一种丝状真菌分生孢子pcr方法
【专利摘要】本发明公开了一种丝状真菌分生孢子PCR方法，包括以下步骤：(1)将丝状真菌接种于培养基上进行培养；(2)丝状真菌培养物在培养基上长出肉眼可见分生孢子，制备分生孢子悬浮液，用于PCR扩增；(3)1～1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。本发明确定了丝状真菌分生孢子PCR扩增的有效孢子浓度为105～108CFU/ml，最适宜孢子浓度为107CFU/ml，解决了丝状真菌菌落PCR反应低稳定性和低重复性的实际应用问题，可直接应用于临床、工农业以及环境等领域丝状真菌的快速鉴定。
【专利说明】—种丝状真菌分生孢子PCR方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种丝状真菌分生孢子PCR方法。
【背景技术】
[0002]丝状真菌是真菌中一大类群，通常指菌丝体发达但不形成大型子实体的真菌，在工业、农业、医药以及基础生物学研究中具有重要的作用。建立快速科学准确的丝状真菌鉴定方法是人、动物以及植物病原菌诊断，食品加工、工业发酵、农业堆肥以及污染环境的生物修复等相关研究的基础。
[0003]菌落PCR技术因为其快速、准确而被广泛应用微生物鉴定以及微生物的DNA分析。D.Gussow和T.Clackson首先利用细菌菌落或菌斑建立了菌落PCR技术，他们利用培养的菌斑或菌落只进行简单的热处理或不经任何处理直接用于PCR反应。
[0004]真菌菌落PCR技术同样是利用培养的真菌细胞直接进行PCR反应。除酵母、白色念珠菌等单细胞真菌的菌落PCR外，前人多将菌丝体为试验材料，以经热处理或冻融交替处理使菌丝体细胞破壁释放的DNA为模版进行丝状真菌的菌落PCR反应(G.Luo et a.，2002; A.Carvalho et al., 2007; H.Mirhendi et al.，2007)。以丝状真菌菌丝体作为 PCR反应试验材料，在试验操作中存在刮取菌丝体以及定量困难等问题，导致丝状真菌菌落PCR稳定性和重复性降低，并由此限制了丝状真菌菌落PCR的广泛应用。利用丝状真菌分生孢子直接进行菌落PCR，试验操作简单方便、定量容易，可以很好地解决丝状真菌菌丝体PCR中出现的问题。
[0005]丝状真菌分生孢子PCR关键是PCR反应体系中用于扩增的分生孢子有效数量，即直接影响PCR反应稳定性和重现性的分生孢子最低数量和最高数量。有关方面仅见于镰孢菌菌落PCR反应中关于其最低检出限的简要报道(A.Lau et al.，2008)，在其他丝状真菌以及丝状真菌PCR反应体系所能允许的最高分生孢子数量方面，国内外均未见报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种丝状真菌分生孢子PCR方法。其具体技术方案为:
[0007]一种丝状真菌分生孢子PCR方法，包括以下步骤:
[0008](1)将丝状真菌接种于培养基上进行培养；
[0009](2)丝状真菌培养物在培养基上长出肉眼可见分生孢子，制备分生孢子悬浮液，用于PCR扩增；
[0010](3) 1 ~1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
[0011]进一步优选，步骤(1)中所述培养基采用PDA培养基，培养温度为28°C。
[0012]进一步优选，步骤(2)中所述分生孢子悬浮液的制备方法为，丝状真菌在培养基上长出肉眼可见分生孢子，用无菌牙签或无菌接种环收集分生孢子，将收集到的分生孢子转入含有无菌水的1.5ml的离心管中，震荡制成分生孢子悬浮液，用血球计数板计数。[0013]进一步优选，步骤(2)丝状真菌分生孢子PCR反应体系包括IxPCR缓冲液，0.2mMdNTP混合物，1μ M的上下游引物，0.4mM MgCl2,丝状真菌分生孢子有效浓度为IO5~108CFU/ml, TaqDNA聚合酶2U，无菌水补齐至50 μ 1，进行PCR反应。
[0014]进一步优选，步骤(2)中丝状真菌中黑曲霉分生孢子PCR扩增反应体系对其中分生孢子浓度要求严格，体系中黑曲霉分生孢子浓度大于108CFU/ml时，则不能扩增，其分生孢子有效浓度为IO5~108CFU/ml，最适宜浓度为107CFU/ml，此分生孢子有效浓度范围以及最适浓度适合于其它丝状菌丝分生孢子PCR反应体系对分生孢子浓度要求。
[0015]与现有技术相比，本发明的有益效果为:本发明确定了丝状真菌分生孢子PCR扩增的有效孢子浓度为1O5~108CFU/ml，最适宜孢子浓度为107CFU/ml，解决了丝状真菌菌落PCR反应低稳定性和低重复性的实际应用问题，可直接应用于临床、工农业以及环境等领域丝状真菌的快速鉴定。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为黑曲霉和黄曲霉以及青霉分生孢子特异扩增PCR电泳结果。M为DL2000DNAmarker。1-6泳道为引物ITSl和ITS4扩增产物电泳结果，其中I为黑曲霉，3，4为黄曲霉，5，6为青霉，7为阴性对照。8-13泳道为引物ITS3和ITS4扩增产物电泳结果，其中8，9为黑曲霉，10，11为黄曲霉，12，13为青霉，14为阴性对照。15-20为引物ITS2和ITS5扩增产物电泳结果，其中15为黑曲霉，17，18为黄曲霉，19-20为青霉，21为阴性对照。
[0017]图2为黑曲霉分生孢子ITS2和ITS5引物特异扩增PCR电泳结果。M为DL2000DNAmarkero 1 为 109CFU/ml，2 为 108CFU/ml，3 为 107CFU/ml，4 为 106CFU/ml，5 为105CFU/ml，6 为 104CFU/ml，7 为 103CFU/ml，8 为 102CFU/ml，9 为阴性对照。
【具体实施方式】
[0018]下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0019]1.菌落培养
[0020]将试验用丝状真菌在超净工作台上接种于PDA培养基上，28°C培养5-10天。培养物长出肉眼可见的分生孢子后，体式显微镜下用灭菌牙签或接种环收集分生孢子于装有300 μ I无菌水的带盖离心管中，震荡，制成分生孢子悬浮液，用血球计数板计数分生孢子悬浮液的孢子浓度，备用。
[0021]2.丝状真菌分生孢子PCR扩增
[0022]丝状真菌分生孢子PCR扩增采用的引物对分别为ITSl和ITS4，ITS3和ITS4，ITS2和ITS5，见表1。每对特异引物PCR特异扩增体系包括=IxPCR缓冲液，0.2mM dNTP混合物，
Iμ M的上下游引物，0.4mM MgCl2，将制备好的丝状真菌分生孢子悬浮液按比例加入反应体系，并使丝状真菌分生孢子在PCR反应体系中最终浓度为IO5~108CFU/ml，Taq DNA聚合酶2U，无菌水补齐至50 μ 1，进行PCR反应。丝状真菌分生孢子PCR反应程序为:95°C 5min预变性，95°C 45sec，52°C 45sec，72°C lmin，35个循环，然后72°C再最终延伸lOmin。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。阴性对照用去离子水代替PCR反应系统中的丝状真菌分生孢子。扩增结果表明，试验中使用的黑曲霉、黄曲霉以及青霉分生孢子均可以扩增出和三对引物相对应的DNA谱带，见图1。[0023]3.丝状真菌分生孢子PCR扩增优化
[0024]丝状真菌中黑曲霉分生孢子PCR反应对其反应体系中分生孢子浓度敏感，其有效浓度为IO5~108CFU/ml，最适浓度为107CFU/ml，见图2。
[0025]4.PCR所用弓丨物如表1所示。
[0026]表1PCR所用引物
[0027]
【权利要求】
1.一种丝状真菌分生孢子PCR方法，其特征在于， 包括以下步骤: (1)将丝状真菌接种于培养基上进行培养； (2)丝状真菌培养物在培养基上长出肉眼可见分生孢子，制备分生孢子悬浮液，用于PCR扩增； (3)1~1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
2.根据权利要求1所述的丝状真菌分生孢子PCR方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养基采用PDA培养基，培养温度为28 °C。
3.根据权利要求1所述的丝状真菌分生孢子PCR方法，其特征在于，步骤(2)中所述分生孢子悬浮液的制备方法为，丝状真菌在培养基上长出肉眼可见分生孢子，用无菌牙签或无菌接种环收集分生孢子，将收集到的分生孢子转入含有无菌水的1.5ml的离心管中，震荡制成分生孢子悬浮液，用血球计数板计数。
4.根据权利要求1所述的丝状真菌分生孢子PCR方法，其特征在于，步骤(2)丝状真菌分生孢子PCR反应体系包括IxPCR缓冲液，0.2mM dNTP混合物，I μ M的上下游引物，0.4mMMgCl2，丝状真菌分生孢子有效浓度为IO5~108CFU/ml，Taq DNA聚合酶2U，无菌水补齐至50 μ 1，进行PCR反应。
5.根据权利要求1所述的丝状真菌分生孢子PCR方法，其特征在于，步骤(2)中丝状真菌中黑曲霉分生孢子PCR扩增反应体系对其中分生孢子浓度要求严格，体系中黑曲霉分生孢子浓度大于108CFU/ml时，则不能扩增，其分生孢子有效浓度为IO5~108CFU/ml，浓度为107CFU/ml。
【文档编号】C12Q1/68GK103789439SQ201410053235
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月14日 优先权日:2014年2月14日
【发明者】杜克久, 宋歌, 崔菲, 李燕玲 申请人:河北农业大学