一株海洋壳青霉、其衍生的喹啉酮类化合物及其制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一株海洋真菌壳青霉、其衍生的喹啉酮类化合物及该化合物的制备和应用。所述喹啉酮类化合物的具体结构式如R1～R6所示，其制备方法为将壳青霉AP2T1?CGMCC?No.8516接种于培养基中静止发酵，发酵液经乙酸乙酯萃取，菌丝体由有机溶剂提取，合并后粗提物用有机溶剂进行葡聚糖凝胶柱、反相硅胶柱层析，经薄层层析检测，将含有中间体的洗脱组分进行甲基化处理后，继续进行制备薄层层析、反相硅胶柱层析分离纯化得目标化合物R1～R6；化合物R1～R6显示出在制备抗肿瘤药物、抗细菌剂及农用杀虫剂中具有广泛的应用前景。
【专利说明】一株海洋壳青霉、其衍生的喹啉酮类化合物及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】；涉及一株海洋真菌壳青霉AP2T1，特别是利用该真菌衍生的喹啉酮类化合物与其制备方法以及其在抗肿瘤药物、抗细菌抗生素及杀虫剂领域的应用。
【背景技术】
[0002]目前在临床治疗中发现肿瘤的耐药性也在不断增强，且出现多药耐药性现象，已有抗肿瘤药物在临床化疗中越来越力不从心；另外临床治疗发现病原微生物的耐药性越来越强，很多传统抗生素已基本丧失疗效，因此有必要寻找新型的抗肿瘤药物和抗生素来满足临床药物研发的需要。此外，在农业生产因为过度使用各种化学合成农药，造成严重的食品、土壤及水污染，并经过食物链危及人体健康和生态平衡，农药残留也严重阻碍了我国的农产品出口 ；而生物农药具有不易产生抗药性、对非靶生物安全、环境友好且易于自然降解等优点，对于人类健康、环境保护及农业可持续发展具有重要的意义。海洋真菌来源的抗肿瘤药物、抗细菌抗生素及杀虫剂具有易于大规模发酵生产、高效、易于克服抗药性等优点，易于实现药源稳定供给，具有较好的经 济、社会与环境效益。
【发明内容】
[0003]本发明通过分离于鲨鱼灰鲭鲨觸部的真菌壳青霉(Penicillium crustosum)CGMCC N0.8516发酵；经提取、分离、甲基化、分离获得的喹啉酮类化合物，经实验得出这些化合物在制备抗肿瘤药物、抗细菌剂及农用杀虫剂中都具有广泛的应用前景，有较好的经济、社会与环境效益。
[0004]本发明涉及的海洋真菌壳青霉(Penicillium crustosum) AP2T1是从中国东海渔获的海洋生物灰鲭鲨鳃耙组织中分离获得。该菌株合适的生长盐浓度范围为2.0%~5.0%。依据ITSl-5.8S-1TS2rDNA序列分析比对及《真菌鉴定手册》(魏景超，1979)，经鉴定为Penicillium crustosum AP2T1菌株，已于2013年11月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(其简称为CGMCC)，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏编号为=CGMCC N0.8516。
[0005]海洋真菌壳青霉(Penicillium crustosum) AP2T1具有下述性质:接种到海水马铃薯葡萄糖培养基(海水PDA)平板上，28°C培养，菌落开始为白色，圆形，向四周扩展，后从菌落中央向边缘产生灰绿色孢子，整个菌落呈粉粒状，中央凸起，有多道同心纹，边缘颜色较浅、放射状，背面产黄色色素。菌丝生长速度每天0.44cm。基部无足细胞，顶端不形成膨大的顶囊，其分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，形成典型的帚状分生孢子穗。孢子圆形，绿色；分生孢子梗基部无足细胞。最佳生长温度范围26~30°C，最佳生长pH为6.0~7.0，可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖等碳源。该菌株在海水马铃薯蔗糖液体培养基中静置发酵可产生抗肿瘤、抗菌、杀虫活性物质。[0006]海洋真菌壳青霉(Penicilliumcrustosum) AP2T1 的 ITS1-5.8S_ITS2rDNA 序列(541bp)已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为 JN368448。
[0007]本发明还公开了一系列喹啉酮类化合物，其由上文所述的海洋真菌壳青霉(Penicillium crustosum) AP2T1CGMCC N0.8516衍生，所述喹啉酮类化合物的结构式为:
[0008]
【权利要求】
1.一株海洋真菌壳青霉(Penicillium crustosum) AP2T1，其保藏编号为CGMCCN0.8516。
2.喹啉酮类化合物，其特征在于:由所述的海洋真菌壳青霉(Penicilliumcrustosum) AP2T1CGMCC N0.8516衍生，所述喹啉酮类化合物的结构式为:
3.如权利要求2所述的喹啉酮类化合物的制备方法，其特征在于包括如下操作步骤: I.发酵 从壳青霉(Penicillium crustosum) CGMCC N0.8516发酵产物中提取、分离纯化viridicatol ； I1.甲基化 a.将步骤I获得的viridicatol干燥后加入密闭反应容器，在氩气或干燥氮气保护下，按照每0.1g viridicatol加入0.5~1.5mL无水二甲基甲酰胺的比例添加,室温下磁力搅拌8~20min ； b.搅拌状态下，向步骤a产物中分三次，每次间隔15~25min，逐滴加入三甲基硅重氮甲烧的2.0M 二乙醚溶液,其每次加入的体积与步骤a中viridicatol的质量比为0.2~.0.3mL:0.1 ~0.15mL:0.1 ~0.15mL:0.1g ； c.继续搅拌2~4小时，TLC监测反应进程； d.真空抽干溶剂以终止反应； e.按照每0.1g viridicatol加入0.1~0.5mL水的比例加水,真空抽干； f.分离纯化得到化合物R1-R6； 或者，化合物R6从步骤I获得的发酵产物中，经过柱层析得到； 所述化合物R1-R6在薄层层析板上，于254nm紫外线照射下均呈单个的深紫色斑点，在365nm紫外线照射下均呈单个的紫色荧光斑点，硫酸茴香醛显色均为浅橙色；其高效液相色谱-质谱联用分析的保留时间及分子量依次为15.2min、M=295 ；12.7min、M=295 ；.12.7min、M=281 ；11.2min、M=281 ；10.2min、M=281 ；9.0min、M=267 ；所述的检测用高效液相色谱分析条件为Nucleosil C-18柱,填料粒径3微米,柱尺寸.2.0mmX 100mm，流动相为A相:0.1%甲酸水溶液，B相:0.06%甲酸乙腈溶液，0_15minl0%B线性梯度增至100%B，15-20min为100%B，流速0.4mL/min ;检测器为阵列二极管检测器、电喷雾质谱仪。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤I中所述的提取包括以下操作步骤:过滤发酵产物，分别收集菌丝体和发酵液，并将获得的发酵液经乙酸乙酯萃取并浓缩，将获得的菌丝体用有机溶剂提取并浓缩，将所得浓缩物合并，即为粗提物； 其中，所述有机溶剂为丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中一种或几种。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤I中所述的分离纯化包括以下操作步骤: 将步骤I中所获得的提取产物经色谱分离，得到在S1-60F254薄层层析板上Rf值为.0.27、254nm紫外光下呈暗紫色、365nm紫外线下有紫色突光的物质viridicatol,层析展开剂为体积比为9:1的氯仿-甲醇混合溶液。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤I中的发酵所用培养基组成为:每升含土豆汁500mL,天然粗海盐配制的30~50g/L盐水500mL,鹿糖15~25g。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:步骤I中发酵的条件是:26~30°C培养箱静止发酵25~35天，发酵结束时加入发酵液一半体积的乙酸乙酯。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:步骤IIf中所述的分离纯化方法为薄层层析和反相柱层析法，其具体如下: a.将步骤IIe获得的中间体甲基化产物用有机溶剂溶解后，加样至S1-60F254制备薄层层析板，以体积比20:1的氯仿-甲醇为展开剂进行层析后，分别刮取Rf值为0.90,0.79、.0.67,0.43和0.15的带，研磨后用2~10:1的氯仿-甲醇洗脱，收集洗脱液并浓缩干燥。其中Rf值为0.79,0.67及0.15的条带洗脱物为所述的化合物R2、R3、和R6 ； b.将步骤a中Rf值为0.90条带洗脱物，再次使用S1-60F254制备薄层层析板分离，以体积比2:1的石油醚-丙酮为展开剂，刮取Rf值为0.60的条带，研磨后用2~10:1的氯仿-甲醇洗脱，收集洗脱液浓缩干燥得到所述的化合物Rl ； c.将步骤a中Rf值为0.43条带洗脱物，使用反向硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比.70:30的甲醇-水，流速0.50~0.60个柱体积/小时，分别收集1.5~3.0及2.5~4.0个柱体积之间的洗脱液，收集洗脱液浓缩干燥分别得到所述的化合物R4和R5。
9.如权利要求2 所述的喹啉酮类化合物在制备抗肿瘤药物、抗细菌抗生素及农用杀虫剂中的应用。
【文档编号】C12R1/80GK103937678SQ201410036251
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年1月24日 优先权日:2014年1月24日
【发明者】张翼, 穆军, 冯妍, 斯蒂芬妮·格弘德, 韩金媛, 温利雪, 鲍海燕 申请人:大连交通大学