一种二化螟血淋巴细胞的原代培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种二化螟血淋巴细胞的原代培养方法。包括如下步骤：（1）配制细胞原代培养液和传代培养液；（2）将二化螟幼虫浸没在乙醇溶液中，进行表面消毒，清洗吸干；（3）将虫体置于用乙醇消毒过的解剖蜡盘中，解剖二化螟；（4）将血淋巴放入盛有HBSS清洗液的细胞培养瓶，静置，待血淋巴细胞贴壁后，吸除HBSS，加入新鲜的HBSS，重复3次；（5）加入细胞原代培养液，放入无光照的细胞培养箱中培养，过夜后，再加入细胞传代培养液；（6）每隔7天吸出和换入细胞传代培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶。本发明有助于在离体条件下研究二化螟，为其防治途径的研究和开发提供帮助。
【专利说明】一种二化螟血淋巴细胞的原代培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及属于昆虫细胞培养【技术领域】，尤其涉及一种二化螟血淋巴细胞的原代
培养方法。
【背景技术】
[0002]随着生命科学的迅猛发展，在生物工程【技术领域】中，细胞工程已愈来愈受到重视。培养昆虫细胞作为研究材料，一直是细胞生物学、分子生物学和生物化学以及昆虫毒理学等科学研究的重要方面。
[0003]自从Grace在1962年首次建立天蚕蛾细胞系以来，昆虫细胞培养技术得到了迅速发展，目前已建立了 800多株昆虫细胞系，主要集中于鳞翅目、双翅目(潘李珍等，1980，1989 ;曾庆韬等，1998)、鞘翅目(Lynn et al., 1995; Iwabuchi, 1999; Stiles,1992)、直翅目(Heinandez-Crespo et al., 2000)、膜翅目、同翅目和半翅目等,其中大部分来自鳞翅目和双翅目，来源于其他目的昆虫细胞系仅占1/10左右(张寰等，2007)。昆虫细胞系的建立，不但促进了昆虫生物学方面的基础研究，也大大促进了基于昆虫细胞的应用性研究。其中，昆虫细胞-杆状病毒表达系统(BEVS)是当今最具高效的真核表达系统，已广泛应用于干扰素等外源基因的表达。
[0004]在所建立的昆虫细胞系中，研究和应用最多的是黑腹果蝇iDrosophila
S2 细胞系 、粉纹夜蛾/?i)的 BT1-Tn-5B1_4 (High Five)细胞系和草地贪夜蛾/r^§7>6?r￡/a)Sf21细胞系及其克隆株Sf9等。相对于已知的上百万种昆虫以及昆虫细胞系的广泛用途来说，已经建立的细胞系还远远不够，仍需要建立更多的昆虫细胞系以满足实际需要。
[0005]二化螟suppressalis (Walker)属鳞翅目，螟蛾科,是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一，在分蘖期受害造成枯鞘、枯心苗，在穗期受害造成虫伤株和白穗，一般年份减产3%~5%，严重时减产在3成以上。除危害水稻外，二化螟还危害玉米、甘蔗、粟、蚕豆、茭白、高粱、油菜、小麦、紫云英等作物。二化螟有很强的适应能力，能快速适应不利环境(如抗性品种和杀虫剂)，其致害性能快速变异。在二化螟的防治过程中，新型生物农药的筛选和鉴定日益成为研究重点。生物农药的活动生物测定需要大量发育一致的二化螟试虫，对饲养场地要严格的要求，工作量大，而若有离体培养的二化螟细胞，则可以在离体条件下研究生物农药对二化螟的作用，从而有助于在细胞水平研究杀虫剂对二化螟的作用机制，有助于当前杀虫剂的改进和新杀虫剂的发明。目前，关于二化螟细胞的体外培养技术及二化螟细胞系，还未见报道。因此，通过本发明，建立二化螟细胞系，不仅能增加我国新昆虫细胞系的数量及种类，还能为日后该类昆虫细胞系的建立提供借鉴经验。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种二化螟血淋巴细胞的原代培养方法。[0007]二化螟血淋巴细胞的原代培养方法包括如下步骤:
(O配制细胞原代培养液和传代培养液；
(2)在无菌条件下，将二化螟幼虫浸没在70%或75%乙醇溶液中，进行表面消毒10~20分钟，用无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫2~3次，用无菌滤纸吸干虫体或用吹风机吹干虫体；
(3)将虫体置于用70%或75%乙醇消毒过的解剖蜡盘中，用解剖针将头尾固定，解剖二化螟，用20 μ L移液器吸取血淋巴；
(4)将血淋巴放入盛有ImL~2mLHBSS清洗液的T_25cm2细胞培养瓶，静置15~20分钟，待血淋巴细胞贴壁后，吸除HBSS，加入新鲜的HBSS，重复3次；
(5)最后I次去除HBSS后，加入细胞原代培养液lmL，放入无光照的细胞培养箱中27°C培养，过夜后，再加入2mL细胞传代培养液；
(6)每隔7天吸出和换入50%~70%量的细胞传代培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶。
[0008]所述的细胞原代培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、两性霉素B和动物血清及饱和苯基硫脲的混合物，PH值为6.0-6.8。所述的细胞传代培养液是昆虫细胞培养液和动物血清的混合物，PH值为6.0-6.8。所述的昆虫细胞培养液选自TNM-FH，所述的动物血清为胎牛血清。所述的青霉素含量为200U/ml,链霉素含量为0.2yg /ml,两性霉素B含量为0.5μ g /mlO所述的动物血清体积比含量为10~20%。所述的动物血清体积比含量为10-20%。所述的饱和苯基硫脲溶液为高压灭菌的苯基硫脲固体过量加入到无菌的TNM-FN培养液中配制而成。
[0009]本发明的有益效果是:采用上述方案，对二化螟幼虫血淋巴进行了原代培养，取得了较好的培养效果。本发明 快速、有效、重复性强，是对鳞翅目昆虫细胞培养的重要补充。二化螟为水稻重要害虫，本发明有助于在离体条件下研究二化螟，为其防治途径的研究和新型生物农药的开发提供帮助。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1培养2天后血淋巴细胞的培养形态；
图2培养16天后血淋巴细胞的培养形态；
图3培养30天后血淋巴细胞的培养形态。
【具体实施方式】
[0011]以下结合实例对本发明作进一步的详细说明:
实施例1
TNM-FH细胞培养基的配制 经过下列步骤:
(1)47.5g Grace干粉培养基中加入700mL去离子水,磁力搅拌器搅拌加速溶解；
(2)依次加入0.35g NaHCO3, 3.0g的水解乳蛋白，3.0g酵母提取物；
(3)精密酸度计测定pH值，用去离子水配制的INNaOH溶液调节pH值至6.20—6.30 ；
(4)去离子水定容至1000mL;
(5)0.45 μ m滤膜过滤；(6)超级工作台用0.22 μ m的滤膜过滤培养基并分装；
(7)28°C培养箱放置I星期，检查无污染后4°C保存；
实施例2
原代细胞培养液和传代细胞培养液的制备 原代细胞培养液(配制500mL):
成分数量
TNM-FH 培养基400mL
胎牛血清50.0mL
苯基硫脲饱和溶液50.0mL
青霉素100U
链霉素0.1 μ g
两性霉素B0.25 μ g
在无菌操作台内，将上述成分混匀，4°C保存备用。
[0012]传代细胞培养 液(配制500mL):
成分数量
TNM-FH 培养基400mL
胎牛血清100.0mL
在无菌操作台内，将上述成分混匀，4°C保存备用。
[0013]实施例3 二化螟血淋巴细胞的原代培养
(1)在无菌条件下，将二化螟幼虫浸没在75%乙醇溶液中，进行表面消毒10分钟；用无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫3次；用无菌滤纸吸干虫体；
(2)将虫体置于用75%消毒过的解剖蜡盘中，用解剖针将头尾固定；解剖二化螟，用20 μ L移液器吸取血淋巴；
(3)将血淋巴放入盛有ImLHBSS清洗液的T-25cm2细胞培养瓶，静置15分钟，待血淋巴细胞贴壁后，吸除HBSS，加入新鲜的HBSS，重复3次；
(4)最后I次去除HBSS后，加入原代培养液lmL，放入无光照的细胞培养箱中27°C培养；过夜后，再加入2mL细胞传代培养液；
(5)每隔7天吸出和换入70%量的细胞传代培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养
瓶；
所述的细胞原代培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、两性霉素B和动物血清及饱和苯基硫脲的混合物，pH值为6.0。所述的细胞传代培养液是昆虫细胞培养液和动物血清的混合物，pH值为6.0。所述的昆虫细胞培养液选自TNM-FH，所述的动物血清为胎牛血清。所述的青霉素含量为200U/ml,链霉素含量为0.2 μ g /ml,两性霉素B含量为0.5 μ g/ml ο所述的动物血清体积比含量为10%。所述的动物血清体积比含量为10%。所述的饱和苯基硫脲溶液为高压灭菌的苯基硫脲固体过量加入到无菌的TNM-FN培养液中配制而成。
[0014]在上述操作后2天后可观察到大量增殖的单个细胞(见图1)并逐渐向外围扩展直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶;第16天后见到细胞开始拉丝生长，不断增值(见图2);第30天后，拉丝现象消失，增殖细胞铺满细胞培养瓶表面，二化螟血淋巴细胞原代培养成功(见图3);把含有新增值的细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，按照1:5(细胞体积:最后培养液体积)进行传代培养。二化螟幼虫血淋巴细胞系初步建立成功。
[0015]实施例4 二化螟血淋巴细胞的原代培养
(1)在无菌条件下，将二化螟幼虫浸没在70%乙醇溶液中，进行表面消毒20分钟，用无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫2次，用吹风机吹干虫体；
(2)将虫体置于用70%乙醇消毒过的解剖蜡盘中，用解剖针将头尾固定，解剖二化螟，用20 μ L移液器吸取血淋巴；
(4)将血淋巴放入盛有2mLHBSS清洗液的T-25cm2细胞培养瓶，静置20分钟，待血淋巴细胞贴壁后，吸除HBSS，加入新鲜的HBSS，重复3次；
(5)最后I次去除HBSS后，加入细胞原代培养液lmL，放入无光照的细胞培养箱中27°C培养，过夜后，再加入2mL细胞传代培养液；
(6)每隔7天吸出和换入50%量的细胞传代培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶。
[0016]所述的细胞原代培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、两性霉素B和动物血清及饱和苯基硫脲的混合物，pH值为6.8。
[0017]所述的细胞传代培养液是昆虫细胞培养液和动物血清的混合物，pH值为6.8。所述的昆虫细胞培养液选自TNM-FH，所述的动物血清为胎牛血清。所述的青霉素含量为200U/ml,链霉素含量为0.2 μ g /ml,两性霉素B含量为0.5 μ g /ml。所述的动物血清体积比含量为20%。所述的动物血`清体积比含量为20%。所述的饱和苯基硫脲溶液为高压灭菌的苯基硫脲固体过量加入到无菌的TNM-FN培养液中配制而成。
【权利要求】
1.一种二化螟血淋巴细胞的原代培养方法，其特征在于，包括如下步骤: (O配制细胞原代培养液和传代培养液； (2)在无菌条件下，将二化螟幼虫浸没在70%或75%乙醇溶液中，进行表面消毒10~20分钟，用无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫2~3次，用无菌滤纸吸干虫体或用吹风机吹干虫体； (3)将虫体置于用70%或75%乙醇消毒过的解剖蜡盘中，用解剖针将头尾固定，解剖二化螟，用20 μ L移液器吸取血淋巴； (4)将血淋巴放入盛有ImL~2mLHBSS清洗液的T_25cm2细胞培养瓶，静置15~20分钟，待血淋巴细胞贴壁后，吸除HBSS，加入新鲜的HBSS，重复3次； (5)最后I次去除HBSS后，加入细胞原代培养液lmL，放入无光照的细胞培养箱中27°C培养，过夜后，再加入2mL细胞传代培养液； (6)每隔7天吸出和换入50%~70%量的细胞传代培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞原代培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、两性霉素B和动物血清及饱和苯基硫脲的混合物，pH值为6.0-6.8。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞传代培养液是昆虫细胞培养液和动物血清的混合物，PH值为6.0-6.8。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的昆虫细胞培养液选自ΤΝΜ---，所述的动物血清为胎牛血清。·
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的青霉素含量为200U/ml，链霉素含量为0.2 μ g /ml,两性霉素B含量为0.5 μ g /ml。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的动物血清体积比含量为10~20%。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的动物血清体积比含量为10-20%。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的饱和苯基硫脲溶液为高压灭菌的苯基硫脲固体过量加入到无菌的TNM-FN培养液中配制而成。
【文档编号】C12N5/07GK103820380SQ201410030148
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】刘光富, 俞晓平 申请人:中国计量学院