一种红叶石楠高效基因转化的方法
【专利摘要】本发明涉及一种红叶石楠高效基因转化的方法，属于植物生物【技术领域】。具体采用的是基因枪法和农杆菌介导法结合的基因转化方法，其步骤包括：(1)质粒DNA的提取；(2)受体材料的准备；(3)钨粉预处理；(4)微弹制备；(5)基因枪轰击；(6)受体材料的预培养；(7)农杆菌侵染；(8)共培养；(9)抑菌及卡那霉素筛选培养；(10)转化植株PCR和Southern?Blotting检测。本发明采用基因枪法和农杆菌介导法结合的基因转化方法，所获得的转基因株系抗寒性得到了明显提高，导入的AmGS基因提高了转基因株系的抗寒性，从而为培育抗寒品种提供了重要依据。
【专利说明】一种红叶石楠高效基因转化的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种红叶石楠高效基因转化的方法，属于植物生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]红叶石楠(Photinia xfrasery)是蔷薇科石楠属杂交种的统称,是起源于亚热带的常绿灌木树种。春季其新叶红艳，夏季转绿，秋、冬、春三季呈现红色，霜重色逾浓，低温色更佳。做行道树，其杆立如火把；做绿篱，其状卧如火龙；修剪造景，形状可千姿百态，景观效果美丽，被誉为“红叶绿篱之王”。自上世纪九十年代引入我国以来，就被列为具有较高开发价值的彩叶树种。但由于红叶石楠不适应北方如山东、河北、北京等地的冬季低温，容易造成冻害，限制了推广和发展进程。国内研究人员对红叶石楠抗寒性、变色机理、越冬适应性等方面开展了相关研究，以期通过驯化和抗寒适应性筛选抗寒品种，但截止目前仍未选育出有效抗寒的红叶石楠品种。随着分子生物学的发展，利用基因工程技术将抗冻基因转到植物体内，培育抗寒品种成为当前木本植物抗寒育种研究的热点。
[0003]为此，通过cDNA-AFLP的差异表达分析技术，从我国西北荒漠地区仅存的常绿的木本植物沙冬青(源于远古第三纪的国家二级濒危保护植物)中筛选出13个低温诱导上调表达转录片段。对其中的一个EST片段已通过RACE获得其全长cDNA，构建了植物表达载体，转化拟南芥成功并获得了抗冻性明显提高的转基因拟南芥植株，但是转化木本植物未能成功。本发明选择另一个抗冻基因AmGS进行克隆，并通过基因枪法与根瘤农杆菌介导法相结合的遗传转化方法将它导入木本植物红叶石楠中，选育抗寒新品种。
[0004]目前的植物遗传转化技术可分为两大类，一类是以基因枪转化法为代表的直接基因转移技术，基因枪法把遗传物质或其他物质附着于高速微弹直接射入细胞、组织和细胞器，是目前国际上最先进的基因导入技术。气体基因枪以压缩气体(氦或氮)转换成的气体冲击波为动力，使气体基因枪产生一种“冷”的气体冲击波进入轰击室，因此可免遭由“热”气体冲击波引起的细胞损伤。气体基因枪可在广泛的细胞型中得到瞬时的、稳定的和高效率的转化作用。气体基因枪有一个产生冲击波的特殊结构，在恰当的气压范围内从
3.5MPa-10MPa，具有相应不同的可破裂膜，将包覆DNA的粒子穿越，射入在轰击室底部的靶细胞中(最大靶直径50mm)。基因枪适用于动植物、细胞培养物、胚胎、细菌及小型动物的转基因。具有快速、简便、安全、高效的特点。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法是目前应用最广的基因转化方法，具有操作简便、成本低、转化率高的特点，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。本发明将两种遗传转化技术有机的结合起来，用于红叶石楠抗寒基因转化。`
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种红叶石楠高效基因转化的方法，以便针对红叶石楠抗寒基因进行转化。
[0006]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。[0007]—种红叶石楠高效基因转化的方法，具体采用的是基因枪法和农杆菌介导法结合的基因转化方法，其步骤包括:(I)质粒DNA的提取；(2)受体材料的准备；(3)钨粉预处理；
(4)微弹制备；(5)基因枪轰击；(6)受体材料的预培养；(7)农杆菌侵染；⑶共培养；(9)抑菌及卡那霉素筛选培养；(10)转化植株PCR和Southern Blotting检测。
[0008]各步骤具体如下:
[0009]步骤(1):质粒DNA的提取:所用含有目的基因的农杆菌菌株LBA4404是含有35S启动子、目的基因、终止子NOS和标记基因NPTII的双元载体pCAMBIA2300— 35S — 0CS(中国科学院遗传发育所惠赠)。在超净工作台上挑取保存的菌体接种YEP固体培养基的培养，菌板置于恒温培养箱，28°C培养2~3d，至单菌落产生；挑取单菌落接种YEP液体培养基的培养，在恒温摇床上28°C、200~210r / min过夜培养(24h左右至对数生长后期)，待0D600值为0.5~0.8时可用于质粒DNA的提取。从在含20mg / I Kanamycin和15mg /
I Gentamycin5一8ml 的液体 YEP 培养基中接 Agrobacterium 细胞，然后在 28 °C、200—220rpm培养24h。然后进行质粒提取。新鲜配制Sol II溶液(880 μ I Η20,100 μ 1SDS10%,20 μ IlON NaOH)，及包含 4mg / ml 溶菌酶 Lysozyme 的 20 0 μ ISol I (Pl)溶液。对培养一昼夜的的Falcon试管在3600rpm速度下进行离心12min,丢弃上清。用200 μ 15Μ NaCl重悬农杆菌细胞，利用涡旋将农杆菌细胞混匀。转移到Eppendorf管中。加入20μ110%N-Lauroylsarcosine sodium溶液,上下倒置6—8次混匀(从不同方向倒置)。最大速度(13000rpm)下离心 2min,丢掉上清液。用 200 μ I 含 4mg / mlLysozyme 的 Soil (Pl) (Soli:50mM glucose, 25mM Tris-Cl (8.0)，IOM EDTA (8.0))重悬沉淀，涡旋直至混匀。置于冰上。加入400 μ I Sol II (Ρ2) (Sol I1:880 μ I Η20,100 μ lSDS10%,20y IlON NaOH)，上下倒置6— 8次混匀(从不同方向倒置)。在冰上放置5min。加入300ylSol III(P3)，用手振荡。在冰上放置 IOmin0 SolIII=Buffer P3,Neutrilization solution.最大速度(12000rpm)下离心12min。将上清液(700 μ I)转移到新的Eppendorf管中。用I X酹/氯仿(Phenol /Chloroforum:350 μ lPhenol+350 μ I Ch I or orum, ^ Cho I ο f orum,?: 24 倍体积 chloroforum 与I倍体积isoamylalcohol)抽提。在通风橱中,往Eppendorf管中加入酹和氯仿(氯仿加入时要动作迅速，否则会吸入微量移液器中)。涡旋15s，最大速度(12000rpm)下离心2min。将上层相(700μ1)小心移入新的Eppendorf管中。倾斜吸取，防止吸入下层的酚/氯仿。注意所有使用过的吸头都放入通风橱内的有毒拉圾箱内。酚/氯仿残留液倒入通风橱下面柜子里的酹/氯仿废液瓶中。用700 μ Iisopropanel沉淀,室温下放置5min。最大速度(12000rpmg)下离心15min,小心除去上清。可分两步,先用大移液管移走大部分上清,剩余50 μ I左右再离心5min。注意沉淀小球并不一定牢固吸在管壁上，小心不要吸走沉淀。用70%酒精洗涤。加入lml70%酒精，最大速度(12000rpm)下离心5min，小心移去上清。室温下晾干。20 μ I TE+1Omg / ml RNase A重悬沉淀。在冷室放置一昼夜，后贮于_20°C冰箱。将DNA提取液稀释100倍，用UV-2450紫外可见分光光度计测定其在波长260nm和280nm波长下的吸收值，0D260 / 0D280=1.8~1.9为高纯度DNA，大于1.9则有RNA污染，小于1.8说明有蛋白质污染。DNA浓度按以下公式计算:DNA浓度(ng / μ L) =0D260X 50X稀释倍数。将质粒DNA用0.1 % TE溶液稀释为200 μ g / mL、500 μ g / mL、800 μ g / mL三种浓度，分装好贮藏在_20°C冰箱中备用。
[0010]步骤(2)，受体材料的准备:红叶石楠茎段长度应为1-1.5cm,经0.4mol / L渗透压培养基(MS培养基添加0.2mol / L甘露醇，0.2mol / L山梨醇)醇处理4一6h做基因枪轰击之用。
[0011]步骤(3)钨粉预处理:取60mg直径为I μ m的钨粉，加入Iml无水乙醇，95°C温育Ih,在最大功率下超声处理3次，每次5min (或用超声波粉碎机超声至手感发烫)，离心除去上清；加Iml无水乙醇，旋涡震荡3 — 5min，离心除去上清；加Iml无菌水，旋涡震荡，离心，弃上清，重复3次；用含50%甘油的无菌水悬浮，使其浓度为60mg / ml。
[0012]步骤⑷微弹制备:取步骤⑶悬浮液50 μ 1，加入6 μ I质粒DNA(1 μ g / μ I),20 μ I亚精胺(0.1Μ)，50μ lCaC12(2.5M)。震荡lmin，静置lmin，离心，弃上清;加70%乙醇至600 μ I, 200W功率下超声处理4一6次，每次I秒,离心,弃上清；加150 μ I无水乙醇，不破坏沉淀，静置lmin，弃上清；加入60 μ I无水乙醇，震荡，每次轰击量5—10 μ I。
[0013]步骤(5)基因枪轰击:基因枪为Bio — Rad PDS1000 / He型，取金粉悬液(60mg，直径1.5一3.0 μ m的金粉,用无水乙醇消毒，悬浮于Iml无菌水中)25 μ I,加入5 μ gAmGS质粒DNA, 50 μ 12.5mol / L Cacl2, 20 μ 10.1mol / L亚精胺,充分混匀，离心,无水乙醇沉淀，重新悬于60μ1无水乙醇，备用。可裂膜选用1550psi。将可裂膜、载体膜事先用70%乙醇浸泡半小时，在超净工作台晾干。每次吸取10 μ IDNA-金粉复合体涂布于载体膜，充分晾干。选取生长状态旺盛、大小一致的愈伤组织进行轰击，靶材料距离可裂膜5 — 10cm，每皿受体材料轰击I次。轰击后的愈伤组织及时转到MS固体培养基上恢复生长4一7天，进行筛选，选取生长状态好的茎段进行农杆菌侵染转化。
[0014]步骤(6)受体材料的预培养:选取步骤(3)中恢复筛选后的茎段，长度应为1-1.5cm,至少保留一个芽,将莖段浅嵌于分化培养基表面。培养基厚度l-2cm,每瓶培养基体积约15— 20ml，每瓶培养基可放6— 8个茎段。将嵌入培养基的茎段置于黑暗环境下暗培养2 — 6d，培养温度25°C左右。
[0015]步骤(7)，农杆菌侵染:先将制备好的农杆菌LBA4404菌液和MS母液按I / 3—I / 2体积比混合，将混合液倒入空的无菌培养瓶并调节pH6.2—6.7 ;再将预培养的受体材料茎段取出，置于无菌空培养皿中，`立`即用配制好的侵染液濡湿受体茎段，之后于无菌条件下进行适当刻伤，对照材料同时进行同样刻伤处理。刻伤处理后，将受体材料转移至已盛有侵染液的培养瓶内侵染15—20min，侵染液体积以没过侵染材料为宜，侵染期间用手间歇摇动侵染瓶，以使材料与侵染液充分接触。
[0016]步骤(8)共培养:将侵染后的受体茎段，用无菌滤纸吸干表面液体，转于表面加盖一层用MS母液润湿的无菌滤纸的双层培养基上，仍按每瓶培养基6— 8个茎段放置。将封好口的培养瓶置于黑暗条件下共培养2 — 4d。
[0017]步骤(9)抑菌及卡那霉素筛选培养:将受体材料转接于含有Kanamycin (卡那霉素)和抑菌素Cefradine (头孢霉素)的筛选培养基上继续培养，分3个阶段进行(pH6.2—
7.0)。第一阶段Kanl0-15mg / L,Cef350—400mg / L，培养5—8d ;第二阶段Kan40—45mg /L, Cef300—350mg / L，培养 14一21d ;第三阶段卡 Kan45_50mg / L, Cefl50—200mg / L,培养 20— 30d。
[0018]步骤(10)，转化植株PCR和Southern Blotting检测:经抑菌和筛选培养，受体茎段表现出明显分离生长状态，超过I / 4的茎段出现由黄花至枯死或者的变化，约3 / 4茎段萌发出绿色的抗性新芽，CTAB法提取基因组DNA并进行PCR扩增检测。目的基因引物序列如下:AmGS—F:TCA TGG CAC CTG ATA TCA CCA CCG CT ；AmGS-R:TAT TAG GCA GCG GATGGG GCG GGA A ；
[0019]反应体系:ddH20(38.5μ L) ;Buffer(6y L) ;dNTP(2y L) ;Primerl(l μ L);Primer2(I μ L) ；Template DNA(I μ L) ；TaqE(0.5 μ L) ;Total (50 μ L)。
[0020]扩增程序:反应程序:预变性，94°C，5min ;变性，94°C，30sec ;复性，55 °C，40sec ；扩增，72°C，lMin，30cycle ;延伸，72°C，lOMin。
[0021]对PCR检测结果阳性的转基因植株和未转基因的对照植株同时送到北京美莱博医学科技有限公司生物技术服务部采用PCR标记法进行Southern检测。具体方法:用NotI和SacI双酶切pATCAmGS质粒DNA，DIG — dUTP标记(地高辛杂交检测试剂盒)，得到800bp的片段为标记探针；预杂交:取10.0mlHyb高效杂交液(Hyb-1OO)，加入杂交管中，60°C杂交炉中预杂交2h。探针变性:探针在PCR仪中100°C变性10分钟，立即放冰水浴冷却5min ；杂交:排尽预杂交液，在10.0mlHyb高效杂交液(Hyb-1OO)加入4.0 μ I新变性好的探针，混匀，60°C杂交仪中杂交过夜；洗膜、信号检测:使用美莱博DIGD-110 “地高辛杂交检测试剂盒I I (化学发光法)”。
[0022]该发明的有益效果在于:本发明采用基因枪法和农杆菌介导法结合的基因转化方法，所获得的转基因株系抗寒性得到了明显提高，导入的AmGS基因提高了转基因株系的抗寒性，从而为培育抗寒品种提供了重要依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]下面结合附图和实施例对本发明的【具体实施方式】进行描述，以便更好的理解本发明。
`[0024]图1是本发明实施例1中转基因红叶石楠PCR检测图(图中标记说明:1 =DNAMarker ；4:质粒DNA，阳性对照；8:未转化植株，阴性对照；2，3，5，6，7，12，13:转化植株)。
[0025]图2是本发明实施例1中转基因红叶石楠的Southern检测图(图中标记说明:M:DNAmarker, DL2000 ；CK1:阳性对照，质粒DNA ；CK2:阴性对照，水；CK3:阴性对照，未转化植株；R6、R7、R8和RlO:四个不同的转基因株系)。
【具体实施方式】
[0026]实施例1:
[0027]基因枪轰击前，将切小的愈伤在以下两种预培养基(pre—bombardment culturemedia)PBCM I—II 上培养 3d:
[0028]PBCMI:MS+6-BA5mg / L+NAA0.5mg / L
[0029]PBCM I1:MS+6_BA5mg / L+NAA0.5mg / L+CaC124.49 / L
[0030]用于基因枪轰击的微弹包括直接用钨粉轰击和包裹有质粒DNA(质粒类型和以后用农杆菌转化的质粒相同)的钨粉轰击。
[0031]取60mg直径为I μ m的鹤粉,加入Iml无水乙醇，95°C温育Ih,在最大功率下超声处理3次，每次5min(或用超声波粉碎机超声至手感发烫)，离心除去上清；加Iml无水乙醇，旋涡震荡3—5min，离心除去上清；加Iml无菌水，旋涡震荡，离心，弃上清，重复3次；用含50%甘油的无菌水悬浮,使其浓度为60mg / ml ο[0032]取上述悬浮液50μ1，加入6μ1质粒DNA(lyg / μ I)，20 μ I亚精胺(0.1M)，50μ lCaC12(2.5M)。震荡lmin，静置lmin，离心，弃上清;加70%乙醇至600 μ 1，200W功率下超声处理4一6次，每次I秒，离心，弃上清；加150 μ I无水乙醇，不破坏沉淀，静置lmin，弃上清；加入60 μ I无水乙醇，震荡，每次轰击量8-10 μ I。根据以上条件，每枪的微弹浓度^lUg/ 500 yg (DNA / 钨粉)。
[0033]基因枪的轰击条件为:真空度-0.095MPa,氮气压力7MPa,射程5cm,轰击一次.轰击后立即进行农杆菌转化处理。选取长度为1-1.5cm的茎段，至少保留一个芽，将茎段浅嵌于分化培养基表面。培养基厚度l-2cm,每瓶培养基体积约15—20ml,每瓶培养基可放6—8个莖段。将嵌入培养基的莖段置于黑暗环境下暗培养2—6d,培养温度25°C左右。
[0034]先将制备好的农杆菌LBA4404菌液和MS母液按I / 3—I / 2体积比混合，将混合液倒入空的无菌培养瓶并调节PH6.2-6.7 ;再将预培养的受体材料茎段取出，置于无菌空培养皿中，立即用配制好的侵染液濡湿受体茎段，之后于无菌条件下进行适当刻伤，对照材料同时进行同样刻伤处理。刻伤处理后，将受体材料转移至已盛有侵染液的培养瓶内侵染15 — 20min，侵染液体积以没过侵染材料为宜，侵染期间用手间歇摇动侵染瓶，以使材料与侵染液充分接触。
[0035]将侵染后的受体茎段，用无菌滤纸吸干表面液体，转于表面加盖一层用MS母液润湿的无菌滤纸的双层培养基上，仍按每瓶培养基6—8个茎段放置。将封好口的培养瓶置于黑暗条件下共培养2 — 4d。
[0036]将受体材料转接于含有Kanamycin (卡那霉素)和抑菌素Cefradine (头孢霉素)的筛选培养基上继续培养，分3个阶段进行(pH6.2 — 7.0)。第一阶段Kanl5mg /L，Cef400mg / L，培养 8d ;第二阶段 Kan45mg / L，Cef350mg / L，培养 21d ;第三阶段卡Kan50mg / L, Cef200mg / L，培养 30d。
[0037]图1是本发明实施例中转基因红叶石楠PCR检测图(图中标记说明:1:DNAMarker ；4:质粒DNA，阳性对`照；8:未转化植株，阴性对照；2，3，5，6，7，12，13:转化植株)。
[0038]图2是本发明实施例中转基因红叶石楠的Southern检测图(图中标记说明:M:DNAmarker, DL2000 ；CK1:阳性对照，质粒DNA ；CK2:阴性对照，水；CK3:阴性对照，未转化植株；R6、R7、R8和RlO:四个不同的转基因株系)。
[0039]实施例2:
[0040]基因枪轰击前，将切小的愈伤在以下两种预培养基(pre—bombardment culturemedia):
[0041]PBCM 1-1I)上培养 3d:
[0042]PBCMI:MS+6-BA5mg / L+NAA0.5mg / L+PVP16g / L
[0043]PBCMI1:MS+6_BA5mg / L+NAA0.5mg / L+CaC124.4g / L+PVP16g / L
[0044]取60mg直径为I μ m的鹤粉,加入Iml无水乙醇，95°C温育Ih,在最大功率下超声处理3次，每次5min(或用超声波粉碎机超声至手感发烫)，离心除去上清；加Iml无水乙醇，旋涡震荡3—5min，离心除去上清；加Iml无菌水，旋涡震荡，离心，弃上清，重复3次；用含50%甘油的无菌水悬浮,使其浓度为60mg / ml。.[0045]取上述悬浮液50μ1，加入6μ1质粒DNA(lyg / μ I)，20 μ I亚精胺(0.1M)，50μ lCaC12(2.5Μ)。震荡lmin，静置lmin，离心，弃上清;加70%乙醇至600 μ 1，200W功率下超声处理4-6次，每次I秒，离心，弃上清；加150 μ I无水乙醇，不破坏沉淀，静置lmin，弃上清；加入60 μ I无水乙醇，震荡，每次轰击量8 —10 μ I。根据以上条件，每枪的微弹浓度为 Iyg / 500 yg (DNA / 钨粉)。
[0046]基因枪的轰击条件为:真空度_0.095MPa，氮气压力7MPa，射程10cm，轰击一次.轰击后立即进行农杆菌转化处理。选取长度为1-1.5cm的茎段，至少保留一个芽，将茎段浅嵌于分化培养基表面。培养基厚度l-2cm,每瓶培养基体积约15—20ml,每瓶培养基可放6—8个莖段。将嵌入培养基的莖段置于黑暗环境下暗培养2—6d,培养温度25°C左右。
[0047]先将制备好的农杆菌LBA4404菌液和MS母液按I / 4一 I / 3体积比混合，将混合液倒入空的无菌培养瓶并调节PH6.2-6.7 ;再将预培养的受体材料茎段取出，置于无菌空培养皿中，立即用配制好的侵染液濡湿受体茎段，之后于无菌条件下进行适当刻伤，对照材料同时进行同样刻伤处理。刻伤处理后，将受体材料转移至已盛有侵染液的培养瓶内侵染20— 25min，侵染液体积以没过侵染材料为宜，侵染期间用手间歇摇动侵染瓶，以使材料与侵染液充分接触。
[0048]将侵染后的受体茎段，用无菌滤纸吸干表面液体，转于表面加盖一层用MS母液润湿的无菌滤纸的双层培养基上，仍按每瓶培养基6—8个茎段放置。将封好口的培养瓶置于黑暗条件下共培养2 — 4d。
[0049]将受体材料转接于含有Kanamyein (卡那霉素)和抑菌素Cefradine (头孢霉素)的筛选培养基上继续培养，分3个阶段进行(pH6.2—7.0)。第一阶段KanlOmg /L，Cef350mg / L，培养 5d ;第二阶段 Kan40mg / L，Cef300mg / L，培养 14d ;第三阶段卡Kan50mg / L, Cef200mg / L，培养 20d。
[0050]实施例3:转基因红叶石楠的抗寒性检测:
[0051]将通过切芽扦插扩繁得到足够数量的继代植株，移栽于增殖培养基上(配方为:MS+BA1.0mg/L+NAA0.05mg / L)，每瓶4株，继续培养20d。在4°C条件下预处理24h，然后分别在0°C和_6°C冷冻处理6，12，24和36h。冷冻处理结束后，在4°C，黑暗条件下解冻培养基3h，然后放在正常生长温度下复苏培养(温度为24°C，光照时间12h / d)48h后，观察其表型，叶片冻伤情况，统计各种处理中的植株存活率(复苏后成活株数/供试总株数X 100% )。对两个转基因株系(R6和R7)和未转基因的对照植株冷冻处理后其效果为:在0°C处理实验中，两个转基因株系在直至处理24h，都没有表现出明显的伤害；但未转基因的对照植株在处理12h后，表现出明显的伤害；处理24h后，植株大量死亡；处理36h后，全部死亡。在-6°C处理实验中，两个转基因株系直至处理12h后都没有表现出明显的伤害，在处理24h后，植株表现出明显的伤害，部分植株死亡，在处理36h后，植株大量死亡。而未转基因的对照植株在处理6h后即表现出明显的伤害，部分植株死亡，处理12h后，植株全部死亡。上述结果表明转基因株系R6和R7的抗寒性得到了明显提高，导入的AmGS基因提高了转基因株系的抗寒性。
[0052]以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种红叶石楠高效基因转化的方法，其特征在于:具体采用的是基因枪法和农杆菌介导法结合的基因转化方法，其步骤包括:(I)质粒DNA的提取；(2)受体材料的准备；(3)钨粉预处理；(4)微弹制备；(5)基因枪轰击；(6)受体材料的预培养；(7)农杆菌侵染；(8)共培养；(9)抑菌及卡那霉素筛选培养；(10)转化植株PCR和Southern Blotting检测； 上述各步骤具体如下: 所述步骤(1)质粒DNA的提取:所用含有目的基因的农杆菌菌株LBA4404是含有35S启动子、目的基因、终止子NOS和标记基因NPTII的双元载体pCAMBIA2300— 35S — 0CS，在超净工作台上挑取保存的菌体接种YEP固体培养基的培养，菌板置于恒温培养箱，28°C培养2~3d，至单菌落产生；挑取单菌落接种YEP液体培养基的培养，在恒温摇床上28°C、200~210r / min过夜培养(24h左右至对数生长后期)，待0D600值为0.5~0.8时可用于质粒DNA的提取；从在含20mg / I Kanamycin和15mg / lGentamycin5一8ml的液体YEP培养基中接Agrobacterium细胞，然后在28°C、200— 220rpm培养24h ;然后进行质粒提取；新鲜配制 SolII 溶液(880 μ I Η20,100μ lSDS10%,20y IlON NaOH)，及包含 4mg /ml溶菌酶Lysozyme的200 μ I Soil (Pl)溶液；对培养一昼夜的的Falcon试管在3600rpm速度下进行离心12min，丢弃上清；用200μ 15M NaCl重悬农杆菌细胞，利用涡旋将农杆菌细胞混匀，转移到 Eppendorf 管中；加入 20 μ 110 % N一Lauroylsarcosine sodium 溶液，上下倒置6—8次混匀(从不同方向倒置)；最大速度(13000rpm)下离心2min,丢掉上清液；用 200 μ I 含 4mg / ml Lysozyme 的 Sol I (Pl) (Sol I:50mM glucose, 25mM Tris—Cl (8.0), IOM EDTA(8.0))重悬沉淀，涡旋直至混匀，置于冰上，加入400 μ I Sol II (Ρ2)(Sol II:880 μ 1Η20,100 μ I SDSlO %, 20 μ IlON NaOH)，上下倒置 6-8 次混匀(从不同方向倒置)，在冰上放置511^11，加入30(^1 Sol III (Ρ3)，用手振荡；在冰上放置IOmin ;SolIII=Buffer Ρ3, Neutrilization solution.最大速度(12000rpm)下离心 12min,将上清液(700 μ I)转移到新的Eppendorf管中，用IX酹/氯仿(Phenol / Chloroforum:350 μ I Phenol+350 μ IChlororum, “Choi ο forum”:24 倍体积 chi or o forum 与 I 倍体积 isoamylalcohol)抽提；在通风橱中，往Eppendorf管中加入酹和氯仿；润旋15s, 12000rpm下离心2min ;将上层相(700 μ I)小心移入新的Eppendorf管中；倾斜吸取，防止吸入下层的酹/氯仿；用700 μ Iisopropanel沉淀，室温下放置5min ; 12000rpmg下离心15min,小心除去上清；先用大移液管移走大部分上清，剩余50 μ I左右再离心5min ;用70%酒精洗涤；加入1111170%酒精，12000rpm下离心5min,小心移去上清；室温下晾干；20 μ I TE+1 Omg /ml RNase A重悬沉淀；在冷室放置一昼夜，后贮于_20°C冰箱；将DNA提取液稀释100倍，用UV-2450紫外可见分光光度计测定其在波长260nm和280nm波长下的吸收值，0D260 /0D280=1.8~1.9为高纯度DNA，大于1.9则有RNA污染，小于1.8说明有蛋白质污染；DNA浓度按以下公式计算:DNA浓度(ng / yL)=0D260X50X稀释倍数；将质粒DNA用0.1%TE溶液稀释为200 μ g / mL、500 μ g / mL、800 μ g / mL三种浓度，分装好贮藏在_20°C冰箱中备用； 所述步骤(2)受体材料的准备:红叶石楠茎段长度为l-1.5em，经0.4mol / L渗透压培养基(MS培养基添加0.2mol / L甘露醇，0.2mol / L山梨醇)处理4一6h做基因枪轰击之用； 所述步骤(3)钨粉预处理:取60mg直径为I μ m的钨粉，加入Iml无水乙醇，95°C温育.lh，在最大功率下超声处理3次，每次5min (，离心除去上清；加Iml无水乙醇，旋涡震荡3—5min，离心除去上清；加Iml无菌水，旋涡震荡，离心，弃上清，重复3次；用含50%甘油的无菌水悬浮，使其浓度为60mg / ml ； 所述步骤⑷微弹制备:取步骤⑶悬浮液50 μ 1，加入6μl质粒DNA(1 μ g /μl),20μl亚精胺(0.1Μ)，50 μ lCaC12 (2.5M);震荡lmin,静置lmin,离心，弃上清；加70%乙醇至600 μ 1，200W功率下超声处理4一6次，每次I秒，离心，弃上清；加150μl无水乙醇，不破坏沉淀，静置lmin，弃上清；加入60μl无水乙醇，震荡，每次轰击量5—10μ I ; 所述步骤(5)基因枪轰击:基因枪为Bio — Rad PDS1000 / He型，取金粉悬液(60mg，直径1.5一3.0 μ m的金粉,用无水乙醇消毒,悬浮于Iml无菌水中)25μl,加入5 μ gAmGS质DNA, 50 μ 12.5mol/LCacl2, 20 μ 10.1mol / L亚精胺，充分混匀，离心，无水乙醇沉淀，重新悬于60μl无水乙醇，备用；可裂膜选用1550psi，将可裂膜、载体膜事先用70%乙醇浸泡半小时，在超净工作台晾干；每次吸取10μ IDNA-金粉复合体涂布于载体膜，充分晾干；选取生长状态旺盛、大小一致的愈伤组织进行轰击，靶材料距离可裂膜5-lOcm，每皿受体材料轰击I次；轰击后的愈伤组织及时转到MS固体培养基上恢复生长4一7天，进行筛选，选取生长状态好的茎段进行农杆菌侵染转化； 所述步骤(6)受体材料的预培养:选取步骤(3)中恢复筛选后的茎段，长度为.1-1.5cm,保留至少一个芽,将莖段浅嵌于分化培养基表面；培养基厚度l-2cm,每瓶培养基体积约15—20ml，每瓶培养基可放6—8个茎段；将嵌入培养基的茎段置于黑暗环境下暗培养2 — 6d，培养温度25°C左右； 所述步骤(7)中农杆菌侵染:先将制备好的农杆菌LBA4404菌液和MS母液按I / 3—.1 / 2体积比混合，将混合液倒入空的无菌培养瓶并调节pH6.2-6.7 ;再将预培养的受体材料茎段取出，置于无菌空培养皿中，立即用配制好的侵染液濡湿受体茎段，之后于无菌条件下进行适当刻伤，对照材料同时进行同样刻伤处理；刻伤处理后，将受体材料转移至已盛有侵染液的培养瓶内侵染15—20min，侵染液体积以没过侵染材料为宜，侵染期间用手间歇摇动侵染瓶，以使材料与侵染液充分接触； 所述步骤(8)共培养:将侵染后的受体茎段，用无菌滤纸吸干表面液体，转于表面加盖一层用MS母液润湿的无菌滤纸的双层培养基上，仍按每瓶培养基6—8个茎段放置；将封好口的培养瓶置于黑暗条件下共培养2 — 4d ； 所述步骤(9)中抑菌及卡那霉素筛选培养:将受体材料转接于含有Kanamycin (卡那霉素)和抑菌素Cefradine (头孢霉素)的筛选培养基上继续培养，分3个阶段进行(pH6.2—.7.0);第一阶段 Kanl0-15mg / L, Cef350—400mg / L，培养 5— 8d ;第二阶段 Kan40—45mg / L, Cef300—350mg / L，培养 14一21d ;第三阶段卡 Kan45— 50mg / L, Cefl50—200mg / L，培养 20—30d ； 所述步骤(10)中转化植株PCR和Southern Blotting检测:经抑菌和筛选培养,受体茎段表现出明显分离生长状态，超过I / 4的茎段出现由黄花至枯死或者的变化，约3 / 4茎段萌发出绿色的抗性新芽，CTAB法提取基因组DNA并进行PCR扩增检测；目的基因引物序列如下:AmGS—F:TCA TGG CAC CTG ATA TCA CCA CCG CT ；AmGS-R:TAT TAG GCA GCG GATGGG GCG GGA A ;反应体系:ddH20 (38.5 μ L) ；Buffer (6 μ L) ；dNTP(2y L) ；Primerl (I μ L)；Primer2(l μ L) !Template DNA(IyL) ；TaqE(0.5 μ L) ；Total(50y L);扩增程序:反应程序:预变性，94°C，5min ;变性，94°C，30sec ;复性，55 °C，40sec ;扩增，72 °C，IMin，30cycle ；延伸，72°C，IOMin JfPCR检测结果阳性的转基因植株和未转基因的对照植株采用PCR标记法进行Southern检测；具体方法为:用NotI和SacI双酶切pATCAmGS质粒DNA，DIG—dUTP标记(地高辛杂交检测试剂盒)，得到800bp的片段为标记探针；预杂交:取10.0mlHyb高效杂交液(Hyb-1OO)，加入杂交管中，60°C杂交炉中预杂交2h ;探针变性:探针在PCR仪中100°C变性10分钟，立即放冰水浴冷却5min ;杂交:排尽预杂交液，在10.0mlHyb高效杂交液(Hyb-1OO)加入4.0μ 1新变性好的探针，混匀，60°C杂交仪中杂交过夜；洗膜、信号检测。
【文档编号】C12N15/84GK103805631SQ201410017267
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月7日 优先权日:2014年1月7日
【发明者】刘静, 罗磊, 黄艳艳, 王迎, 牛庆霖, 张虹, 赵进红, 冯殿齐 申请人:泰安市泰山林业科学研究院