一种改性羊肌腱胶原蛋白的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种改性羊肌腱胶原蛋白的制备方法，以实验室自制羊肌腱胶原蛋白为原料，利用马来酸酐酰化法对胶原蛋白进行改性处理，经单因素试验筛选确定改性条件进而研究浓度、pH和电解质对改性前后胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响。结果筛选出改性时间为4h，温度为40℃，pH为7～9，马来酸酐添加量为10％为最适宜条件。改性前后胶原蛋白乳化性及乳化稳定性相比较，改性后胶原蛋白乳化性有所下降，但无显著差异P>0.05；改性后胶原蛋白乳化稳定性增大且差异显著P<0.05。随着改性程度的提高乳化稳定性随之提高，乳化性无明显变化。
【专利说明】一种改性羊肌腱胶原蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品加工【技术领域】，涉及一种改性羊肌腱胶原蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白资源丰富、口感柔和、味道清淡、易于消化，且含有丰富的氨基酸，在许多食品中被用作功能物质和营养成分。胶原蛋白具有多功能性的特性，采用不同方法，对胶原蛋白进行改性，可充分发挥胶原蛋白的功能特性，扩展在食品加工中的应用范围[3]。
[0003]胶原蛋白改性方法主要有物理改性、化学改性、酶法改性。化学改性反应历程短，成本低，设备要求不高，且改性效果最为明显，因此，化学改性是蛋白质改性的主要手段。王金涛等[4]对胶原蛋白水解产物进行了 1-乙基-3-(3-二甲丙氨基)碳化二亚胺改性，确定了获得最佳乳化性和乳化稳定性的改性条件。杨穆等研究了明胶的氨基的酰化反应，可以通过接入憎水性的芳香基改变明胶的水溶性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，本发明提供一种改性羊肌腱胶原蛋白的制备方法，从提高胶原蛋白的两亲性质方面考虑，初步研究了以马来酸酐为改性试剂，使马来酸酐在一定条件下与胶原蛋白发生胺基反应，主要检测了结合程度对胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响。
[0005]其具体技术方案为:
[0006]一种改性羊肌腱胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:取胶原蛋白Ig用蒸馏水把胶原蛋白配成质量分数为5%的悬浮液，边搅拌边加入马来酸酐，在温度为40°C, pH为7?9，马来酸酐添加量为10%的条件下，得到马来酸酐改性的胶原蛋白产物，反应完成后将改性的胶原蛋白用NaOH溶液调节pH值至中性，置于透析袋中透析48h，透析过程中每6h换一次蒸馏水。
[0007]与现有技术相比，本发明的有益效果为:利用本发明的制备方法，经过试验证明:改性前后胶原蛋白乳化性相比较差异无显著性(P>0.05)。改性后乳化稳定性相比较，差异有显著性(P〈0.05)。改性胶原蛋白的乳化稳定性有很大的提高，且改性程度越大乳化稳定性越好，改性后的乳化性变化不明显。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1是羊肌腱I型胶原蛋白电泳图；
[0009]图2是Sigma I型胶原蛋白与羊肌腱提取的I型胶原蛋白红外图谱；
[0010]图3是反应温度对胶原蛋白改性程度的影响
[0011]图4是反应时间对胶原蛋白改性程度的影响；
[0012]图5是反应pH对胶原蛋白改性程度的影响；
[0013]图6是酸酐用量对胶原蛋白改性程度的影响；[0014]图7是羊肌腱胶原蛋白改性红外图谱；
[0015]图8是改性胶原蛋白浓度对乳化活性的影响；
[0016]图9是改性胶原蛋白的浓度对乳化稳定性的影响；
[0017]图10是NaCl浓度对改性胶原蛋白乳化活性的影响；
[0018]图11是NaCl浓度对改性胶原蛋白乳化稳定性的影响；
[0019]图12是pH对改性胶原蛋白乳化活性的影响；
[0020]图13是PH对改性胶原蛋白乳化稳定性的影响。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0022]I材料与方法
[0023]1.1材料与仪器
[0024]羊肌腱I型胶原蛋白实验室自制；标准I型胶原蛋白sigma公司；；马来酸酐sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。
[0025]1.2H2500R-2高速冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司；TU_1810紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；BG-POWer600电泳仪北京百晶生物技术有限公司；LGJ-25C压盖型冷冻干燥机北京四环科学仪器厂有限公司；IRAffinity-l型红外光谱仪Japan Shimadzu Co ;高速匀浆机宁波新芝生物科技股份有限公司；恒温水浴锅上海雅荣生化设备仪器有限公司。
[0026]1.3 方法
[0027]1.3.1改性胶原蛋白的制备
[0028]取胶原蛋白Ig用蒸馏水把胶原蛋白配成质量分数为5%的悬浮液，边搅拌边加入马来酸酐，在不同温度、时间、pH、酸酐用量下进行单因素试验，得到马来酸酐改性的胶原蛋白产物。反应完成后将改性的胶原蛋白用NaOH溶液调节pH值至中性，置于透析袋中透析48h，透析过程中每6h换一次蒸馏水，将透析好的样品冷冻干燥待用。
[0029]1.3.2胶原蛋白改性反应程度的测定
[0030]却三酮法PaulJ等m:配制质量分数1% (m / m)胶原蛋白溶液"取ImL放入试管中，然后向试管中加入ImL的茚三酮显色剂"摇匀，盖塞，在沸水浴中加热16min，取出，在20°C的水浴中冷却，再向试管中加入5mL的K103稀释液，摇匀，在30min内用IOmm的比色皿在570nm波长处测其吸光度，其中以蒸馏水/茚三酮溶液作空白，吸光度表示游离氨基与茚三酮溶液的反应程度，吸光度越大表示改性蛋白的酰化程度越低，也可以根据公式:酰化反应程度=(未改性胶原蛋白的OD值一改性胶原蛋白的OD值)/未改性胶原蛋白的OD 值 XlOO %
[0031 ] 1.3.3乳化性及乳化稳定性的测定方法
[0032]本试验参照Pearce和王娜测定胶原蛋白的乳化活性方法并有所改动，具体操作如下用0.5mol / L的醋酸和醋酸钠缓冲液并利用氢氧化钠和碳酸氢钠配合调节溶液pH，配制一定浓度(W / V)的胶原蛋白溶液，取IOmL样品溶液和相同体积的大豆色拉油混合并加入到均质机中，均质速度IOOOOr / min),均质2min制成乳状液,均质结束后立即取0.5mL样品液加入到25mL0.1 % SDS (十二烷基磺酸钠)。以0.1 % SDS为空白在500nm处测定吸光度A1, IOmin后继续读数，测定吸光度A2 (ApA2均取测5次的平均值)乳化活性EAI=A1 X 100
[0033]乳化稳定性ESI=A1 X 10 / (A1-A2)
[0034]14统计学分析:采用SPPS15.0软件，采用ANOVA法进行分析。
[0035]2结果与分析
[0036]2.1羊肌腱胶原蛋白的鉴定
[0037]2.1.1SDS-PAGE 电泳
[0038]由图1可知，实验室自提胶原蛋白符合I型胶原蛋白的特征，具有明显的α、β、Y组分。在高于200kDa的带，是I型胶原的Y链，是α链的三聚体，在200kDa附近的带，是I型胶原的β链，是α链的二聚体，在116kDa附近出现了 I型胶原的α I和α2链，提取的I型胶原蛋白没有多余的条带，说明提取的胶原蛋白保证了完整的结构，并未水解成小分子片段[1°]，可以确定提取物为I型胶原蛋白。
[0039]2.1.2傅立叶变换红外图谱
[0040]由图2可知，所提取的胶原蛋白与Sigma I型胶原蛋白红外图谱基本一致。图中3317cm-l附近是酰胺A带N-H伸缩振动，表明存在氢键，说明三股螺旋结构的存在。1664cm-l附近是酰胺I带的C=O伸缩振动，1543cm-l附近是酰胺II带的N-H弯曲振动，1454?1236cm-l附近的吸收峰表明所提取胶原蛋白三股螺旋结构的完整性[11’12]。红外图谱进一步证明，本实验所提取的胶原蛋白是I型胶原蛋白，且保持良好的结构。
[0041 ] 2.2胶原蛋白改性试验设计
[0042]配制一定质量分数的胶原蛋白溶液，分别研究pH值、马来酸酐用量、反应温度、反应时间对胶原蛋改性程度的影响。由单因素试验结果确定各因素的水平取值范围。
[0043]2.2.1温度对胶原蛋白改性程度的影响
[0044]取胶原蛋白Ig用重蒸水把胶原蛋白配成质量分数为5%的悬浮液，同时利用磁力棒边搅拌边加入马来酸酐，马来酸酐的加入量为胶原蛋白质量的15%，pH值调至7，分别控制反应过程温度在201:、301:、401:、501:、601:，反应时间3h。反应结束后调pH值至7。
[0045]由图3可知，随着反应温度的增加改性程度先增大后减小，在40°C时反应温度达到最大。先增大的原因是由于温度的升高分子的动能增大，促进了分子的有效碰撞，提高了改性程度，当温度超过40°C时，改性程度下降的原因是由于温度的升高使胶原蛋白降解，高温也使得酸酐更容易水解[13]，因此，在40°C时酰化程度最大。
[0046]2.2.2时间对胶原蛋白改性程度的影响
[0047]按上述方法，pH为7，反应温度30°C马来酸酐的加入量为胶原蛋白质量的15%，分别控制反应过程时间在2h、3h、4h、5h、6h。反应结束后调pH值至7。
[0048]由图4可知，随着反应时间的增加，改性程度也在增加，在2?4h内增大速度较快，4h后变的缓慢，在2?4h增大快的原因是在反应过程中反应物和底物的浓度大，分子之间的有效碰撞大，增大的速率也快。在4h后，底物和反应物的浓度减小,有效碰撞减小,增大的速率变慢，故本试验选择4h为酰化反应时间。
[0049]2.2.3pH对胶原蛋白改性程度的影响
[0050]按上述方法，温度为30°C，反应时间为3h，马来酸酐的加入量为胶原蛋白质量的15%，分别控制反应过程pH为3、5、7、9、11。反应结束pH值调至7。
[0051]由图5可知，随着pH的增大，改性程度在逐渐增大，马来酸酐改性反应作用胶原蛋白分子中的氨基，在酸性环境中，游离氨基变少，一 NH与H+结合成一 NH3+，导致亲核能力变小。在碱性环境中，一 NH呈游离状态，亲核能力比较强，易于酸酐反应，所以改性程度高
[13]。所以在碱性环境中改性程度较高，但碱性太强也会导致胶原蛋白水解成小分子。故PH应在7?9最好，这与任俊莉等M研究类似。
[0052]2.2.4马来酸酐用量对胶原蛋白改性程度的影响。
[0053]按上述方法pH值为7，温度设定在30°C，反应时间3h，设置马来酸酐的加入量分别为胶原蛋白质量的1%、5%、10%、15%、20%。反应结束后调pH值至7。
[0054]由图6可知，随着马来酸酐用量的增加，胶原蛋白改性程度先增大后减小，1%?10%之间改性程度是增大的，这是由于随着马来酸酐用量的增加，反应越来越彻底，在10%时反应达到饱和，改性程度达到最大，在10%之后改性程度有所降低，因为过多的酸酐使得胶原蛋白分子表面静电斥力增大，用量抑制了改性反应的发生，故用量为10%时最适宜。
[0055]2.3改性后胶原蛋白的红外图谱表征
[0056]对比图7和图2，改性前的1664cm-l附近是酰胺I带的C=O伸缩振动，1543cm_l附近是酰胺II带的N-H弯曲振动，改性后分别移至1652cm-l和1541cm-l，且二者的峰变强。说明有新的酰胺基C=O生成，氨基参加了反应，这与引入了酸酐的结构。
[0057]2.4改性对胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响
[0058]2.4.1浓度对胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响
[0059]在pH=7，蛋白浓度分别为 0.1%,0.3%,0.5%,0.7%U%>2% (W / V)下，考察浓度对乳化性和乳化稳定性的影响。
[0060]由图8、9可知，改性和未改性胶原蛋白随着其浓度的增大其乳化性也在逐渐增大，在1%之后趋于稳定，且改性后胶原蛋白乳化性有所降低但差异无显著性(P>0.05)。总体上改性后胶原蛋白的乳化稳定性大于未改性胶原蛋白的乳化稳定性且差异有显著性(P〈0.05)。在改性过程中胶原蛋白质分子内部暴露的疏水基团和共价结合的酸酐酰基则排列在油相一侧，因此提高了油-水体系的稳定性[14]。导致了乳化活性变小，稳定性变大。
[0061]2.4.2电解质对胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响
[0062]在胶原蛋白浓度为l%，ph为7时分别加入不同浓度NaCl，使得NaCl浓度分别为1%,3%,5%,7%,9% (W / V)。考察电解质对乳化性和乳化稳定性的影响。
[0063]由图10、11可知，在NaCl浓度在小于I %或大于3%时改性胶原蛋白的乳化性大于未改性胶原蛋白的乳化性，改性程度越大乳化性越差，差异无显著性(P>0.05)。乳化稳定性却出现了相反的情况，该性胶原蛋白的乳化稳定性明显要高于未改性胶原蛋白的乳化稳定性，差异有显著性(P〈0.05)，改性程度越大，乳化稳定性越好。NaCl浓度在1%和3%之间，改性胶原蛋白的乳化性要高于未改性胶原蛋白的乳化性，而乳化稳定性低于未改性胶原蛋白的。
[0064]2.4.3pH对胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响
[0065]在蛋白浓度为I %，pH分别为3、5、7、9、11，考察pH对乳化性和乳化稳定性的影响。
[0066]由图12、13可知，未改性胶原蛋白，在pH=5时，接近胶原蛋白的等电点，此时溶解度最低，乳化性最差，与王碧[15]等研究一致。改性后胶原蛋白等电点发生了偏移在PH = 3时，乳化活性最低，总体上改性之后的胶原蛋白乳化性稍差但差异无显著性(P>0.05)。乳化稳定性出现了较复杂的情况，改性胶原蛋白的乳化稳定性在等电点两侧逐渐提高，而未改性胶原蛋白的乳化稳定性在等电点两侧降低。从图中可知增大趋势并且pH大于6之后时改性胶原蛋白的乳化稳定明显优于未改性胶原蛋白的乳化稳定性，差异有显著性(P〈0.05)。
[0067]3 结论
[0068]3.1羊肌腱中胶原蛋白为I型胶原蛋白，且结构完整。
[0069]3.2单因素筛选出胶原蛋白的改性条件，时间为4h，温度为40°C，pH为7?9，马来酸酐添加量为10%。
[0070]3.3改性前后胶原蛋白乳化性相比较差异无显著性(P>0.05)。改性后乳化稳定性相比较，差异有显著性(P〈0.05)。改性胶原蛋白的乳化稳定性有很大的提高，且改性程度越大乳化稳定性越好，改性后的乳化性变化不明显。
[0071]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种改性羊肌腱胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:取胶原蛋白Ig用蒸馏水把胶原蛋白配成质量分数为5%的悬浮液，边搅拌边加入马来酸酐，在温度为40°C, pH为7?9，马来酸酐添加量为10%的条件下，得到马来酸酐改性的胶原蛋白产物，反应完成后将改性的胶原蛋白用NaOH溶液调节pH值至中性，置于透析袋中透析48h，透析过程中每6h换一次蒸馏水。
【文档编号】A23J3/04GK103783257SQ201410025388
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月16日 优先权日:2014年1月16日
【发明者】莎日娜, 王月宏, 曾静瑜, 耿兄 申请人:内蒙古农业大学