一种生产人红细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及生物制品领域，具体而言，涉及一种生产人红细胞的方法。该生产人红细胞的方法，包括以下步骤：（a）将购入的带有CD34标记的人胚胎干细胞扩增培养；（b）将扩增培养的带有CD34标记的人胚胎干细胞接种至铺有骨髓细胞系S17的培养皿，培养至细胞由扁平变圆；（c）将得到的细胞进行分选得到未脱核的人红细胞；（d）将未脱核的人红细胞进行三维培养至成熟，得到脱核的人红细胞。本发明提供的生产人红细胞的方法，采用人干细胞在体外生产红细胞，生产量可控，且可根据市场需求进行定量的生产，以满足需要。
【专利说明】一种生产人红细胞的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及生物制品领域，具体而言，涉及一种生产人红细胞的方法。
【背景技术】
[0002]目前，人红细胞是血液中数量最多的一种血细胞，红细胞是血液运送氧气的最主要的媒介。当人失血时，需要快速的补充红细胞，而目前红细胞来源主要是人体血液，而输注的人血主要来源于志愿献血者或是职业卖血者，不但血源奇缺，且价格昂贵，此外，血液中还可能携带病毒等，给需要输送血液的人的生命造成额外的威胁。因此，目前的红细胞来源非常单一，且产量极其有限，不能满足需要。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种生产人红细胞的方法，以解决上述的问题。
[0004]在本发明的实施例中提供了一种生产人红细胞的方法，包括以下步骤:
[0005]Ca)将购入的带有⑶34标记的人胚胎干细胞扩增培养；
[0006](b)将扩增培养的带有⑶34标记的人胚胎干细胞接种至铺有骨髓细胞系S17的培养皿，培养至细胞由扁平变圆；[0007](c)将得到的全部细胞进行分选得到未脱核的人红细胞；
[0008](d)将未脱核的人红细胞进行三维培养至成熟，得到脱核的人红细胞。
[0009]优选地，该方法中的培养基均为干细胞基础培养基；
[0010]所述干细胞基础培养基具体成分为:DMEM培养基中加入15%的2%人血白蛋白，ImM丙酮酸钠，甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸各为0.1mM, 2mM谷氨酰胺，0.1mM巯基乙醇，IL DMEM培养基加入I X IO6U青霉素和I X IO6U链霉素。
[0011 ] 优选地，该方法中所述的培养条件均为温度37°C，5%C02,培养湿度为40%_70%。
[0012]优选地，该方法中均以5%_10%的接种量进行培养，接种的细胞浓度为4.0 X IO6个/ml ~9.0X IO6 个/ml。
[0013]优选地，在所述步骤(a)中，所述扩增培养具体为将带有⑶34标记的人胚胎干细胞生长至对数生长期。
[0014]优选地，在所述步骤(a)中，培养时间为24_72h。
[0015]优选地，在所述步骤(b)中，所述铺有骨髓细胞系S17的培养皿为培养皿底面铺上一层骨髓细胞系S17。
[0016]优选地，在所述步骤(b)中，培养24_34h时细胞由扁平变圆。
[0017]优选地，在所述步骤(C)中，所述分选采用流式细胞仪。
[0018]优选地，还包括将脱核的人红细胞进行冷冻干燥后于_4°C保存。
[0019]本发明实施例提供的一种生产人红细胞的方法，采用人干细胞在体外生产红细胞，生产量可控，且可根据市场需求进行定量的生产，以满足需要。【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为未筛选的培养得到的细胞图；
[0021]图2为流式细胞仪分选出的阳性的未脱核的人红细胞图；
[0022]图3为显微镜下观察流式细胞仪分选出的未脱核的人红细胞图；
[0023]图4为显微镜下观察脱核的人红细胞图；
[0024]图5为脱核的人红细胞的细胞氧解离曲线图。
【具体实施方式】
[0025]下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。
[0026]在本发明的实施例中提供了一种生产人红细胞的方法，包括以下步骤:
[0027]将购入的带有⑶34标记的人胚胎干细胞扩增培养；
[0028]将扩增培养的带有CD34标记的人胚胎干细胞接种至铺有骨髓细胞系S17的培养皿，培养至细胞由扁平变圆；
[0029]将得到的全部细胞进行分选得到未脱核的人红细胞；
[0030]将未脱核的人红细胞进行三维培养至成熟，得到脱核的人红细胞。
[0031 ] 带有⑶34标记的人胚·胎干细胞购自德国的MILTENYI干细胞库，货号为130-046-702。带有⑶34标记的人胚胎干细胞是已经建立的成熟且已经商品化的细胞系。
[0032]不同生长条件下，细胞生长的状态不同，本发明中⑶34标记的人胚胎干细胞培养的条件均为温度37°C，5%C02,培养湿度为40%-70%，这种生长条件下，细胞生长较好。
[0033]若细胞的接种密度过小，细胞的滞留期就会比较长；而细胞接种密度比较大，则很快就能进入对数期，不利于快速繁殖。因此，优选地，该方法中均以5%-10%的接种量进行培养，接种的细胞浓度为4.0 X 106个/ml~9.0 X 106个/ml。
[0034]本发明使用干细胞基础培养基进行培养，干细胞基础培养基具体成分为:DMEM培养基中加入15%的2%人血白蛋白，ImM丙酮酸钠，甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸各为
0.1mM, 2mM谷氨酰胺，0.1mM巯基乙醇，1L DMEM培养基加入1 X 106U青霉素和1 X 106U链霉素。经验证，带⑶34标记的人胚胎干细胞在此培养基生长较好。
[0035]细胞进行扩增培养时，若是培养时间过长，细胞生长老化，不利于得到的细胞的利用；若是培养时间过短，不能得到较多的细胞。因此，为了得到的细胞数目较多，且细胞生长状态较好，扩增培养为带有CD34标记的人胚胎干细胞生长至对数生长期。根据接种细胞的量的多少，以及生长条件，培养时间为24-72h达到对数生长期。
[0036]骨髓细胞系S17分泌多种细胞因子，具有诱导分化的作用，本发明中的⑶34标记的人胚胎干细胞在培养皿底部铺有骨髓细胞系S17,培养皿中加入干细胞基础培养基的环境中生长，模拟了干细胞在人体分化成红细胞的环境，能够得到红细胞。为了有效利用骨髓细胞系S17所提供的营养而不造成浪费，在所述步骤(b)中，所述铺有骨髓细胞系S17的培养皿为培养皿底面铺上一层骨髓细胞系S17。培养皿底面铺上一层骨髓细胞系S17在实际进行实验时，可以观察到。
[0037]具体地，对于培养皿的规格为直径150mm，高度25mm，取1-1.5ml的2.ΟΧΙΟ6个/ml-4.0 X 106个/ml细胞数目的骨髓细胞系S17加入到培养皿，将其均匀铺到培养皿上，即培养皿底面铺上一层骨髓细胞系S17。[0038]培养的细胞由扁平变圆时，说明带有CD34标记的人胚胎干细胞诱导分化生长成功，培养时间为24-34h。培养得到的细胞如图所示。将得到的细胞进行分选，将未脱核的人红细胞分选出来，以将纯化的未脱核的人红细胞进行培养。
[0039]细胞分选采用流式细胞仪进行分选，流式细胞仪分选准确率高，且方便快捷。分选的细胞如图2所示。显微镜下观察分选的阳性细胞如图3所示。
[0040]将未脱核的人红细胞进行三维培养，三维培养更能模拟体内的生长环境，培养至生长成熟时得到的脱核人红细胞更好。得到的脱核人红细胞在显微镜下观察如图4所示。
[0041]为了利于得到的成熟红细胞进行保藏，优选地，将脱核的人红细胞进行冷冻干燥后于-4°C保存。
[0042]实施例1
[0043]取带有⑶34标记的人胚胎干细胞以5%的接种量，接种的细胞浓度为4.0X IO6个/ml，接种至干细胞基础培养基扩增培养，培养72h ；
[0044]取Iml的4.0X IO6细胞数目的骨髓细胞系S17加入到培养皿，培养皿的规格为直径150mm，高度25mm ;将其均匀铺到培养皿上，然后加入2ml的4.0 X IO6个/ml细胞数目的带有CD34标记的人胚胎干细胞和18ml的干细胞基础培养基，然后进行培养；
[0045]培养时间为24h，细胞由扁平变圆；
[0046]将全部细胞进行采用流式细胞仪进行分选，得到未脱核的人红细胞；
[0047]将未脱核的人红细胞以5%的接种量，接种的细胞浓度为5.0X IO6个/ml接种，进行三维培养至成熟，得到脱核的人红细胞。
[0048]将脱核的人红细胞进行冷冻干燥后于_4°C保存。
[0049]实施例2
[0050]取带有⑶34标记的人胚胎干细胞以8%的接种量，接种的细胞浓度为6.0X IO6个/ml，接种至干细胞基础培养基扩增培养，培养48h ；
[0051]取1.5ml的2.0 X IO6细胞数目的骨髓细胞系S17加入到培养皿，培养皿的规格为直径150mm，高度25mm ;将其均匀铺到培养皿上，然后加入2ml的7.0 X IO6细胞数目的带有CD34标记的人胚胎干细胞和17ml的干细胞基础培养基，然后进行培养；
[0052]培养时间为34h，细胞由扁平变圆；
[0053]将全部细胞进行采用流式细胞仪进行分选，得到未脱核的人红细胞；
[0054]将未脱核的人红细胞以8%的接种量，接种的细胞浓度为9.0X IO6个/ml接种，进行三维培养至成熟，得到脱核的人红细胞。
[0055]将脱核的人红细胞进行冷冻干燥后于_4°C保存。
[0056]实施例3
[0057]取带有⑶34标记的人胚胎干细胞以10%的接种量，接种的细胞浓度为9.0X IO6个/ml，接种至干细胞基础培养基扩增培养，培养24h ；
[0058]取1.2ml的 mm ;将其均匀铺到培养皿上，然后加入2ml的6.0 X IO6个/ml细胞数目的带有CD34标记的人胚胎干细胞和24ml的干细胞基础培养基，然后进行培养；
[0059]培养时间为30h，细胞由扁平变圆；
[0060]将全部细胞进行采用流式细胞仪进行分选，得到未脱核的人红细胞；[0061]将未脱核的人红细胞以10%的接种量，接种的细胞浓度为4.0X 106个/ml接种，进行三维培养至成熟，得到脱核的人红细胞。
[0062]将脱核的人红细胞进行冷冻干燥后于_4°C保存。
[0063]实施例1-3中的培养的条件为温度37 V，5%C02,培养湿度为40%_70%。
[0064]将上述得到的脱核的人红细胞进行溶解氧饱和度测定，采用的是溶解氧饱和度测试仪，型号:HB416-JPSJ-605，测量范围:溶解氧0.00~20.00mg/L，溶解氧饱和度0.0~200.0%，温度:37°C。以氧分压(P02)值为横从标，血氧饱和度为纵坐标，得出一条S形的曲线称为氧解离曲线图1，与正常人红细胞氧解离曲线一致。由图1可知，P50=26，即氧分压为26时，血氧饱和度达到50%，说明此红细胞携氧能力强。
[0065]本发明提供的一种生产人红细胞的方法，得到的人红细胞性状稳定，与正常人红细胞氧解离曲线一致；采用人干细胞生产红细胞，没有异源质，也没有任何病原菌，保护剂等化学制品，安全可靠。本发明采用人干细胞在体外生产红细胞，生产量可控，且可根据市场需求进行定量的生产，以更好的满足需要。
[0066]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在 本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种生产人红细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤:(a)将购入的带有⑶34标记的人胚胎干细胞扩增培养；(b)将扩增培养的带有CD34标记的人胚胎干细胞接种至铺有骨髓细胞系S17的培养皿，培养至细胞由扁平变圆；(c)将得到的细胞进行分选得到未脱核的人红细胞；(d)将未脱核的人红细胞进行三维培养至成熟，得到脱核的人红细胞。
2.根据权利要求1所述的一种生产人红细胞的方法，其特征在于，该方法中的培养基均为干细胞基础培养基；所述干细胞基础培养基具体成分为:DMEM培养基中加入15%的2%人血白蛋白，ImM丙酮酸钠，甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸各为0.1mM, 2mM谷氨酰胺，0.1mM巯基乙醇，1LDMEM培养基加入1 X 106U青霉素和1 X 106U链霉素。
3.根据权利要求2所述的一种生产人红细胞的方法，其特征在于，该方法中培养条件均为温度37°C，5%C02,培养湿度为40%-70%。
4.根据权利要求3所述的一种生产人红细胞的方法，其特征在于，该方法中均以5%-10%的接种量进行培养，接种的细胞浓度为4.0 X 106个/ml~9.0 X 106个/ml。
5.根据权利要求4所述的一种生产人红细胞的方法，其特征在于，在所述步骤(a)中，所述扩增培养具体为将带有⑶34标记的人胚胎干细胞生长至对数生长期。
6.根据权利要求5所述的一种生产人红细胞的方法，其特征在于，在所述步骤(a)中，培养时间为24-72h。`
7.根据权利要求1所述的一种`生产人红细胞的方法，其特征在于，在所述步骤(b)中，所述铺有骨髓细胞系S17的培养皿为培养皿底面铺上一层骨髓细胞系S17。
8.根据权利要求7所述的一种生产人红细胞的方法，其特征在于，在所述步骤(b)中，培养24-34h时细胞由扁平变圆。
9.根据权利要求1所述的一种生产人红细胞的方法，其特征在于，在所述步骤(c)中，所述分选采用流式细胞仪。
10.根据权利要求1所述的一种生产人红细胞的方法，其特征在于，还包括将脱核的人红细胞进行冷冻干燥后于-4°C保存。
【文档编号】C12N5/0735GK103740642SQ201410042250
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】娄彩玲 申请人:娄彩玲