一种快速提取鱼卵dna的方法
【专利摘要】本发明提供了一种快速提取鱼卵DNA的方法。所述方法按下列步骤进行：（1）使用蛋白酶k消化鱼卵；（2）将EP管及澄清液放入水浴锅或烘箱中，在温度为85-90℃条件下，温浴1小时，完成对鱼卵DNA的提取。本发明具有操作简单、快速、无DNA损失、费用低廉等优点，提供一种从鱼卵中制备DNA，用作一般PCR扩增的模板。
【专利说明】一种快速提取鱼卵DNA的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及到生物工程领域，特别涉及到一种快速提取鱼卵DNA的方法。
【背景技术】
[0002]脱氧核糖核酸(DNA)是一类带有遗传信息的生物大分子，主要由4种的脱氧核苷酸(dAP、dGP、dCT和dTP)排列组成。不同物种的DNA的4种脱氧核苷酸在组成和排列上存在差异，据此可以作为区分物种的分子标记。
[0003]对河流、湖泊、海洋等鱼类产卵场位置和规模的确定是环境生态学的重要内容，其方法一般是采集鱼卵，鉴定鱼卵的发育期，再根据水文条件，如水文、流速等推算产卵场位置和规模。由于在自然环境中有多个鱼类同期同地产卵，因此还需要鉴别采集到鱼卵的种类。以往，鉴别鱼卵种类的方法一般根据卵苗的外观，如卵径径大小和形状、色素等来判断这种方法常常依赖于经验，并且有不少鱼类无法鉴定到品种，因此可靠性比较差。另一种方法是将鱼卵苗培养至成鱼后再判断，此种方法耗时长，并且存在有的种类不易养活，以及采集的受精卵因损伤不能孵化等的缺点，因此不利于研究。
[0004]近年来，分子标记技术在鉴定鱼卵种类上具有快速、准确的优点，越来越多的研究人员使用分子标记技术来研究鱼卵种类。分子标记技术分析鱼卵种类的基本步骤是:1)提取采集到鱼卵的DNA ;2)采用聚合酶链式反应(PCR)技术，结合靶位点引物，扩增靶位点DNA片段；3)对靶位点DNA片段进行DNA测序或电泳分型；4)根据DNA序列或电泳分型的结果，对照已知种类的DNA序列或分型，判定鱼卵的种类。目前提取动物DNA的主要方法有:I)酚-氯仿法(萨姆布鲁克，拉塞尔著，`黄培堂等译《分子克隆实验指南》，2005);2)高盐法(Aljanabi and Martinez (1997) );3)各种商业公司提供的DNA提取试剂盒法等。这些方法的步骤是首先裂解组织并消化其中蛋白，其次是使蛋白质变性或把DNA结合到某种介质，然后通过离心分离蛋白和DNA，获取DNA。这些方法通常情况下也可以用于提取鱼卵的DNA，但存在一些缺陷如:1、耗时较长；2、使用一些对人及环境有害的化学药品，如酚、氯仿等；3、在离心分离蛋白和DNA过程时会损失一些DNA，这一点对于鱼卵这样微量样本显得非常重要，需要具备有一定的实验经验等。这些目前提取DNA方法的不足之处对于仅需获取用于分子标记鉴定种类的DNA为目的而言，显得尤为突出。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种简单、快速提取鱼卵DNA的方法，该方法获取的DNA可以满足一般PCR扩增的要求。
[0006]为实现上述目的，本发明的技术方案为:
一种快速提取鱼卵DNA的方法，所述方法按下列步骤进行:
(I)使用蛋白酶k消化鱼卵:将保存在乙醇中的鱼卵放入1.5mL规格的EP管中，加入ImL灭菌蒸馏水浸泡I小时，以除去鱼卵中残留的乙醇，倒去蒸馏水，然后加入30-50mL标准配制的TE缓冲液和2-5mL浓度为20mg/mL的蛋白酶k溶液，用灭菌移液器吸头或牙签将鱼卵捣碎后，将EP管移到温度为45-55°C的水浴锅或烘箱内，消化1-3小时至溶液澄清；
(2)将EP管及澄清液放入水浴锅或烘箱中，在温度为85-90°C条件下，温浴I小时，完成对鱼卵DNA的提取。
[0007]本发明的积极效果为:
1、该方法操作简单，无需有害药品和复杂步骤，普通实验室和一般人员均可操作；
2、快速，一般2-4小时即可完成；
3、DNA无丢失，整个步骤均在一个EP管内完成，不存在DNA丢失的可能；
4、费用低，由于没有使用过多的药品和耗材，相对目前常用DNA提取的方法，费用降低80%以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为草鱼线粒体DNA控制区(1-10)和细胞色素b (11-20)的PCR扩增结果。M为DNA分子量标准，大小从上而下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp ；
图2为黄颡鱼(/^7fulvidraco)线粒体DNA控制区(1_10)和细胞色素b (11-20)的PCR扩增结果。M为DNA分子量标准，大小从上而下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp ；
图3为鳜^似化乃鱼卵线粒体口嫩控制区^^和细胞色素匕(6-11)的PCR扩增结果。M为DNA分子量标准，大小从上而下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp ；图4为日本鳗鲡线粒体DNA控制区(1-10)和细胞色素b( 11-20)的PCR扩增结果。M为DNA分子量标准，大小从上而下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp。
【具体实施方式】
[0009]下面结合实施例进一步说明本发明的【具体实施方式】。
[0010]实施例一
从乙醇保存的草鱼idellus)鱼卵中提取DNA,并用于线粒体DNA控制区及细胞色素b基因的PCR扩增。
[0011]1、将野外获得并用无水乙醇保存的草鱼鱼卵带回实验室。
[0012]2、使用镊子将鱼卵卵膜挑破，将胚胎放入1.5 mL的EP管中，加入I mL灭菌蒸馏水浸泡I小时，倒去蒸馏水，加入50 ML TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA，pH=8.0)和3 ML浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液。
[0013]3、用移液器吸头或剪刀将鱼卵胚胎捣碎后，将EP管移入温度为50°C烘箱里消化2小时至溶液澄清。
[0014]4、将EP管及澄清液放入90°C水浴锅水浴中温浴I小时，完成后取出EP管静置待温度降至室温，然后放入冰箱中备用。
[0015]5、采用线粒体DNA控制区通用引物(黄志坚，等.中山大学学报自然科学版，2009)及细胞色素 b 基因通用引物(Xiao et al.Molecular Phylogenetics andEvolution, 2001, 18(2): 163-173)，对提取的 DNA 进行 PCR 扩增。扩增体系包括 10 XPCRBuffer 5 ML、10 mmol/L dNTP 0.5 ML、Taq DNA 聚合酶 2 UUO MmoI/L 引物个 2 ML、DNA溶液1ML，补充灭菌双蒸水至50 ML。扩增反应程序为94°C预变性4分钟，然后94°C变性30秒、54°C退火30秒、72°C延伸I分钟共30个循环，循环结束后72°C再延伸8分钟。
[0016]6、取2 ML PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图1。图1中显示，无论控制区还是细胞色素b基因，PCR均能扩增得到预期大小的DNA片段。
[0017]实施例二
从乙醇保存的黄颡鱼iPelteobagrus /WnWraco )鱼卵中提取DNA,并用于线粒体DNA控制区及细胞色素b基因的PCR扩增。
[0018]1、将野外获得并用无水乙醇保存的黄颡鱼鱼卵带回实验室。
[0019]2、使用镊子将鱼卵卵膜挑破，将胚胎放入1.5 mL的EP管中，加入I mL灭菌蒸馏水浸泡I小时，倒去蒸馏水，加入30 ML TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA，pH=8.0)和2 ML浓度为20mg/ml的蛋白酶K溶液。
[0020]3、用移液器吸头或剪刀将鱼卵胚胎捣碎后，将EP管移入温度为45°C烘箱里消化3小时至溶液澄清。
[0021]4、将EP管及澄清液放入85°C水浴锅水浴中温浴I小时，完成后取出EP管静置待温度降至室温，然后放入冰箱中备用。
[0022]5、采用线粒体DNA控制区通用引物(黄志坚，等.中山大学学报自然科学版，2009)及细胞色素 b 基因通用引物(Xiao et al.Molecular Phylogenetics andEvolution, 2001, 18(2): 163-173)，对提取的 DNA 进行 PCR 扩增。扩增体系包括 10XPCRBuffer 5 ML、10 mmol/L` dNTP 0.5 ML、Taq DNA 聚合酶 2 UUO Mmol/L 引物个 2 ML、DNA溶液1ML，补充灭菌双蒸水至50 ML。扩增反应程序为94°C预变性4分钟，然后94°C变性30秒、54°C退火30秒、72°C延伸I分钟共30个循环，循环结束后72°C再延伸8分钟。
[0023]6、取2 ML PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图2。图2中显示，无论控制区还是细胞色素b基因，PCR均能扩增得到预期大小的DNA片段。
[0024]实施例三
从新鲜鳜chua tsi )鱼卵中提取DNA,并用于线粒体DNA控制区及细胞色素b基因的PCR扩增。
[0025]1、将野外获得并用无水乙醇保存的鳜鱼鱼卵带回实验室。
[0026]2、使用镊子将鱼卵卵膜挑破，将胚胎放入1.5 mL的EP管中，加入I mL灭菌蒸馏水浸泡I小时，倒去蒸馏水，加入40 ML TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA，pH=8.0)和4ML浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液。
[0027]3、用移液器吸头或剪刀将鱼卵胚胎捣碎后，将EP管移入温度为55°C烘箱里消化I小时至溶液澄清。
[0028]4、将EP管及澄清液放入90°C水浴锅水浴中温浴I小时，完成后取出EP管静置待温度降至室温，然后放入冰箱中备用。
[0029]5、采用线粒体DNA控制区通用引物(黄志坚，等.中山大学学报自然科学版，2009)及细胞色素 b 基因通用引物(Xiao et al.Molecular Phylogenetics andEvolution, 2001, 18(2): 163-173)，对提取的 DNA 进行 PCR 扩增。扩增体系包括 10XPCRBuffer 5 ML、10 mmol/L dNTP 0.5 ML、Taq DNA 聚合酶 2 UUO Mmol/L 引物个 2 ML、DNA溶液1ML，补充灭菌双蒸水至50 ML。扩增反应程序为94°C预变性4分钟，然后94°C变性30秒、54°C退火30秒、72°C延伸I分钟共30个循环，循环结束后72°C再延伸8分钟。
[0030]6、取2 ML PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图3。图3中显示，控制区及细胞色素b基因，PCR均能扩增得到预期大小的DNA片段。
[0031]实施例四
从新鲜日本鳗鲡(Anguilla Japonica )鱼卵中提取DNA,并用于线粒体DNA控制区及细胞色素b基因的PCR扩增。
[0032]1、将野外获得并用无水乙醇保存的日本鳗鲡鱼鱼卵带回实验室。
[0033]2、使用镊子将鱼卵卵膜挑破，将胚胎放入1.5 mL的EP管中，加入I mL灭菌蒸馏水浸泡I小时，倒去蒸馏水，加入50 ML TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA，pH=8.0)和3 ML浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液。
[0034]3、用移液器吸头或剪刀将鱼卵胚胎捣碎后，将EP管移入温度为50°C烘箱里消化2小时至溶液澄清。
[0035]4、将EP管及澄清液放入90°C水浴锅水浴中温浴I小时，完成后取出EP管静置待降至室温，然后放入冰箱中备用。
[0036]5、采用线粒体DNA控制区通用引物(黄志坚，等.中山大学学报自然科学版，2009)及细胞色素 b 基因通用引物(Xiao et al.Molecular Phylogenetics andEvolution, 2001, 18(2): 163-173)，对提取的 DNA 进行 PCR 扩增。扩增体系包括 10XPCRBuffer 5 ML、10 mmol/L dNTP 0.5 ML、Taq DNA 聚合酶 2 UUO Mmol/L 引物个 2 ML、DNA溶液1ML，补充灭菌双蒸水至50 ML。扩增反应程序为94°C预变性4分钟，然后94°C变性30秒、54°C退火30秒、72°C延伸I分钟共30个循环，循环结束后72°C再延伸8分钟。
[0037]6、取2 ML PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图4。图4中显示，无论控制区还是细胞色素b基因，PCR均能扩增得到预期大小的DNA片段。
[0038]以上所述仅是本发明的非限定实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不作出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种快速提取鱼卵DNA的方法，其特征在于:所述方法按下列步骤进行: (1)使用蛋白酶k消化鱼卵:将保存在乙醇中的鱼卵放入1.5mL规格的EP管中，加入ImL灭菌蒸馏水浸泡I小时，以除去鱼卵中残留的乙醇，倒去蒸馏水，然后加入30-50mL标准配制的TE缓冲液和2-5mL浓度为20mg/mL的蛋白酶k溶液，用灭菌移液器吸头或牙签将鱼卵捣碎后，将EP管移到温度为45-55°C的水浴锅或烘箱内，消化1-3小时至溶液澄清； (2)将EP管及澄清液放入水浴锅或烘箱中，在温度为85-90°C条件下，温浴I小时，完成对鱼卵DNA的提取。
【文档编号】C12N15/10GK103710339SQ201410021659
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】汪登强, 蒋菁菁, 段辛斌, 刘绍平, 陈大庆, 刘明典, 王珂, 李小芳 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所