一种利用海洋细菌交替假单胞菌mb004产的胶原蛋白酶基因的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因，本发明从海洋细菌中筛选出能产生胶原蛋白酶的细菌MB004，从而获得其胶原蛋白酶基因，并通过异源表达与亲和层析纯化获得重组蛋白PNJC。胶原蛋白酶PNJC的酶活力为160.34U/mg，达到胶原蛋白酶标准品的70.48%，具有重要的研究开发价值。依靠微生物产生胶原蛋白酶，再制备胶原蛋白是一个发展迅速的胶原蛋白获得方式。
【专利说明】一种利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因。
【背景技术】 [0002]胶原是一种广泛存在于动物的结构蛋白质，是由动物细胞合成的一种生物性高分子。广泛存在于动物骨、脚、软骨和皮肤及其它结缔组织中，约占哺乳动物总蛋白的1/3。多数类型的胶原蛋白分子都由3条螺旋肽链相互盘绕而成，3链相互缠绕，形成了胶原蛋白分子特有的杆状结构。胶原蛋白是一类重要的资源，目前，己广泛地应用于医药工业、食品工业、日用化学品工业等方面都有重要的作用。
[0003]在饲料工业中:胶原蛋白作为一种高效的动物性蛋白营养添加剂。
[0004]在生物医学材料方面的应用:制作心脏瓣膜；血管修复的替换血管装置；作为烧伤伤口的敷料(使血液凝固，具有止血功能)；制造人造皮肤。
[0005]在食品方面:胶原蛋白材料制备薄膜材料；制造肠衣等可食用包装材料；作为肉制品添加剂、保健食品等。
[0006]另外，胶原蛋白具有优良的吸湿、保湿性能以及抗皮肤衰老功效，一些知名品牌公司已推出了纯胶原蛋白和一系列添加了纯胶原蛋白的护肤品。
[0007]胶原蛋白得到了广泛的应用，大量的需求突出了提取胶原蛋白迫切性，用胶原蛋白酶进行生产就是其中重要的一种方法。
[0008]胶原蛋白酶是指作用于胶原或其变性明胶而不作用其它蛋白质的酶类，它来源广泛，多种微生物以及动物的许多组织细胞都可以产生胶原酶。胶原酶在环境保护上可用于皮革边角废弃物变废为宝，高值转化；在医学研究中可用于治疗腰椎间盘突出症、瘢痕疙瘩、杜普伊特伦症等，具有极大的应用价值。来自溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)等的胶原蛋白酶已有广泛的研究。目前，已从许多动物组织和微生物中获得胶原蛋白酶。但对于来自于海洋微生物中的胶原蛋白酶的研究甚少，而海洋由于其多变复杂的环境，多样的生命形式，使得海洋中蕴藏着种类多样，功能各异且具有强烈活性的生物蛋白酶。本研究试从实验室保存的海洋微生物中筛选胶原蛋白酶产生菌，并将其胶原蛋白酶基因导入工程菌中进行异源表达，对海洋来源胶原蛋白酶进行一个初探式研究。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的一个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因。
[0010]一种利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因，它的核苷酸序列如〈400〉I 所述。[0011]其中利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因的克隆表达方法，是以交替假单胞菌MB004基因组DNA为模板，用PCR方法克隆MB004的编码基因，将该基因重组到表达质粒pET28a中，获得重组质粒pET28a-Pnjc,将重组质粒线性化，以原生质体转化的方法整合到大肠杆菌Rosseta感受态细胞中，获得整合了质粒的重组表达菌株，接种到LB培养基中培养诱导表达重组蛋白，重组蛋白以可溶性的形式分泌到培养液中，表达的蛋白经离心后收集，浓缩，经IPTG诱导表达、亲和层析纯化获得重组蛋白纯化产物。具体地，该PCR方法中所用引物为:
[0012]引物Pl:5，-CGGGATCCATGTTTGTACCAGAACTTCT-3，；
[0013]引物P2:5，-CCCAAGCTTTTATGCCTTTTTAAAAGGAT-3 ’ ；
[0014]并在引物pi和引物p2的5’端分别引入酶切位点Bgl II和Xho I位点。反应条件为:95°C 5min ；95°C 30s, 51 °C 30s, 72 °C 90s,共 35 个循环；72°C 延伸 lOmin。并且交替假单胞菌MB004基因组DNA的克隆采用16S rRNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增，目的片段经回收纯化后与pMD18-T Vector连接，然后转化到DH5a细胞，提取重组质粒进行目的片段的测序。引物27F为:5，-AGAGTTTGATCCTGGC-3’，引物1492R:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
[0015]海洋细菌交替假单胞菌MB004经16S rRNA系统发生学分析属于Pseudoalteromonas,该菌株己在 GenBank 公开(GenBank 登录号:AY621063, http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/AY621063)。
[0016]其中，海洋细菌交替假单胞菌MB004的分离培养方法与形态特征:
[0017]1.1海洋细菌的分离培养方法
[0018]取数管实验室保藏`菌种，冰浴溶解，用接种环蘸取少量菌液在2216E活化培养基平板上划线活化，在培养皿上做好信息标记，培养皿在25°C下倒置培养2-3天至长出单菌落。从活化培养基上挑取单菌落接种于2216E初筛固体培养基中心处，培养皿在25°C下倒置培养2天，在菌落周围滴加2-3滴酸性汞试剂，显色2分钟。测定光圈直径(D2)与菌落直径(D1)，并做好记录，选取D2/D1比值较大的菌种，接种于2216E液体培养基，25°C，180rpm条件下振荡培养1-2天，菌液分装于菌液保藏管，加20%甘油保存。经初筛获得的菌株接种于含2216E液体培养基的试管中，25°C，180rpm条件下振荡培养过夜。取ImL菌液，在10，OOOrpm、室温条件下离心lmin，取上清。以I型胶原为底物测定胶原蛋白酶活性。通过产酶培养基复筛获得菌株。
[0019]1.2海洋细菌的形态特征:
[0020]将实验室保存的300株海洋细菌接种于初筛平板上，37°C培养24h。共分离到69株产明胶酶菌株。挑选水解圈直径与菌落直径比值最大的菌MB004(图1)来进行培养，观察该菌，菌落显圆形，边缘不整齐，表面干燥有褶皱，无粘性，不透明，灰白色，滴加酸性汞试剂能产生透明水解圈，菌落直径平均约0.75cm，透明水解圈直径平均约3.0Ocm,比值为4.0，可以确定海洋细菌MB004产生了胶原蛋白酶。
[0021]由于胶原蛋白酶能分解明胶，从而使菌落周围产生一个被分解了的圆圈，酸性汞试剂能与明胶反应产生白色物质，而不会与明胶分解后的产物产生白色物质，故在能分解明胶的菌落周围滴加酸性汞试剂后会产生一个透明水解圈，水解圈与菌落的直径比越大，可基本说明该菌产生的酶活力或酶数量越大，以此初步判断出目的菌。[0022]1.3海洋细菌产胶原蛋白酶的分子生物学鉴定
[0023]按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取目的菌株的基因组DNA，随后采用16SrRNA通用引物27F和1492R进行PCR扩±曾，其引物的序列为27F:5’ -AGAGTTTGATCCTGGC-3’ ；1492R:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，并且 PCR 扩增产物的片断大小为1405bp。
[0024]目的片段经回收纯化与PMD18-T Vector连接，然后转化到DH5 α细胞，最后提取重组质粒进行目的片段的测序，测序由上海英骏生物技术有限公司完成。获得的16SrRNA序列提交GenBank用BLAST软件(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)与已知序列进行对比，用ClustalXl.8.msw软件进行排列，利用MEGA3.1软件绘制系统树并确定它们的系统发生学地位。根据ORF的基因功能提示，我们发现交替假单胞菌MB004基因组中含有一条完整的胶原蛋白酶编码基因，命名为Pnjc。该基因全长1359bp，GC含量45.62%，编码由452个氨基酸残基组成的约51kD大小的胶原蛋白酶(图4)。经Blast比对分析发现，该基因编码的胶原蛋白酶PNJC与同属中的蛋白酶相似性均在85%以上，其中可以看出MB004菌与交替假单胞菌piscicida中的蛋白酶相似性最高,达到99%。
[0025]1.4海洋细菌菌株的分子生物学鉴定
[0026]将亲缘关系较近的菌株16S rRNA应用MEGA软件进行多重比较，用中邻接法(Neibor-joining method)建系统进化树,如图2所示,从进化树可以看出MB004菌株属于交替假单胞杆菌。
[0027]1.5胶原蛋白酶活性检测
[0028]以不溶性I型胶原蛋白为底物，采用茚三酮显色法，胶原蛋白酶水解底物释放的水溶性氨基酸和短肽。反应体系:0.1mL酶液，0.5mL pH7.50.lmol/L Tris-HCl缓冲液(含50mmol CaC12)，不溶性I型胶原lmg。37°C孵育30min，加入0.6mll0%的三氯乙酸(TCA)终止反应。反应物10，000r/min离心IOmin,取上清液0.6mL并加入0.6ml pH5.42mol/L乙酸缓冲液及0.6mL茚三酮显色溶液，充分混合后，100°C水浴中加热15min，冰水冷却5min，经60%乙醇稀释后于570nm处测定吸光值。以不加目的蛋白作为阴性对照，胶原蛋白酶标准品作为酶活反应的阳性对照，每组反应均重复三次。以甘氨酸为标准制作标准曲线。
[0029]酶活力定义为:在37°C，PH值7.5条件下，每分钟水解胶原蛋白产生相当于Iug甘氨酸的酶量为I个酶活力单位(U)。
[0030]本发明的有益效果在于:本发明从海洋细菌中筛选出能产生胶原蛋白酶的细菌MB004，从而获得其胶原蛋白酶基因，并通过异源表达与亲和层析纯化获得重组蛋白PNJC。胶原蛋白酶PNJC的酶活力为160.34U/mg,达到胶原蛋白酶标准品的70.48%，具有重要的研究开发价值。原核表达系统诱导条件的优化、重组蛋白纯化方法的改进、氨基酸位点的突变将有助于我们获得高质量的具有生物活性的重组蛋白PNJC，并鉴定了其编码蛋白的胶原蛋白酶活性，高酶活力表明海洋细菌来源的胶原蛋白酶具有重要的研究价值，为胶原蛋白酶的工业化生产提供了捷径，其操作简便，成本低廉，为首个交替假单胞菌属来源的胶原蛋白酶的工业化生产奠定坚实的基础。胶原蛋白作为一种重要的天然蛋白质资源，无论在生物医学、食品保健还是在化妆品、纺织行业中的应用都十分广泛，综合利用的研究进展速度很快，其良好的生物相容性、生物可降解性，使它在食品工业中具有广泛的应用前景和发展。依靠微生物产生胶原蛋白酶，再制备胶原蛋白是一个发展迅速的胶原蛋白获得方式。本研究为海洋来源胶原蛋白酶的工业化生产奠定了坚实的基础。
[0031]保藏说明
[0032]1、MB004菌株，即假交替单孢菌Pseudoaltermonas sp,保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M2014010。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]以下将结合附图对本发明做进一步的详细描述，其中:
[0034]图1为本发明在平板上的透明圈；
[0035]图2为本发明菌株16S rRNA进化树分析图；
[0036]图3胶原蛋白酶编码基因Pnjc的PCR扩增；
[0037]图4重组蛋白PNJC的诱导表达与SDS-PAGE检测；
[0038]图5A31结构域蛋白亲和层析纯化的SDS-PAGE结果。
【具体实施方式】
[0039]为以下将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
[0040]实施例1交替假单胞菌MB004表达载体的构建
[0041]PCR引物:根据本发明中已克降到的交替假单胞菌MB004(基因登录号:KF439859)基因两端序列设计引物，同时`为构建载体方便，在引物的5’端分别引入限制性内切酶Bgl II 和 Xho I 位点，引物 Pl:5’ -CGGGATCCATGTTTGTACCAGAACTTCT-3> ;引物 P2:5’ -CCCAAGCTTTTATGCCTTTTTAAAAGGAT-3，;引物由Invitrogen公司生产合成。交替假单胞菌MB004细菌基因组DNA的提取是按照试剂盒说明书提取目的菌株的基因组DNA获得，随后采用16SrRNA通用引物27F和1492R，用PCR技术获得目的序列。测序由上海英骏生物技术有限公司完成。其中，PCR反应条件为:以MB004基因组为模版进行PCR扩增，扩增条件为:95°C 5min ；95°C 30s,51°C 30s, 72°C 90s，共35个循环；72°C延伸lOmin。经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段；
[0042]PCR产物的克隆和鉴定:利用限制性内切酶Bgl II和Xho I分别对表达质粒pET28a和胶原蛋白酶基因进行双酶切，回收的酶切片段经DNA T4连接酶连接后转化大肠杆菌Rosseta (DE3)感受态细胞。通过菌落PCR检测筛选获得阳性转化子，获得重组质粒pET28a-Pnjc。核苷酸序列的测序由Invitrogen公司完成。
[0043]利用带有酶切位点的引物对进行PCR扩增结果显示，扩增片段大小与交替假单胞菌NJ631中胶原蛋白酶编码基因Pnjc的序列大小相符(如图3所示)。图3中M为DNAmaker分子量标准DL2000，I为PCR产物阴性对照，2，3为Pnjc DNA片段扩增。将Pnjc与表达载体pET28a分别经限制性内切酶酶切后，回收酶切片段。经转化、菌落PCR检测，筛选获得重组转化子。测序结果显示pET28a在酶切位点Bgl II和Xho I之间成功插入Pnjc基因片段且无突变点。
[0044]实施例2重组菌的诱导表达的表达和免疫印迹(Western-blotting)
[0045]以pET28a为表达载体，经IPTG诱导表达后发现重组蛋白PNJC在大肠杆菌Rosseta (DE3)中得到高效表达(图4)，在51kD附近有明显蛋白条带，与胶原蛋白酶PNJC大小相符。PNJC在IPTG诱导浓度为0.2mmol/L时的表达量与lmmol/L IPTG诱导下的表达量相当。细胞裂解液上清液与沉淀的分析结果表明可溶性重组蛋白PNJC表达显著。图4中M为Markers ;1为未诱导的pET28a_PNJC转化子的细胞裂解上清液；2为未诱导的pET28a-PNJC转化子的细胞裂解沉淀；3为0.2mmol/L IPTG诱导的pET28a_PNJC转化子的细胞裂解上清液；4为0.2mmol/L IPTG诱导的pET28a_PNJC转化子的细胞裂解沉淀；5为lmmol/L IPTG诱导的pET28a_PNJC转化子的细胞裂解上清液；6为lmmol/L IPTG诱导的pET28a-PNJC转化子的细胞裂解沉淀。
[0046]实施例3重组菌的重组蛋白纯化
[0047]将含有重组蛋白PNJC的细胞裂解上清液上样N1-NTA琼脂糖凝胶纯化柱，利用PNJC碳端带有组氨酸标签对其进行亲和层析纯化，通过梯度洗脱获得纯化重组蛋白。SDS-PAGE检测表明成功获得纯化的胶原蛋白酶PNJC (图5)。经蛋白定量试剂盒检测显示纯化得到的胶原蛋白酶PNJC蛋白浓度约为lmg/mL。如图5所示，M为Markers ；1为未诱导组的细胞裂解上清液；2为0.2mmol/L诱导的细胞裂解上清液；3为流穿液；4为杂蛋白清洗；5为纯化的目的 蛋白。
【权利要求】
1.一种利用海洋细菌交替假单胞菌MB004产的胶原蛋白酶基因，它的核苷酸序列如〈400〉I 所述。`
【文档编号】C12N15/57GK103773786SQ201410030236
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】周宇芳, 朱鹏, 相兴伟, 杨会成, 肖金星, 徐珊 申请人:浙江省海洋开发研究院, 宁波大学