1，3-二羟基丙酮高产菌株及其构建方法
【专利摘要】本发明提供的1，3-二羟基丙酮高产菌株及其构建方法，所述1,3-二羟基丙酮高产菌株GOX205是以氧化葡萄糖酸杆菌ATCC621H作为宿主，选择质粒pBBR1MCS-2作为载体，通过将编码甘油脱氢酶的sldAB基因转化进入宿主并进行表达的一种菌株，其构建具体：（1）制备氧化葡萄糖酸杆菌染色体；（2）扩增sldAB基因；（3）pBBR1MCS-2质粒与sldAB基因的消化；（4）DNA片段的纯化回收；（5）载体pBBR1MCS-2片段和sldAB基因片段的连接；（6）质粒的富集与提取；（7）电转化法构建重组菌株GOX205；（8）挑选转化子；所述菌株通过过量表达编码膜系甘油脱氢酶的基因sldAB提高二羟基丙酮产量。
【专利说明】1，3- 二羟基丙酮高产菌株及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其是1，3-二羟基丙酮高产菌株及其构建方法。
【背景技术】
[0002]目前，迅速升温的生物柴油投资热使生产过程中副产的甘油出现过剩，每生产IOg生物柴油就会产生Ig甘油，因此为这些甘油寻找新的利用途径已引起全球的普遍关注，而利用甘油发酵生产1，3-二羟基丙酮则是其中的一条有效途径。
[0003]1，3-二羟基丙酮(DHA)是一种天然存在的酮糖，具有生物可降解性，且对人体和环境无毒害。DHA具有极强的防晒性，利用这一特性，国外已经成功开发出了多种保湿防晒化妆产品；在医学上已经证明DHA可以用来治疗白斑和白癜风，且具有抗肥胖功效，还可以直接作为一种抗病毒试剂，DHA的相应的衍生物还具有抗艾滋病病毒的作用；而且，DHA的衍生物也是有机合成化学中一类非常重要的中间体，其用途极其广泛。
[0004]利用甘油发酵二羟基丙酮的过程中，优良的菌种是发酵成功的前提。相对于传统的菌种选育方法，基因工程手段具有目标明确、途径清晰的优点，经过基因改造的高产菌株将更适于工业化的生产过程，可降低生产成本，继而实现经济效益的大幅度提升。目前国内针对高产二羟基丙酮生产菌株的研究多集中于菌种选育，而利用基因工程手段选育DHA高产菌株的研究还很少，经查新发现，仅华东理工大学的魏东芝等人用重组基因工程质粒PET - gdh和pET - ndh转化大肠杆菌，构建得到一株工程菌，提高了二羟基丙酮的转化率。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题在于提供1，3-二羟基丙酮高产菌株。
[0006]本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述1，3_ 二羟基丙酮高产菌株的构建方法。
[0007]为解决上述技术问题，本发明的技术方案是:
[0008]I，3_ 二羟基丙酮高产菌株G0X205，是以氧化葡萄糖酸杆菌(GluconobacterOXydans)ATCC621H作为宿主，选择质粒pBBRlMCS-2作为载体，通过将编码甘油脱氢酶的sldAB基因转化进入宿主并进行表达的一种菌株。
[0009]上述1，3_ 二羟基丙酮高产菌株的构建方法，具体步骤如下:
[0010](1)制备氧化葡萄糖酸杆菌染色体；
[0011](2)扩增 sldAB 基因;
[0012](3) pBBRlMCS-2 质粒与 sldAB 基因的消化；
[0013](4) DNA片段的纯化回收；
[0014](5)载体pBBRlMCS-2片段和sldAB基因片段的连接；
[0015](6)质粒的富集与提取；
[0016](7)电转化法构建重组菌株G0X205 ；
[0017](8)挑选转化子。[0018]上述1，3- 二羟基丙酮高产菌株的构建方法，具体步骤如下:
[0019](I)制备氧化葡萄糖酸杆菌染色体:将氧化葡萄糖酸杆菌接种到含有5ml甘露醇液体培养基的试管中，30°C条件下振荡培养10-12小时；然后将培养液转移入1.5ml离心管中，12000rpm离心30-60秒后，弃上清液，沉淀用0.5ml无菌水重悬,然后12000rpm离心30-60秒，收集菌体；加190 μ I TE悬浮沉淀，并加10μ 110%SDS，I μ 120mg/ml蛋白酶K，混匀，37°C保温 Ih ;加 30 μ 15mol/LNaCl，混匀;加 30 μ I CTAB/NaCl 溶液，混匀，65°C保温20min ;加入300 μ I酹/氯仿/异戍醇(25:24:1)抽提，5000rpm离心IOmin,将上清液移至干净离心管；加入300 μ I氯仿/异戊醇(24:1)抽提，取上清液移至干净管中；加300 μ I异丙醇,颠倒混合,室温下静止IOmin,沉淀DNA ；5000rpm离心IOmin,沉淀DNA,加入500 μ 170%乙醇，5000rpm离心lOmin，弃乙醇，自然风干；溶解于20 μ 1TE，于_20°C保存备用；
[0020](2)扩增sldAB基因:以氧化葡萄糖酸杆菌染色体作为模板，根据氧化葡萄糖酸杆菌染色体中sldAB基因序列设计引物，上引物为sldab-fw:catggatccaacgccagtttgctctg,下引物为sldab-re:catgaattccacctccgaccgtcat分别在上下引物两端添加Hind II1、EcoR I限制性内切酶酶切位点，以PCR方法扩增sldAB基因，PCR体系为50 μ 1:上下引物均为I μ I, 200Μ的dNTP4 μ I,缓冲液5 μ 1，步骤(1)所述氧化葡萄糖酸杆菌染色体模板为0.5 μ 1，双蒸水38.25 μ 1，聚合酶0.25 μ I ;PCR扩增条件为:94°C预变性4min ;94°C变性30sec ;55°C退火30sec，72°C延伸3min，得到PCR扩增产物sldAB基因；
[0021 ] (3) pBBRlMCS-2质粒与sldAB基因的消化:将扩增的sldAB基因片段4 μ I与pBBRlMCS-2质粒4 μ I分别用限制性内切酶Hind II1、EcoR I各加入0.25-0.5 μ 1，IOX酶缓冲液2μ 1，用无菌水将总体积补充到20μ 1，放于37°C条件下消化1-2小时；
[0022](4) DNA片段的纯化回收:将步骤(3)中的sldAB片段和载体pBBRlMCS-2的双酶切产物分别从琼脂糖凝胶上切下，分别利用试剂盒进行纯化回收；首先向凝胶块的管中加入2-5倍体积溶胶液，46-50°C水浴放置5-15分钟，300rpm振荡，使琼脂糖凝胶完全溶解，然后加到一个吸附柱中，13000rpm离心5分钟，倒掉收集管中的废液；加入700 μ I漂洗液，13000rpm离心5分钟后弃废液，重复该步骤；取出吸附柱，放到离心管中，加入洗脱缓冲液30 μ 1，室温放置I分钟，13000rpm离心3分钟，得到纯化后的DNA片段；
[0023](5)载体pBBRlMCS-2片段和sldAB基因片段的连接:在20 μ I连接体系中，加入2μ 110ΧΤ4连接酶缓冲液，I μ 1Τ4连接酶，载体pBBRlMCS-2片段和sldAB基因片段的加入量分别为5-7 μ I和6-8 μ 1，加水至20 μ I体系，在16°C条件下连接2-3小时后，通过酶切验证得到pBBRlMCS-2-sldAB质粒；
[0024](6)质粒的富集与提取:将经过酶切验证的连接产物转化到提前制备成感受态的大肠杆菌DH5 α中，转化子在LB-卡那霉素固体培养平板上被筛选出来，进而通过菌落PCR和双酶切实验进行验证，得到pBBRlMCS-2-sldAB质粒；利用常规方法提取质粒；
[0025](7)电转化法构建重组菌株G0X205:
[0026](a)制备电转化感受态细胞:将氧化葡萄糖酸杆菌ATCC621H接种于装有50ml电转化培养基的500ml摇瓶中，将摇瓶放于30°C，200rpm的摇床中培养至培养液在600nm的吸光度达到0.4 ;将细胞通过在4°C，6000rpm条件下离心4min进行收获，并在30ml的灭菌过的10% (v/v)甘油中重悬，细胞用冷的10% (v/v)甘油洗三次，最后重悬于2mll0% (v/v)甘油中；
[0027](b)取400μ1电转化感受态细胞用于电转化，每管感受态细胞加入
1μ lpBBRlMCS-2-sldAB质粒，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上；
[0028](c)将要转化的混合物加入预冷的Imm的电转化杯中，立即按下按钮电击，脉冲电压 2000ν ；
[0029](d)立即加800-1000 μ I甘露醇培养基到转化杯中重悬细胞；
[0030](e)将细胞转入合适的培养管中置于30°C摇床中培养3-5小时；？
[0031](f)吸取100-200 μ I的菌液涂布到甘露醇-卡那霉素固体培养基平板上，30°C条件下培养3-5天；
[0032](8)挑选转化子:挑出在甘露醇-卡那霉素固体培养基平板上上生长的单菌落，通过菌落PCR和双酶切实验进行验证得到转化子。
[0033]本发明的有益效果是:
[0034]上述I，3- 二羟基丙酮高产菌株，将氧化葡萄糖酸杆菌ATCC621H作为宿主，选择质粒pBBRlMCS-2作为载体，通过将编码甘油脱氢酶的sldAB基因转化进入宿主并进行表达，利用氧化葡萄糖酸杆菌在进行DHA发酵生产过程中，膜系甘油脱氢酶所起的关键作用，通过过量表达编码膜系甘油脱氢酶的基因sldAB提高二羟基丙酮产量，选育高甘油脱氢酶活性的菌株来提高由底物向产物的转化效率，进而达到提高1，3-二羟基丙酮产量的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1:sldAB的扩增片段电泳图；
[0036]图2:pBBRMCS-2-sldAB 质粒图谱；
[0037]图3:重组菌株G0X205与出发菌株ATCC621H生产二羟基丙酮比较图，其中，图3-1为菌株生长情况图；图3-2为菌株消耗甘油能力图；3-3为菌株DHA生成情况图。
【具体实施方式】
[0038]下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0039]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0040]实施例1
[0041]1，3_ 二羟基丙酮高产菌株G0X205，以氧化葡萄糖酸杆菌(GluconobacterOXydans)ATCC621H作为宿主，选择质粒pBBRlMCS-2作为载体，通过将编码甘油脱氢酶的sldAB基因转化进入宿主并进行表达，具体的构建方法如下:
[0042](1)制备氧化葡萄糖酸杆菌染色体:将氧化葡萄糖酸杆菌接种到含有5ml甘露醇液体培养基的试管中，30°C条件下振荡培养11小时；然后将培养液转移入1.5ml离心管中，12000rpm离心50秒后,弃上清液,沉淀用0.5ml无菌水重悬,然后12000rpm离心50秒,收集菌体；加190 μ I TE悬浮沉淀，并加10μ 110%SDS，ly 120mg/ml蛋白酶K，混匀，37°C保温 Ih ;加 30 μ 15mol/L NaCl，混匀;加 30 μ I CTAB/NaCl 溶液，混匀，65°C保温 20min ;加入300 μ I酹/氯仿/异戍醇(25:24:1)抽提,5000rpm离心IOmin,将上清液移至干净离心管；加入300 μ I氯仿/异戊醇(24:1)抽提，取上清液移至干净管中；加300 μ I异丙醇，颠倒混合，室温下静止IOmin,沉淀DNA ；5000rpm离心IOmin,沉淀DNA,加入500 μ 170%乙醇，5000rpm离心lOmin，弃乙醇，自然风干；溶解于20 μ 1TE，于_20°C保存备用；
[0043](2)扩增sldAB基因:以氧化葡萄糖酸杆菌染色体作为模板，根据氧化葡萄糖酸杆菌染色体中sldAB基因序列设计引物，上引物为sldab-fw:catggatccaacgccagtttgctctg,下引物为sldab-re:catgaattccacctccgaccgtcat分别在上下引物两端添加Hind II1、EcoR I限制性内切酶酶切位点，以PCR方法扩增sldAB基因，PCR体系为50 μ 1:上下引物均为I μ I，200Μ的dNTP4 μ I，缓冲液5 μ I，步骤(1)所述氧化葡萄糖酸杆菌染色体模板为
0.5 μ 1，双蒸水38.25 μ 1，聚合酶0.25 μ I ;PCR扩增条件为:94°C预变性4min ;94°C变性30sec ;55°C退火30sec，72°C延伸3min，得到PCR扩增产物sldAB基因，见图1 ；
[0044](3) pBBRlMCS-2质粒与sldAB基因的消化:将扩增的sldAB基因片段4 μ I与pBBRlMCS-2质粒4 μ I分别用限制性内切酶Hind IILEcoR I各加入0.4 μ 1，IOX酶缓冲液
2μ 1，用无菌水将总体积补充到20 μ 1，放于37°C条件下消化1.5小时；
[0045](4) DNA片段的纯化回收:将步骤(3)中的sldAB片段和载体pBBRlMCS-2的双酶切产物分别从琼脂糖凝胶上切下，分别利用试剂盒进行纯化回收；首先向凝胶块的管中加入2-5倍体积溶胶液，46-50°C水浴放置10分钟，300rpm振荡，使琼脂糖凝胶完全溶解，然后加到一个吸附柱中，13000rpm离心5分钟，倒掉收集管中的废液；加入700 μ I漂洗液，13000rpm离心5分钟后弃废液，重复该步骤；取出吸附柱，放到离心管中，加入洗脱缓冲液30 μ 1，室温放置I分钟，13000rpm离心3分钟，得到纯化后的DNA片段；
[0046](5)载体pBBRlMCS-2片段和sldAB基因片段的连接:在20 μ I连接体系中，加入2μ 110ΧΤ4连接酶缓冲液，I μ 1Τ4连接酶，载体pBBRlMCS-2片段和sldAB基因片段的加入量分别为6μ I和7μ 1，加水至20 μ I体系，在16 °C条件下连接3小时后，通过酶切验证得到 pBBRlMCS-2-sldAB 质粒，见图 2 ；
[0047](6)质粒的富集与提取:将经过酶切验证的连接产物转化到提前制备成感受态的大肠杆菌DH5a中，转化子在LB-卡那霉素固体培养平板(将LB-卡那霉素固体培养基倾倒于平皿上)上被筛选出来，进而通过菌落PCR和双酶切实验进行验证，得到pBBRlMCS-2-sldAB质粒；利用常规方法提取质粒；
[0048](7)电转化法构建重组菌株G0X205:
[0049](a)制备电转化感受态细胞:将氧化葡萄糖酸杆菌ATCC621H接种于在装有50ml电转化培养基的500ml摇瓶中，将摇瓶放于30°C，200rpm的摇床中培养至培养液在600nm的吸光度达到0.4 ;将细胞通过在4°C，6000rpm条件下离心4min进行收获，并在30ml的灭菌过的10% (v/v)甘油中重悬，细胞用冷的10% (v/v)甘油洗三次，最后重悬于2mll0% (v/v)甘油中；
[0050](b)取400μ1电转化感受态细胞用于电转化，每管感受态细胞加入I μ lpBBRlMCS-2-sldAB质粒，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上；
[0051](c)将要转化的混合物加入预冷的Imm的电转化杯中，立即按下按纽电击，脉冲电压 2000ν ；
[0052]Cd)立即加1000 μ I甘露醇培养基到转化杯中重悬细胞；
[0053](e)将细胞转入合适的培养管中置于30°C摇床中培养4小时；？
[0054](f)吸取150 μ I的菌液涂布到甘露醇-卡那霉素固体培养基平板上，30°C条件下培养4天；
[0055](8)挑选转化子:挑出在甘露醇-卡那霉素固体培养基平板上上生长的单菌落，通过菌落PCR和双酶切实验进行验证得到转化子。
[0056]实施例2
[0057]本发明中构建的过量表达膜系甘油脱氢酶的重组菌株G0X205的发酵情况:将重组菌株G0X205在甘露醇固体培养基平板上划线活化2-3次，接种1-3环到甘油初始浓度为20g/l的液体种子培养基中，300C，200rpm摇床中培养12_15h，以5%的接种量接入发酵培养基中，发酵培养基中甘油初始浓度为100g/L，发酵温度28-32°C，发酵时间52小时，跟踪测定发酵过程中发酵液吸光度变化与甘油消耗及DHA生成情况。同时将出发菌株ATCC621H做平行对照。如图3-1、3-2、3-3所示，实验结果表明:在100g/L的甘油发酵液中，G0X205的生长状况良好，DHA浓度达到94.lg/L，较之于ATCC621H提高了 19.7%，甘油残量较之于ATCC621H 降低了 15.lg/L。
[0058]上述实施例中所用培养基为常规方法制备而得，具体组分如下:
[0059]1.甘露醇液体培养基(g/L):酵母抽提物5.0，蛋白胨3.0，甘露醇25.0 ；
[0060]甘露醇固体培养基:在上述甘露醇液体培养基中加入1.5% (w/v)琼脂粉；
[0061]甘露醇-卡那霉素固体培养基:上述甘露醇固体培养基经高温灭菌并冷却至室温后加入卡那霉素至终浓度为50 μ g/ml,混匀后倒入灭菌培养皿中。
[0062]2.LB-卡那霉素固体培养基:LB固体培养基经高温灭菌并冷却至室温后加入卡那霉素至终浓度为50 μ g/ml，混匀后倒入灭菌培养皿中；所述LB固体培养基指在LB液体培养基中加入1.5% (w/v)琼脂粉，其中，LB液体培养基(g/L):胰蛋白胨10，酵母抽提物5，NaCl10，ρΗ7.5。
[0063]3.电转化培养基(g/L):甘露醇80，酵母抽提物15，MgSO4.7Η202.5，甘油0.5，CaCl2L 5 ；
[0064]4.种子培养基(g/L):甘油 10，酵母抽提物 20，KH2P041, MgS04.7H200.5。
[0065]5.发酵培养基(g/L):甘油100，酵母抽提物5，CaC037。
[0066]上述参照具体 实施方式对该1，3_ 二羟基丙酮高产菌株及其构建方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.1, 3-二羟基丙酮高产菌株G0X205，其特征在于:是以氧化葡萄糖酸杆菌ATCC621H作为宿主，选择质粒pBBRlMCS-2作为载体，通过将编码甘油脱氢酶的sldAB基因转化进入宿主并进行表达的一种菌株。
2.权利要求1所述的1，3-二羟基丙酮高产菌株的构建方法，其特征在于:具体步骤如下: (1)制备氧化葡萄糖酸杆菌染色体； (2)扩增sldAB基因； (3)pBBRlMCS-2质粒与sldAB基因的消化； (4)DNA片段的纯化回收； (5)载体pBBRlMCS-2片段和sldAB基因片段的连接； (6)质粒的富集与提取； (7)电转化法构建重组菌株G0X205； (8)挑选转化子。
3.根据权利要求2所述的1，3-二羟基丙酮高产菌株的构建方法，其特征在于:具体步骤如下: (1)制备氧化葡萄糖酸杆菌染色体:将氧化葡萄糖酸杆菌接种到含有5ml甘露醇液体培养基的试管中，30°C条件下振荡培养10-12小时；然后将培养液转移入1.5ml离心管中，.12000rpm离心30-60秒后，弃上清液,沉淀用0.5ml无菌水重悬,然后12000rpm离心30-60秒，收集菌体;加19011 I TE悬浮沉淀，并加10μ 110%SDS，ly 120mg/ml蛋白酶K，混匀，37°C保温 Ih ;加 30 μ 15mol/LNaCl，混匀;加 30 μ I CTAB/NaCl 溶液，混匀，65°C保温 20min ;加Λ 300 μ I体积比25:24:1的酚/氯仿/异戊醇抽提，5000rpm离心lOmin，将上清液移至干净离心管；加入300 μ I体积比24:1的氯仿/异戊醇抽提，取上清液移至干净管中；加.300 μ I异丙醇,颠倒混合,室温下静止IOmin,沉淀DNA ;5000rpm离心IOmin,沉淀DNA,加入.500 μ 170%乙醇，5000rpm离心lOmin，弃乙醇，自然风干；溶解于20 μ I TE,于_20°C保存备用； (2)扩增sldAB基因:以氧化葡萄糖酸杆菌染色体作为模板，根据氧化葡萄糖酸杆菌染色体中sldAB基因序列设计引物，上引物为sldab-fw:catggatccaacgccagtttgctctg,下引物为sldab-re:catgaattccacctccgaccgtcat分别在上下引物两端添加Hind II1、EcoR I限制性内切酶酶切位点，以PCR方法扩增sldAB基因，PCR体系为50 μ 1:上下引物均为I μ I, 200Μ的dNTP4 μ I,缓冲液5 μ 1，步骤(1)所述氧化葡萄糖酸杆菌染色体模板为.0.5 μ 1，双蒸水38.25 μ 1，聚合酶0.25 μ I ;PCR扩增条件为:94°C预变性4min ;94°C变性.30sec ;55°C退火30sec，72°C延伸3min，得到PCR扩增产物sldAB基因； (3)pBBRlMCS-2质粒与sldAB基因的消化:将扩增的sldAB基因片段4 μ I与pBBRlMCS-2质粒4 μ I分别用限制性内切酶Hind II1、EcoR I各加入0.25-0.5 μ 1，IOX酶缓冲液2 μ 1，用无菌水将总体积补充到20 μ 1，放于37°C条件下消化1-2小时； (4)DNA片段的纯化回收:将步骤(3)中的sldAB片段和载体pBBRlMCS-2的双酶切产物分别从琼脂糖凝胶上切下，分别利用试剂盒进行纯化回收；首先向凝胶块的管中加入.2-5倍体积溶胶液，46-50°C水浴放置5-15分钟，300rpm振荡，使琼脂糖凝胶完全溶解，然后加到一个吸附柱中，13000rpm离心5分钟，倒掉收集管中的废液；加入700 μ I漂洗液，.13000rpm离心5分钟后弃废液，重复该步骤；取出吸附柱，放到离心管中，加入洗脱缓冲液.30 μ 1，室温放置I分钟，13000rpm离心3分钟，得到纯化后的DNA片段； (5)载体pBBRlMCS-2片段和sldAB基因片段的连接:在20μ I连接体系中，加入.2μ 110ΧΤ4连接酶缓冲液，I μ 1Τ4连接酶，载体pBBRlMCS-2片段和sldAB基因片段的加入量分别为5-7 μ I和6-8 μ 1，加水至20 μ I体系，在16°C条件下连接2-3小时后，通过酶切验证得到pBBRlMCS-2-sldAB质粒； (6)质粒的富集与提取:将经过酶切验证的连接产物转化到提前制备成感受态的大肠杆菌DH5 α中，转化子在LB-卡那霉素固体培养平板上被筛选出来，进而通过菌落PCR和双酶切实验进行验证，得到pBBRlMCS-2-sldAB质粒；利用常规方法提取质粒； (7)电转化法构建重组菌株G0X205: Ca)制备电转化感受态细胞:将氧化葡萄糖酸杆菌ATCC621H接种于装有50ml电转化培养基的500ml摇瓶中，将摇瓶放于30°C，200rpm的摇床中培养至培养液在600nm的吸光度达到0.4 ;将细胞通过在4°C, 6000rpm条件下离心4min进行收获,并在30ml的灭菌过的.10% (v/v)甘油中重悬，细胞用冷的10% (v/v)甘油洗三次，最后重悬于2mll0% (v/v)甘油中； (b)取400μ?电转化感受态细胞用于电转化，每管感受态细胞加入I μ lpBBRlMCS-2-sldAB质粒，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上； (c)将要转化的混合物加入预冷的Imm的电转化杯中，立即按下按钮电击，脉冲电压.2000ν ； Cd)立即加800-1000 μ I甘露醇培养基到转化杯中重悬细胞； Ce)将细胞转入合适的培养管中置于30°C摇床中培养3-5小时； Cf)吸取100-200 μ I的菌 液涂布到甘露醇-卡那霉素固体培养基平板上，30°C条件下培养3-5天； (8)挑选转化子:挑出在甘露醇-卡那霉素固体培养基平板上上生长的单菌落，通过菌落PCR和双酶切实验进行验证得到转化子。
【文档编号】C12N1/21GK103789250SQ201410056346
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】许晓菁, 何雨晴, 夏博勋, 赵琼 申请人:天津实发中科百奥工业生物技术有限公司