报道了一例怀疑由于给予这种制品而暂时感染人细小病毒B19的病例[Journal of Japanese Society of Child Hematology, 11, 289 (1997)]。
[0010]乙型肝炎阴性、丙型肝炎阴性和人免疫缺陷病毒I和II阴性的混合血浆被用作抗凝血酶 III 血液制品如 Neuart (Mitsubishi Pharma Corporation 制造)和 Anthrobin P(Aventis Boehring制造)的制造原料,但是在原料中并未确认是否存在人细小病毒B19。
[0011]尽管抗凝血酶III血液制品的生产过程中要在60°C进行病毒灭活处理10小时，gp巴氏灭菌，仍然有许多问题还不能完全解决，如蛋白抗凝血酶III被变性，以及AIDS病毒、人细小病毒和可引起突变型克雅氏病的朊病毒(prion)。
[0012]如上所述，使用血液制品的缺点在于有病毒感染的危险，这种危险性采用现有技术不能完全排除。因此，抗凝血酶III制剂的安全性需要提高。
[0013]因此，为了不使用人体血浆作为原料提供人抗凝血酶III，已经考虑使用重组体作为其替代品。但是，采用基因重组技术制备的重组抗凝血酶III在活性上次于从天然原料如血浆中获得的抗凝血酶III。其原因考虑是因为结合在重组体上的糖链结构与从血浆中制备的抗凝血酶III 不同，具体地说，推测由于岩藻糖结合在待与重组抗凝血酶III结合的复合体型N-糖苷连接的糖链上，其与肝素的亲和性变低，因此便不能获得足够的抗血液凝固活性[Journal of Biological Chemistry, 268, 17588 (1993) !Biochemistry, 35, 8881(1996)] ο迄今，有报道通过自幼年仓鼠肾得到的BHK细胞[Journal of BiologicalChemistry.268.17588 (1993) biochemistry.35.8881 (1996)]、自中国仓鼠(Chinesehamster )卵巢得到的CHO细胞(W002/02793 )或转基因山羊(US2003096974)生产的重组抗凝血酶III，但是在每一个这些例子中，岩藻糖结合在与重组抗凝血酶III结合的复合体型N-糖苷连接的糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上。在产生的重组抗凝血酶III中，结合有岩藻糖的复合体型N-糖苷连接的糖链与全部复合体型N-糖苷连接的糖链的比例取决于宿主细胞而变化，但是估计其范围为39-95%。已经采取了许多努力通过多种装置如改善培养方法来减少糖链中结合有岩藻糖的复合体型N-糖苷连接的糖链的比例，但是仍然不能成功地制造糖链结构与天然抗凝血酶III相同的重组抗凝血酶III。
【发明内容】
[0014]本发明涉及下列(I)至(24)的内容:
[0015](I)一种抗凝血酶III组合物的制造方法,其包括:在培养基中培养通过将编码抗凝血酶III的DNA导 入经基因重组修饰的宿主细胞中获得的转化体，在培养物中形成并积累含有具有复合体型N-糖苷连接糖链的抗凝血酶III分子的抗凝血酶III组合物，其中所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未结合岩藻糖的结构；和从培养物中回收抗凝血酶III组合物。
[0016](2)根据(I)的方法，其中所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端N-乙酰氨基葡萄糖的6-位未结合岩藻糖1-位的结构。
[0017](3)根据(I)或(2)的方法，其中所述的宿主细胞中的基因组被修饰成:与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶活性缺失，或者与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α -键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶活性缺失。
[0018](4)根据(I)至(3)中任意一项的方法，其中所述的宿主细胞中编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶或者与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α -键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶的基因组中的所有等位基因已经被敲除。
[0019](5)根据(3)或(4)的方法，其中所述与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶选自⑶P-甘露糖4，6-脱水酶(GMD)和⑶Ρ-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶(Fx)。
[0020](6)根据(5)的方法，其中所述的⑶P-甘露糖4，6-脱水酶是由选自下列(a)和(b)的DNA编码的蛋白:
[0021](a)含有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的DNA ；
[0022](b)与由SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有⑶P-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白的DNA。
[0023](7)根据(5)的方法，其中所述的⑶P-甘露糖4，6-脱水酶是选自(a)、(b)和(c)的蛋白:
[0024](a)含有SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列的蛋白；
[0025](b)由SEQ ID N0:8所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白；
[0026](c)由与SEQ ID N0:8所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白。
[0027](8)根据(5)的方法，其中所述的⑶P-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖_3，5_差向异构酶是由选自下列(a)和(b)的DNA编码的蛋白:
[0028](a)含有SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列的DNA ；
[0029](b)与由SEQ ID N0:9所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有⑶P-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶活性的蛋白的DNA。
[0030](9)根据(5)的方法，其中所述的⑶P-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖_3，5_差向异构酶是选自(a)、(b)和(C)的蛋白:
[0031](a)含有SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列的蛋白；
[0032](b)由SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶活性的蛋白；
[0033](c)由与SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有⑶P-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶活性的蛋白。 [0034](10)根据(3)或(4)的方法，其中所述与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α -键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶是α I, 6-岩藻糖基转移酶。
[0035](11)根据(10)的方法，其中所述的α 1，6_岩藻糖基转移酶是由选自下列(a)至Cd)的DNA编码的蛋白:
[0036](a)含有SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列的DNA ；
[0037](b)含有SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列的DNA ；
[0038](c)与由SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的DNA ；
[0039](d)与由SEQ ID NO: 12所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的DNA。
[0040](12)根据(10)的方法，其中所述的α 1，6_岩藻糖基转移酶是选自下列(a)至(f)的蛋白:
[0041](a)含有SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列的蛋白；
[0042](b)含有SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列的蛋白；
[0043](c)由SEQ ID NO: 13所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白；
[0044](d)由SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白；
[0045](e)由与SEQ ID NO: 13所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白；
[0046](f)由与SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有α?，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白。[0047](13)根据(I)至至(4)中任意一项的方法，其中所述的转化体为FERM BP-08472、FERM BP-10083.FERM BP-10084、FERM BP-10088 或 FERM BP-10089。
[0048](14)根据(I)至(12)中任意一项的方法，其中所述的宿主细胞是选自下列(a)至(j)的细胞:
[0049](a)来源于中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞；
[0050](b)大鼠骨髓瘤细胞系 YB2/3HL.P2.Gil.16Ag.20 细胞；
[0051](C)小鼠骨髓瘤细胞系NSO细胞；
[0052](d)小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0_Agl4细胞；
[0053]Ce)来源于叙利亚仓鼠(Syrian hamster)肾组织的BHK细胞；
[0054](f)人白血病细胞系Namalwa细胞；
[0055](g)胚胎干细胞；
[0056](h)受精卵细胞；
[0057](i)植物细胞；
[0058](j)酵母。 [0059](15)根据(I)至(14)中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III组合物具有复合体型N-糖苷连接的糖链，所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未结合岩藻糖的结构。
[0060](16)根据(I)至(15)中任意一项的方法，其中所述的复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端N-乙酰氨基葡萄糖的6-位未结合岩藻糖1-位的结构。
[0061](17)根据(I)至(16)中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III是含有SEQ IDNO:4所示氨基酸序列的多肽。
[0062](18)根据(I)至(17)中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III是由在SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的多肽。
[0063](19)根据(I)至(18)中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III是由与SEQ IDN0:4所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的多肽。
[0064](20)根据(I)至(19)中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III是由选自下列(a)和(b)的DNA编码的多肽:
[0065]Ca)含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的DNA ；
[0066](b)与由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有肝素结合活性的蛋白的DNA。
[0067](21)根据(I)至(20)中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III来自哺乳动物。
[0068](22)通过根据(I)至(21)中任意一项的方法获得的抗凝血酶III组合物。
[0069](23)含有根据(22)的抗凝血酶III组合物作为活性成分的药物。
[0070](24)根据(23)的药物，其为诊断、预防或治疗伴有血液凝固的疾病的药剂。
[0071]下面将详细描述本发明。本申请要求2003年10月9日提交的日本申请N0.2003-350164的优先权，在此引入该专利申请的说明书和/或附图的全部内容。
[0072]本发明涉及含有具有复合体型N-糖苷连接的糖链的基因重组抗凝血酶III分子的抗凝血酶III组合物的制造方法以及含有所述抗凝血酶III组合物的药物，其中所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未结合岩藻糖的结构。
[0073]在本发明中，抗凝血酶III包括由下列(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(f)中的DNA编码的蛋白，下列(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(η)或(ο)中的蛋白，和类似蛋白:
[0074](a)含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA ；
[0075](b)含有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA ；
[0076](c)含有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的DNA ；
[0077](d)与由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有肝素结合活性的蛋白的DNA ；
[0078](e)与由SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有肝素结合活性的蛋白的DNA ；
[0079](f)与由SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有肝素结合活性的蛋白的DNA ；
[0080](g)含有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的蛋白；
[0081](h)含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的蛋白；
[0082](i)含有SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的蛋白；
[0083](j)由SEQ ID N0:4所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的蛋白；
[0084](k)由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的蛋白；
[0085](I)由SEQ ID N0:6所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的蛋白；
[0086](m)由与SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的蛋白；
[0087](η)由与SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的蛋白；
[0088](ο)由与SEQ ID Ν0:6所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的蛋白。
[0089]编码抗凝血酶111氨基酸序列的DNA还包括含有SEQ ID NO: 1、2或3所示核苷酸序列的DNA，与由SEQ ID NO: 1、2或3所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有肝素结合活性的蛋白的DNA。
[0090]在本发明中，在严格条件下杂交的DNA是指使用例如含有SEQ ID N0:l、2或3所示核苷酸序列的DNA或其片段作为探针，通过集落杂交、噬菌斑杂交、DNA杂交或类似方法获得的DNA。这些DNA的一个具体例子是可以通过在存在0.7至1.0M氯化钠的情况下在65°C下进行杂交而鉴定的DNA，其使用其上固定有来自集落或噬菌斑的DNA的滤膜，然后在65 °C下用0.1至2倍浓度的SSC溶液(I倍浓度的SSC溶液:150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠)洗涤滤膜。可以根据下列文献所述的方法进行杂交:Molecular Cloning，ALaboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)(下文中称为 Molecular Cloning,第二 版)；Current Protocols in Molecular Biology, Johnffiley&Sons (1987-1997)(下文中称为 Current Protocols in Molecular Biology) ；DNACloningl:Core Techniques, A Practical Approach,第二版，Oxford University (1995)等。具体地说,能够在严格条件下杂交的DNA包括与SEQ ID NO: 1、2或3所示核苷酸序列的同源性为至少60%或更高，优选70%或更高，更优选80%或更高，进一步优选90%或更高，尤其优选95%或更高，最优选98%或更高的DNA。
[0091]在本发明中，由SEQ ID N0:4、5或6所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有基本类似于肝素结合活性的活性的蛋白是可以通过下列方法获得的蛋白:例如，通过位点定点诱变将位点定点突变引入编码由SEQ ID NO: 4、5或6所示氨基酸序列组成的蛋白的DNA中，其描述见Molecular Cloning,第二版；Current Protocols in Molecular Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982) ；Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 79, 6409 (1982) ；Gene, M, 315 (1985) ；Nucleic AcidsResearch, 13, 4431 (1985) ；Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82, 488 (1985)等。被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸残基的数目是一个或多个，不进行具体限定，但在其在通过一直方法如上述位点定向诱变可能实现的缺失、取代或添加的范围内。适当的数目为I至数打，优选I至20,更优选I至10,进一步优选I至5。
[0092]由与SEQ ID N0:4、5或6所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有基本类似于肝素结合活性的活性的蛋白包括与由SEQ ID N0:4、5或6所示氨基酸序列组成的蛋白的同源性为至少80%或更高、优选为85%或更高、更优选为90%或更高、进一步优选为95%或更高、特别优选为97%或更高、最优选为99%或更高的蛋白，其分别俥用分析软件如 BLAST「T.Mol.Biol..215.403 (1990)]或 FASTA [Methods inEnzymology, 183, 63 (1990)]进行计算。
[0093]在本发明中，本文所使用的其中在复合体型N-糖苷连接糖链的还原末端N-乙酰氨基葡萄糖并未结合岩藻糖的糖链是指该糖链中，在复合体型N-糖苷连接糖链的还原末端N-乙酰氨基葡萄糖基本没有结合岩藻糖，优选在糖链中，在复合体型N-糖苷连接糖链的还原末端N-糖苷连接糖链上结合的岩藻糖的含量比为0%。本发明的抗凝血酶III组合物具体是指当进行下文4中所述的糖链分析时，基本上检测不到其中岩藻糖的组合物，岩藻糖的含量基本上检测不到是指岩藻糖的含量低于检出限。
[0094]已知与糖蛋白如抗凝血酶III结合的N-糖苷连接糖链具有多种结构，但是具有如下列结构式(I)所示的共有核心结构:
[0095]
【权利要求】
1.一种抗凝血酶III组合物的制造方法，其包括:在培养基中培养通过将编码抗凝血酶III的DNA导入经基因重组修饰的宿主细胞中获得的转化体，在培养物中形成并积累含有具有复合体型N-糖苷连接糖链的抗凝血酶III分子的抗凝血酶III组合物，其中所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未结合岩藻糖的结构；和从培养物中回收所述的抗凝血酶III组合物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位未与岩藻糖1-位结合的结构。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述的宿主细胞中的基因组被修饰成:与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶活性缺失，或者与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α -键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶活性缺失。
4.根据权利要求1至3中任意一项的方法，其中所述的宿主细胞中编码与所述细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶或者与所述复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖6-位通过α -键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶的基因组中的所有等位基因已经被敲除。
5.根据权利要求3或4的方法,其中所述与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶选自⑶P-甘露糖4，6-脱水酶(GMD)和⑶Ρ-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶(Fx)。
6.根据权利要求5的方法，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脱水酶是由选自下列(a)和(b)的DNA编码的蛋白: Ca)含有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的DNA ； (b)与由SEQ ID N0:7所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有⑶P-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白的DNA。
7.根据权利要求5的方法，其中所述的⑶P-甘露糖4，6-脱水酶是选自(a)、(b)和(c)的蛋白: (a)含有SEQID NO:8所示氨基酸序列的蛋白； (b)由SEQID N0:8所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白； (c)由与SEQID N0:8所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有⑶P-甘露糖4，6-脱水酶活性的蛋白。
8.根据权利要求5的方法，其中所述的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶是由选自下列(a)和(b)的DNA编码的蛋白: Ca)含有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的DNA ； (b)与由SEQ ID NO:9所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有⑶P-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶活性的蛋白的DNA。
9.根据权利要求5的方法，其中所述的GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶是选自(a)、(b)和(C)的蛋白: Ca)含有SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的蛋白； (b)由SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶活性的蛋白； (c)由与SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有⑶P-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶活性的蛋白。
10.根据权利要求3或4的方法，其中所述与复合体型N-糖苷连接糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α -键与岩藻糖1-位结合的糖链修饰相关的酶是α I, 6_岩藻糖基转移酶。
11.根据权利要求10的方法，其中所述的al，6-岩藻糖基转移酶是由选自下列(a)至Cd)的DNA编码的蛋白: Ca)含有SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列的DNA ； (b)含有SEQID NO: 12所示核苷酸序列的DNA ； (c)与由SEQID NO: 11所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有α 1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的DNA ； (d)与由SEQID NO: 12所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有α 1,6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的DNA。
12.根据权利要 求10的方法，其中所述的α?，6-岩藻糖基转移酶是选自下列(a)至Cf)的蛋白: (a)含有SEQID NO: 13所示氨基酸序列的蛋白； (b)含有SEQID NO: 14所示氨基酸序列的蛋白； (c)由SEQID NO: 13所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白； (d)由SEQID NO: 14所示氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白； Ce)由与SEQ ID NO: 13所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白； (f)由与SEQID NO: 14所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白。
13.根据权利要求1至4中任意一项的方法，其中所述的转化体为FERMBP_08472、FERMBP-10083、FERM BP-10084、FERM BP-10088 或 FERM BP-10089。
14.根据权利要求1至12中任意一项的方法，其中所述的宿主细胞是选自下列(a)至(j)的细胞: Ca)来源于中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞； (b)大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2.Gil.16Ag.20细胞； (c)小鼠骨髓瘤细胞系NSO细胞； Cd)小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0-Agl4细胞； Ce)来源于叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞； Cf)人白血病细胞系Namalwa细胞； (g)胚胎干细胞； (h)受精卵细胞；(i)植物细胞； (j)酵母。
15.根据权利要求1至14中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III组合物具有复合体型N-糖苷连接的糖链，所述复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上未结合岩藻糖的结构。
16.根据权利要求1至15中任意一项的方法，其中所述的复合体型N-糖苷连接的糖链具有在该糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位未与岩藻糖1-位结合的结构。
17.根据权利要求1至16中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III是含有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽。
18.根据权利要求1至17中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III是由在SEQIDNO:4所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的多肽。
19.根据权利要求1至18中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III是由与SEQIDN0:4所示氨基酸序列的同源性为80%或更高的氨基酸序列组成、并具有肝素结合活性的多肽。
20.根据权利要求1至19中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III是由选自下列(a)和(b)的DNA编码的多肽: Ca)含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA ； (b)与由SEQ ID ΝΟ:1所示核苷酸序列组成的DNA在严格条件下杂交、并编码具有肝素结合活性的蛋白的DNA。
21.根据权利要求1至20中任意一项的方法，其中所述的抗凝血酶III来源于哺乳动物。
22.—种通过根据权利要求1至21中任意一项的方法获得的抗凝血酶III组合物。
23.—种含有根据权利要求22的抗凝血酶III组合物作为活性成分的药物。
24.根据权利要求23的药物，其为诊断、预防或治疗伴有血液凝固的疾病的药剂。
【文档编号】C12N15/15GK103993056SQ201410016193
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2004年10月8日 优先权日:2003年10月9日
【发明者】山田刚士, 佐藤光男, 神田丰, 山野和也 申请人:协和发酵麒麟株式会社