东北自然发酵酸菜中细菌多样性的dgge分析方法
【专利摘要】一种东北自然发酵酸菜中细菌多样性的DGGE分析方法，主要解决传统方法不能全面、准确的反映酸菜内的种群结构、细菌多样性的问题，方法：1、酸菜样品的预处理；2、提取酸菜样品中微生物的总DNA；3、以提取的微生物的总DNA为模板，进行16SrRNA的PCR扩增；4、将PCR产物在进行DGGE电泳分析，电泳结束后染色、扫描仪成像，在PCR-DGGE图谱上标记特异性条带，切胶回收，最后在NCBI数据库进行Blast比对，获得微生物信息。即完成东北自然发酵酸菜中细菌多样性的DGGE分析方法，用于分析酸菜内细菌的多样性。
【专利说明】东北自然发酵酸菜中细菌多样性的DGGE分析方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种自然发酵酸菜内细菌多样性的分析方法【背景技术】
[0002]酸菜是将新鲜白菜用盐水在密闭容器中泡制一段时间后形成的发酵蔬菜制品，自然发酵的酸菜赋予了其独特的风味，这种独特的发酵方式决定了其中微生物区系的多样性，在酸菜发酵过程中会产生多种细菌，这些细菌分别在酸菜发酵的不同时期控制酸菜的发酵作用，使酸菜产生独特的风味。
[0003]人们对酸菜内复杂的细菌种群的研究，多采用传统的分离、纯化和鉴定方法，不仅繁杂耗时，而且受培养条件和主观因素影响较大，不能反映出酸菜内细菌的多样性的真实情况，结果准确性及可靠性差，因此，传统的培养方法不能全面客观地反映酸菜内细菌的种群结构、细菌多样性等信息。
[0004]DGGE(denatured gradient gel electrophoresis)变性梯度凝胶电泳最初是Fisher和Lerman等人 于20世纪80年代初期发明的主要用来检测DNA片段中的点突变，后来该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。原理是双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂(尿素和甲酰胺)梯度或是温度梯度，不同序列的DNA片段在各自相应的变性剂浓度下解链，发生空间结构的变化，导致电泳速度急剧下降，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
【发明内容】
[0005]本发明东北自然发酵酸菜中细菌多样性的DGGE分析方法，按以下步骤进行:
[0006]1、酸菜样品的预处理及菌体收集。
[0007]2、采用FastPrep结合CTAB法进行酸菜样品中微生物的总DNA的快速提取。
[0008]3、以提取微生物的总DNA为模板，采用16S rRNA基因V3区具有特异性的引物对，进行细菌16S rRNA的PCR扩增，将PCR反应的产物用8% (质量/体积)琼脂糖凝胶电泳检测。
[0009]4、将PCR产物按照如下条件进行DGGE电泳分析:选择变性剂浓度梯度为35%~55%，现将电泳缓冲液预热至60°C，以150V电压预电泳lOmin，然后向每个加样孔加入15 μ I的PCR产物，在150V电压下，电泳7h。
[0010]5、电泳结束后对DGGE产物进行染色、扫描仪成像，得到DGGE图谱。经过胶图分析，在酸菜样品细菌DGGE图谱上标记特异性条带，切胶回收。
[0011]6、回收的DNA条带需重新进行PCR扩增，然后对产物进行测序，将测得的序列在NCBI数据库进行Blast比对，确定细菌的归属，即完成东北自然发酵酸菜中细菌多样性的DGGE分析方法。
[0012]本发明的积极效果:
[0013]本方法能全面准确的反映酸菜内细菌的种群结构、细菌多样性，与纯培养方法相t匕，该方法具有操作简便、快速、重复性好等优势，在快速的同时还能对比分析大量样品，因此它可以对比分析同一种酸菜不同发酵阶段的细菌群落差异，也可以研究不同自然发酵酸菜的细菌群落差异。采用DGGE分析可以检测到菌群中相对含量1%以上的菌，并可对微生物图谱进行分析。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为酸菜发酵液样品PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。
[0015]图2为酸菜发酵液样品细菌总DNA的PCR-DGGE图谱。
【具体实施方式】
[0016]为了更好地理解本发明，下面具体讲述本发明的具体实施步骤:
[0017]1.酸菜发酵液样品的预处理:
[0018]样品为东北地区任意采集的自然酸菜样品，样品多点取自酸菜发酵汁液，混合后在5mL酸菜发酵液样品中加入5mL PBS缓冲液，涡旋震荡30s，然后350rpm离心5min，收集上清，12000rpm离心5min后，弃上清，收集菌体，在沉淀中加入800 μ L TE缓冲液回溶，用于微生物总DNA的提取。
[0019]2.酸菜发酵液中微生物总DNA的提取
[0020]采用Fast Prep (快速核酸提取仪)结合CTAB法进行微生物总DNA的快速提取。具体步骤如下:
[0021]⑴取预处理的步骤I中所述样品于2mL破碎管中，加入0.5g玻璃珠，置于FastPr印核酸快速提取仪中，5.5m.s_l振荡45s，快速裂解样品。
[0022]⑵裂解:加入10% (质量/体积)SDS裂解液60 μ 1，混匀后12000rpm离心10min，转移至1.5ml无菌离心管中，加入100 μ 15mol/l的Nacl,80ull0mol/1的CTAB, 65°C水浴20mino
[0023]⑶抽提:加入1ml的酚:氯仿:异戊醇=25:24:1 (体积比)，轻柔混匀，静置lmin，12000rpm离心10min，取上清液再次进行抽提，加入1ml的氯仿:异戊醇=24:1 (体积比)，12000rpm离心10min,取上清液至无菌的1.5ml离心管中。
[0024]⑷沉淀:加500 μ I冰异丙醇，50 μ 13mol/L的NaAC，颠倒，静置，混匀，_20°C放置30min,沉淀菌体，12000rpm 离心 lOmin。
[0025] (5)漂洗和风干:弃上清液，加500 μ 170% (体积比)无水乙醇洗涤沉淀，轻轻混匀，12000rpm离心10min，弃上清，置于无菌操作台中用垂直风吹干，加30 μ ITE溶解沉淀，-20°C保存备用。
[0026]3.PCR 扩增
[0027]取1.5μ I提取的的总DNA为模板，采用16S rRNA基因V3区具有特异性的引物对进行 16S rRNA 的 PCR 扩增。引物序列为 V3F+GC: (5，-CGCCC GCCGCGCGCG GCGGG CGGGGCGGGGGC CCTACGG GAGGC AGCAG-3，)和 V3R: (5，-ATTACC GCG GCT GCT GG-3，)。[0028]扩增反应体系为50 μ 1，由下列成分组成:
【权利要求】
1.一种东北自然发酵酸菜中细菌多样性的DGGE分析方法，其特征在于该方法按以下步骤进行: (1)、选择酸菜样品，对样品进行预处理及菌体收集； (2)、采用FastPrep结合CTAB法进行酸菜样品中微生物总DNA的快速提取； (3)、以提取的微生物的总DNA为模板，采用16SrRNA基因V3区具有特异性的引物对.进行细菌16S rRNA的PCR扩增，将PCR反应的产物用琼脂糖凝胶电泳检测； (4)、将PCR产物进行DGGE电泳分析； (5)、电泳结束后对DGGE产物 进行染色、扫描仪成像，得到DGGE图谱， 在酸菜样品细菌DGGE图谱上标记特异性条带，切胶回收； (6)、回收的DNA条带需重新进行PCR扩增，然后对产物进行测序，将测得的序列结果在NCBI数据库进行Blast同源性对比分析，确定细菌的归属，即完成东北自然发酵酸菜中细菌多样性的DGGE分析方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤(1)中，样品为东北地区任意采集的自然酸菜样品，样品多点取自酸菜发酵汁液，混合后进行预处理。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤(1)中，对采集的酸菜样品进行预处理，收集菌体，具体步骤如下:在5mL酸菜发酵液样品中加入5mL PBS缓冲液，涡旋震荡30s，然后350rpm离心5min,收集上清，12000rpm离心5min后,弃上清,收集菌体,在沉淀中加入800μL TE缓冲液回溶，用于微生物总DNA的提取。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤(2)中，采用FastPrep快速核酸提取仪结合CTAB法进行酸菜样品中微生物总DNA的快速提取，具体步骤如下: ①取预处理的步骤(1)中所述样品于2mL破碎管中，加入0.5g玻璃珠,置于Fast Prep核酸快速提取仪中，5.5m.s-1振荡45s，快速裂解样品； ②裂解:加入10%(质量/体积)SDS裂解液60μ1，混匀后12000rpm离心10min，转移至`1.5ml 无菌离心管中，加入 100 μ I 5mol/l 的 Nacl, 80ull0mol/l 的 CTAB, 65°C水浴 `20min; ③抽提:加入1ml的酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，轻柔混匀，静置lmin，12000rpm离心`lOmin，取上清液再次进行抽提，加入1ml的氯仿:异戊醇=24:1，12000rpm离心10min，取上清液至无菌的1.5ml离心管中； ④沉淀:加500μI冰异丙醇，50μ I 3mol/L的NaAC，颠倒，静置，混匀，-20°C放置30min,沉淀菌体，12000rpm 离心 IOmin; ⑤漂洗和风干:弃上清液，加500μ 170% (积极比)无水乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心`lOmin，弃上清，置于无菌操作台中用垂直风吹干，加30 μ ITE溶解沉淀，_20°C保存备用。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中步骤三中PCR扩增的反应体系为`50 μ I的反应体系，由下列成分组成:
6.根据权利要求1所述的 方法，其特征在于其中步骤四中电泳仪器为Dcode的基因突变检测系统，电泳条件为电压150V，60°C下电泳7h，变性梯度为35%~55%。
【文档编号】C12Q1/68GK103952468SQ201410059200
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年2月21日 优先权日:2014年2月21日
【发明者】乌日娜, 武俊瑞, 于美玲, 岳喜庆 申请人:沈阳农业大学