一种用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒，属于生物检测【技术领域】。所述用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的引物和荧光探针，引物包括正向引物和反向引物，正向引物如序列表中SEQ?ID?NO.1；反向引物如序列表中SEQ?ID?NO.2；所述荧光探针如序列表中SEQ?ID?NO.3。所述用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的试剂盒包括上述引物和荧光探针。本发明提供的引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，均能达到100%的特异性和100%的阳性检出率，其试剂盒能够精确定量测定核酸的量，有效防止假阴性和假阳性结果，其检测方法能够快速、准确地对病原体直接进行检测。
【专利说明】—种用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测【技术领域】，特别涉及一种用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒。
【背景技术】
[0002]蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia Stiles，GL)，简称贾第虫，又称兰布尔吉亚尔氏鞭毛虫或梨形鞭毛虫，属于鞭毛虫纲，蓝氏贾第鞭毛虫能够引起一种以腹泻为主要症状的肠道疾病。蓝氏贾第鞭毛虫寄生人体小肠、胆囊主要在十二指肠，可引起腹痛、腹泻和吸收不良等症状，当虫体蓝氏贾第鞭毛虫寄生在胆道系统时，可能引起胆囊炎或胆管炎。
[0003]现有技术中对蓝氏贾第鞭毛虫的快速检测方法为实时荧光定量PCR (PolymeraseChain Reaction,聚合酶链式反应)技术，实时荧光定量PCR技术与传统的核酸扩增技术方法相比，避免了核酸扩增技术的污染以及检测结果易出现假阳性或假阴性结果的问题，且实时荧光定量PCR技术比核酸扩增技术的检测结果特异性更高。
[0004]在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题:
[0005]虽然实时荧光定量PCR技术检测的结果特异性高，但仍不能达到100%的特异性和准确性，使得现有的检测方法并不能准确地检测出人体上是否寄生有蓝氏贾第鞭毛虫。
【发明内容】
[0006]为了解决现有技术中检测方法不准确的问题，本发明实施例提供了一种用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒。所述技术方案如下:
[0007]—方面，本发明提供了一种用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的引物和荧光探针，所述引物包括正向引物和反向引物，
[0008]所述正向引物如序列表中SEQ ID N0.1。
[0009]所述反向引物如序列表中SEQ ID N0.2。
[0010]所述荧光探针如序列表中SEQ ID N0.3。
[0011]所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5’端的所述荧光报告基团为:FAM、HEX、TET, JOE、VIC、ROX, Cy3或Cy5，修饰所述3’端的淬灭基团为:TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
[0012]另一方面，本发明提供了一种用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和荧光探针。
[0013]进一步地，所述试剂盒还包括PCR反应液、核酸释放试剂、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品和工作标准品，其中:
[0014]所述PCR反应液包括:无菌水、具有5’ 一3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10XPCR Buffer和含Mg离子的溶液。
[0015]所述核酸释放试剂由无菌水、Triton-XlOO, NP-40和Tris-HCL组成。[0016]所述阴性质控品为不含蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因的PUC57-T载体质粒DNA。
[0017]所述阳性质控品为1.0X 106IU/mL含所述蓝氏贾第鞭毛虫的基因组DNA片段。
[0018]所述临界阳性质控品为1.0X 104IU/mL含所述蓝氏贾第鞭毛虫的基因组DNA片段。
[0019]具体地，所述具有5’ 一 3’外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。
[0020]进一步地，所述PCR反应液中所述Taq酶的终浓度为0.01U/ μ L~0.05U/ μ L，所述dNTPs的终浓度为0.2~0.6mM,所述10 X PCR Buffer的终浓度为I X，所述MgCl2的终浓度为1.5~5.0mM，溶剂为无菌水。
[0021]具体地，所述正向引物的终浓度为0.05~0.9 μ M，所述反向引物的终浓度为
0.05~0.9 μ Μ，所述荧光探针的终浓度为0.05~0.9 μ Μ。
[0022]具体地，所述核酸释放试剂中Triton-XlOO的终浓度为0.03~0.3%、ΝΡ-40的终浓度为0.04~0.4%以及pH值为8.3的Tris-HCL的终浓度为0.01~0.1M，溶剂为无菌水。
[0023]进一步地，所述Tris-HCL的pH值为8.3。
[0024]进一步地，所述试剂盒还包括工作标准品，所述工作标准品为含有所述蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因的72个碱基对的核苷酸片段的pUC57-T重组质粒DNA。
[0025]具体地，所述工作标准品包括:
[0026]工作标准品1，含有1.0X 107 IU/mL所述蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因的非传染性DNA片段。
[0027]工作标准品2，含有1.0X106IU/mL所述蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因的非传染性DNA片段。
[0028]工作标准品3，含有1.0X105IU/mL所述蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因的非传染性DNA片段。
[0029]工作标准品4，含有1.0X 104IU/mL所述蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因的非传染性DNA片段。
[0030]本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是:本发明实施例提供的用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的实时TaqMan荧光定量PCR引物、荧光探针和试剂盒，其引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，均能达到100%的特异性和100%的阳性检出率，其试剂盒能够精确定量测定核酸的量，有效防止假阴性和假阳性结果，其检测方法能够快速、准确地对病原体直接进行检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0032]图1是本发明实施例二提供的荧光扩增曲线图；
[0033]图2是本发明实施例三提供的荧光扩增曲线图；[0034]图3是本发明实施例四提供的荧光扩增曲线图；
[0035]图4是本发明实施例四提供的四种标准品的荧光扩增曲线图；
[0036]图5是本发明实施例四提供的荧光扩增曲线图；
[0037]图6是本发明实施例四提供的由图4得到的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0038]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
[0039]以下实施例中所用试剂主要购自宝生物工程(大连)有限公司。
[0040]实施例一
[0041]本发明实施例提供一种用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的引物和荧光探针，其中，选择蓝氏贾第鞭毛虫的特异性保守基因β贾第素基因作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Informatio n, NCBI)(http://www.ncb1.nlm.nih.gov),获得蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因基因序列，并在线(http://www.eb1.ac.uk/)并对蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因序列进行序列比对，在基因区选择一段保守序列，该序列如序列表中SEQ ID N0.4所示:GCGGTCAAGCTCAGCAACATGAACCAGCGCGTCAGCAGGTTCCACGACAAGATGGAGAACGAGATCGAGGTC，利用实时 TaqMan 荧光定量 PCR的专业设计软件BeaCOnDesigner7.0设计引物和荧光探针序列，引物和荧光探针序列要满足软件中各项指标。
[0042]在本发明实施例中，修饰荧光探针的5’端的荧光报告基团可以为:FAM，HEX，TET，J0E，VIC，R0X，Cy3*Cy5 ;修饰荧光 探针的3’端的淬灭基团可以为:TAMRA，Eclipse，BHQl，BHQ2，BHQ3或DABCYL，该荧光报告基团与淬灭基团不影响荧光定量PCR的扩增，只需根据探针的荧光报告基团和淬灭基团选择所用的仪器的型号设置可检测的荧光信号范围。本发明实施例提供的荧光探针荧光报告基团:FAM、HEX、TET和FAM的激发波长为470至650nm，接收波长为500至700nm ;淬灭基团:EclipSe、TAMRA、BHQl。引物合成后的纯化方式可以为:HAP, PAGE和HPLC纯化方式。具体设计结果如表1所示:
[0043]表1本发明实施例一提供的引物和荧光探针
【权利要求】
1.一种用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的引物和荧光探针，所述引物包括正向引物和反向引物，其特征在于， 所述正向引物如序列表中SEQ ID N0.1 ； 所述反向引物如序列表中SEQ ID N0.2 ； 所述荧光探针如序列表中SEQ ID N0.3 ； 所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5’端的荧光报告基团为:FAM、HEX、TET, JOE、VIC、ROX, Cy3或Cy5，修饰所述3’端的淬灭基团为:TAMRA, Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
2.一种用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求I所述的引物和荧光探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液、核酸释放试剂、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品，其中: 所述PCR反应液包括:无菌水、具有5’ 一3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPsUOXPCRBuffer和含Mg离子的溶液； 所述核酸释放试剂由无菌水、Triton-XlOO, NP-40和Tris-HCL组成； 所述阴性质控品为不含蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因的PUC57-T载体质粒DNA; 所述阳性质控品为1.0X IO 6IUAiL含所述蓝氏贾第鞭毛虫的基因组DNA片段； 所述临界阳性质控品为1.0X IO4IUAiL含所述蓝氏贾第鞭毛虫的基因组DNA片段。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述具有5’一3’外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中所述Taq酶的终浓度为 0.Ο?υ/μ L ~0.05υ/μ L，所述 dNTPs 的终浓度为 0.2 ~0.6mM，所述 10XPCR Buffer的终浓度为I X，所述MgCl2的终浓度为1.5~5.0mM,溶剂为无菌水。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物的终浓度为0.05~0.9μΜ，所述反向引物的终浓度为0.05~0.9μΜ，所述荧光探针的终浓度为0.05~0.9 μ Μ。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放试剂中所述Triton-XlOO的终浓度为0.03~0.3%，所述ΝΡ-40的终浓度为0.04~0.4%，所述Tris-HCL的终浓度为0.01~0.1Μ，溶剂为无菌水。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCL的pH值为8.3。
9.根据权利要求3-8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品为含有所述蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因的72个碱基对的核苷酸片段的pUC57-T重组质粒DNA。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括: 工作标准品1，含有1.0X IO7IUAiL所述蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因的非传染性DNA片段； 工作标准品2，含有1.0X IO6IUAiL所述蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因的非传染性DNA片段； 工作标准品3，含有1.0X IO5I UAiL所述蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因的非传染性DNA片段；工作标准品4，含有1.0X104IU/mL所述蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因的非传染性DNA片 段。
【文档编号】C12R1/90GK103882117SQ201410043265
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年1月29日 优先权日:2014年1月29日
【发明者】罗虹, 唐景峰, 刘绪, 霍然 申请人:武汉百泰基因工程有限公司