一种新型t载体及其应用方法
【专利摘要】将待克隆的DNA片段成功插入载体DNA，是筛选目标克隆，进而测定基因序列、分析基因结构与功能、进行基因重组表达等研究工作的首要步骤。本发明的新型载体pHsh-T具有以下特征：（1）同时具有T载体易于克隆和pHsh载体高效表达的功能；（2）具有双向基因表达元件，使正、反向连接的外源基因都得到有效表达，可用于基因文库的构建和活性筛选；（3）质粒分子小，是基因容量大、转化率高、易于进行原位基因改造的表达型T载体。用本发明的载体进行PCR产物的克隆、基因文库的构建和筛选，以及基因的超量表达，可以简化操作步骤、节约材料和时间；提高试验的准确性和成功率；加快研究进程以期获得更多科技成果。
【专利说明】一种新型T载体及其应用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及分子生物技术、微生物工程、基因工程等【技术领域】中的一种新型T载体，更涉及一种高效转化、双向表达型T载体的结构、性质及应用技术。
【背景技术】
[0002]将待克隆的DNA片段成功插入载体DNA，是筛选目标克隆进而测定基因序列、分析基因结构与功能、进行基因重组表达等研究工作的首要步骤。发展能够与DNA片段高效连接和闻效转化的新型载体有利于简化基因操作步骤、节省材料和时间；提闻基因克隆的准确性和成功率；加快研究进展、获得更多科技成果。
[0003]DNA的末端状态和首尾匹配状况对插入片段与载体之间的连接率的影响很大。粘性末端连接要比平末端连接的效率高，人们通常选用限制性DNA内切酶对片段和载体进行切割，产生带粘性末端的插入片段和线性化载体以便连接。但是，由于这些DNA首尾粘性末端的序列互补，易发生插入片段的自相连接，以及线性载体自身的首尾连接，从而降低了连接效率。TA克隆技术采用另一种方式进行粘性末端连接:Taq DNA聚合酶扩增产生的PCR产物的双链两端各带有I个3’端悬挂的A(腺苷酸)，能够与末端带有T (胸腺核苷酸)的载体进行连接(Holto et al., 1991, Nucleic Acids Res，19:1156)。因为 TA 克隆中每一段线性DNA的两端序列不能相互配对，从而有效地避免了目标基因片段之间的相互连接或载体的自身环化。
[0004]TA克隆技术已经广泛应用于PCR产物的克隆，其原理是TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能够在双链DNA的3’末端加上I个核苷酸。用Taq DNA聚合酶扩增得到的PCR产物的末端通常被`加上I个A ;为了与之互补，人们用限制性内切酶如EcoRV切割载体质粒产生平末端，再用TaqDNA聚合酶在线性质粒两端添加T，所制成的两端带有3’端悬挂T的、用于TA克隆的载体被称为T载体。
[0005]目前市场上销售的T载体的应用效果不够稳定，因为T核苷酸并非TaqDNA聚合酶优先聚合的核苷酸，仅部分载体的3’端能添加上T，并且有些末端可能被加上过多的T。市售T载体的另一个欠缺是基因表达功能较弱，PCR产物克隆成功后，还需要用限制性内切酶切下目的片段，亚克隆到经同样酶切处理的表达载体中，才能进行基因的超量表达研究。因此通常T载体只能作为中间载体，后续还要进行一系列繁琐的操作。
[0006]钟星等最近发表了关于构建一种用于基因克隆和表达的定向T载体pETG的研究论文(钟星等，2012，生物工程学报，29:510-519)。本文中作者对TA克隆技术作了三方面的改进:⑴通过限制性内切酶Bfu I切割产生T载体，保证载体末端序列正确；(2)以表达载体pET-23a为基础，可用于基因的表达；(3)弓丨入IacO序列鉴定PCR扩增的目标基因的正反向连接。该论文在构建自制的可用于基因表达的T载体方面，以及TA克隆的定向选择方面为基因工程工作者提供了有效的方法。但是，由于PET系统的表达载体本身的性质问题，所产生的T载体pETG在应用中表现有以下不足之处:(1)必须添加昂贵的化学诱导剂IPTG诱导基因的表达；(2)被诱导表达的许多外源基因易产生包涵体或细胞毒性，从而限制基因产物的活性或抑制转化子生长；(3)因为IacO的部分序列必须合成在引物上，定向筛选仅适用于PCR产物的克隆；(4)pET质粒分子较大，转化率相应较低，并且因基因反向插入，约有50%的转化子中的基因不能表达。
[0007]大肠杆菌表达载体pHsh是本研究组发明的热激诱导型高效表达系统，2010年获得美国发明专利授权(US7，807，460B2)，相关技术在国内已经有论文综述(蒋钰瑶等，2012，微生物学通报，39:394-400)。热激载体pHsh与国际通用的pET等表达系统相比具有以下独特的优势:(I)避免添加化学诱导剂，降低成本减少污染；(2)通过激活分子伴侣的表达提高细胞生长密度和目标蛋白的可溶性；(3)pHsh是最小型的表达载体，容量大、转化率高，并且有利于对目标基因进行原位定点诱变或定向进化。但是，pHsh系统的质粒中还没有用于TA克隆的T载体，迄今还需要通过多克隆位点将外源基因克隆到pHsh载体中进行基因表达。这种方式不仅使工作繁琐，而且常常受限制性内切酶的匹配性的限制。本发明利用表达载体PHsh的优势，设计并构建一种兼有克隆、表达和目标基因活性筛选功能的高效T载体，pHsh-T。
【发明内容】
[0008]1.发明目的
[0009]利用pHsh系统的表达载体的优点，构建一种具有以下特征的新型T载体:(I)同时具有T载体易于克隆和pHsh系统的高效表达的功能；(2)质粒分子小，具有基因容量大、转化率高等特点，可提高基因的转化效率；(3)具有双向基因表达元件，使正、反向连接的外源基因都得到表达，适用于基因文库的构建和基因产物的活性筛选。
[0010]2.本发明的具体描述
[0011]本发明载体的设计方案:
[0012]表达载体pHsh-Cm是环状质粒，不具有T载体功能。为了达到本发明的目的，我们设计新型T载体的前体质粒。前体质粒中保留了 pHsh-Cm中的氯霉素抗性基因和Hsh启动子(Hsh pro)表达元件；修改了质粒复制元件中的I个限制性内切酶Bfu I识别位点中的碱基；切除了多克隆位点；插入了 I个与Hsh启动子方向相反、由Sigma70识别的持家基因启动子(Hkg pro)和相应的转录终止子；并且在两个双向的启动子之间加入两个背向的Bfu I识别位点。前体质粒为环状，转化大肠杆菌后在细胞中可以得到大量复制；用Bfu I酶对前体质粒进行切割后，即可获得本发明的T载体(图1)。
[0013]实现本发明的操作技术:
[0014](I)选择合适的目标载体和限制性内切酶。
[0015]首先，选择合适的目标载体进行改造，本发明选择的是本研究组构建的新型大肠杆菌高效表达载体pHsh-Cm(GenBank登录号:FJ571620)。再选择合适的限制性内切酶，所选择的限制性内切酶位点在载体上应该尽可能的稀有，更重要的是酶切以后要在线性化载体的两端各留下I个3’端悬挂的碱基T。限制性内切酶Bfu I的识别和切割位点如图3-a所示。其中，“N”为A、T、C或G任意碱基。将酶切位点的碱基设计成如图3-b所示序列,切割后可以产生3’端悬挂T的末端。因为Bfu I的识别和切割位点是非对称性的，因此，正负链上各设置一个Bfu I位点就可以产生带有两个T末端的线性化载体。[0016]
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[0026](2)突变目标载体。
[0027]对选定的目标载体进行定点诱变，消除目标载体上的Bfu I酶切位点。这里及以下涉及的限制性内切酶及DNA修饰酶的使用、基因克隆、大肠杆菌转化等相关操作的具体方法均按《分子克隆手册》第三版上的标准方法进行(Sambrook and Russell, 2001, CSHLPress, Cold Spring Harbor, New York)。
`[0028](3)切除多克隆位点和引入反向启动子等。
[0029]利用反向PCR在诱变完成后的载体的NcoI和Xho I之间引入反向启动目的基因表达的启动子Hkg pro ;通过反向PCR在Hsh pro和Hkg pro之间引入2个Bfu I酶切位点，从而形成如下结构:Hsh pro-Bfu 1-Bfu 1-Hkg pro ;再通过反向PCR引入反向的转录终止子(Hkg term),从而获得pHsh-T的前体质粒。
[0030](4)制备新型双向启动表达的T载体。
[0031]将上述前体质粒导入大肠杆菌细胞,培养细胞后从中提取纯化pHsh-T的前体质粒；用Bfu I切割前体质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收的2，280bp线性化DNA片段，即为具有双向基因表达元件、3’末端带T的载体；这种新型T载体被命名为pHsh-T (图1)。新型双向启动表达的T载体中的抗药基因可以通过环状质粒扩增法更换(实施例6)。
[0032]本发明可取得的有益效果:
[0033]本发明产生的新型载体pHsh-T在使用方法、作用功能和应用效果等方面优于一股pHsh载体、商业化T载体或最近报道的T载体。pHsh-T是一个多功能载体，不仅能用于克隆测序，还能直接进行基因高效表达；更重要的是它不仅适用于PCR产物的克隆表达，而且是一个构建基因文库和进行目标基因活性筛选的高效载体。本发明的主要有益效果总结如下:
[0034]1.最新发展的pHsh系统的载体具有表达水平高和不需要化学诱导等特点，但是PHsh系统中还没有应用于TA克隆的T载体，目标基因的克隆还有赖于多克隆位点的限制性内切酶识别序列，不仅工作繁琐，而且受到酶切位点的匹配性限制；pHsh-T成为该系统的第一个T载体，为基因在该系统中的克隆表达提供了方便。
[0035]2.市场上销售的T载体是PCR克隆载体，基因表达功能较弱，经过克隆和序列测定的基因还需要亚克隆到其他表达型的载体如pET、pHsh系统中，才能获得基因产物的高水平表达，而pHsh-T仅需I次TA克隆就可以获得基因产物的有效表达，表达水平低的基因经定向改造的序列有机会达到超量表达。[0036]3.最新报道的T载体pETG可用于基因的克隆和IPTG诱导的高效表达，但是在化学品IPTG存在时许多克隆的生长受抑制或产生包涵体；pHsh-T中的基因表达不需要化学品诱导，并且外源基因的表达受到分子伴侣的保护，可以使在PET系统中难克隆或难表达的基因得到研究。
[0037]4.本发明的pHsh-T作为分子量最小的带双向表达元件的表达型T载体，其特点是转化率高、正反向插入的转化子都能有效表达。因此，它不仅是一个PCR产物的高效克隆和表达载体，而且是构建基因文库和目标基因活性筛选的高效载体(具体方法参见实施例5)。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1.新型T载体pHsh-T的结构图。BfuI酶切后构建完成的T载体DNA序列:7-76bp 为 Hkg-pro ； 115_136bp 为 Hsh-term ;581_1，231bp 为 CmR ; 1，391-2，006bp 为 ColEl ；
2,175-2，206bp 为 Hkg-term ；2, 212-2，246bp 为 Hsh-pro。
[0039]图2.还原力感应蛋白(RSP)基因通过TA克隆正向或反向插入pHsh-T后基因表达产物的SDS-PAGE分析。图中M为蛋白质标样；1，未加入RSP基因的载体；2_4，外源基因正向插入的3个克隆，RSP基因由Hsh pro启动表达；5_7，外源基因反向插入的3个克隆，RSP基因由Hkg pro启动表达。箭头所指的蛋白质条带是重组蛋白RSP。
图3.Bfu I酶切位点。(a)BfuI酶通用识别位点和切割位点。(b)在切割位点处设计加入T-A碱基对，以产生粘性“T”末端。
【具体实施方式】:
[0040]本发明中所用术语，除非有另外说明，一股具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面的方法结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应该理解，实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0041]实施例中涉及的限制性内切酶及DNA修饰酶的使用、基因克隆、大肠杆菌转化等相关操作的一股方法均按《分子克隆手册》第三版上的标准方法进行的(Sambrook andRussell,2001, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York)。
[0042]实施例1.本发明的T载体的制备
[0043]材料与方法:
[0044]大肠杆菌(E.coli)菌株BL21(DE3)和DH10B用作基因克隆和表达宿主；感受态细胞购自Promrga(USA)。所用质粒pHsh的来源或制备参见(Wu et al.,2010, BiotechnolLett, 32:795-801)。质粒中限制性内切酶Bfu I酶切位点的设计参照钟星等采用的方法(钟星等，2012，生物工程学报，29:510-519)。基因转化采用电穿孔系统(Bio-rad GenePulser Xcell ?)并按其操作要求进行大肠杆菌的电转化。大肠杆菌转化子在LB培养基中培养(30-37 °C )。
[0045]限制性内切酶Bfu I购自Fermentas公司；T4DNA连接酶、PrimeSTAR? HS DNA聚合酶、DNA分子量Marker购自大连Takara生物公司；DNA片段割胶回收试剂盒购自Qiagen公司。PCR反应和DNA片段连接反应均按照相应说明书操作。基因序列的测定由上海生工生物工程公司完成。[0046]定点诱变、短序列切除或插入都用反向PCR技术完成:设计一对与质粒上拟改造的位点两端序列互补、方向相背的引物，在引物的5’端加上拟插入序列、减去拟删除序列或修改拟突变序列；以环状质粒为模板，用高度保真性且产生平末端的DNA聚合酶如Pyrobest或PrimeSTAR? HS等DNA聚合酶(大连Takara生物公司)进行DNA扩增；以T4多聚核苷酸激酶将PCR产物的5’端磷酸化以后，再用T4DNA连接酶将其环化，获得序列改造的质粒。
[0047]实验步骤:
[0048](I)消除目标载体上的Bfu I酶切位点:对pHsh-Cm进行定点诱变的位点为GTATCCGGTA AG;反向 PCR 引物 1:5’-CGGTA AGCGG CAGGG TCG-3’；引物 2:5’-TTTAC CTGTC CGCCTTTCTC C-3，。
[0049](2)切除多克隆位点和引入反向启动子:利用反向PCR在诱变完成后的载体的NcoI和Xho I之间引入反向启动目的基因表达的启动子Hkg pro ;根据Sigma70识别的启动子的保守序列设计和人工合成的Hkg pro的序列是ACGAC TTGAC ACCAA CTCTT CCTTTTGATA TAATT GGAAA AGTCG。反向 PCR 引物设计为引物 3:5’ -TCCAA TTATA TCAAA AGGAAGAGTT GGTGT CAAGT CGTCT CGAGC ACCAC CACCA C-3，；引物4:5，-MAGT CGATT TTACT TATCAATGCG AAGGA GGTGT GAGCC ATGGG TATAT CTCCT TCT-3’。
[0050](3)引入Bfu I酶切位点:通过反向PCR在启动子Hsh pro和Hkg pro之间引入2个Bfu I酶切位点，从而形成Hsh pro-Bfu 1-Bfu 1-Hkg pro序列；所用引物为引物5:5，-CGCGT ATCCT CTAGA CTCAC ACCTC CTTCG CATT-3，；引物 6:5，-CGCGT ATCCG AAGAAGGGTA TATCT CCTTC TTGTC-3’。
[0051](4)引入反向的转录终止子:设计并合成的反向PCR引物是引物7:5’ -TTTCGGTGCG GGGGC CCCCT TGMT GTGG`G G-3，；引物8:5，-GGTCC GGGGG TTTTT TTTCT CTTCC GCTTCCTCTC TC-3’。分析和验证多个转化子中质粒的序列，选择序列正确的质粒用作pHsh-T的前体质粒。
[0052](5)制备新型双向启动表达的T载体:将上述前体质粒导入大肠杆菌细胞，培养细胞后从中提取纯化前体质粒；用Bfu I切割前体质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收的2，280bp线性化DNA片段，即为具有双向基因表达元件、3’末端带T的载体(图1)。用TE溶液溶解，于_20°C保存。最终得到的线性T载体序列见附件中的核苷酸序列表SEQ IDN0.1。
[0053]实施例2.PCR产物的TA克隆试验:
[0054]用具有3’末端转移酶活性的Taq DNA聚合酶扩增目标基因，对需要表达的目标基因必须扩增完整的开放阅读框，即始于5’端的起始密码子ATG，直至终止密码子TCA、TTA或CTA0扩增得到的片段与pHsh-T进行连接后，转化感受态细胞，将转化菌液涂布于带有氯霉素抗性的LB平板上。30°C培养15-20小时，挑选平板上的转化子，即可以用于后续测序和基因表达。
[0055](I)嗜热乙醇杆菌JW200还原力感应蛋白(RSP)的PCR扩增
[0056]嗜热厌氧乙醇杆菌Thermoanaerobacter ethanolicus JW200的还原力感应蛋白RSP的编码基因的GenBank的登录号为⑶586295.1，根据基因序列设计引物扩增完整的开放阅读框。上游引物从RSP基因的起始密码子ATG开始，下游引物是从终止密码子TGA开始的反向互补链。引物序列为:
[0057]RSP-UP:5，-ATGAG CAAAA AGACT ATAGT AT-3，
[0058]RSP-DOWN:5，-TCACC CATCT ATTTT AGCAG-3’
[0059]用具有3’末端转移酶活性的Taq DNA聚合酶扩增RSP蛋白的基因序列，得到的3’端带有A的RSP基因片段，经纯化后可以与构建好的T载体连接。
[0060](2)连接与克隆
[0061]连接反应体系为10 μ 1，其中含有50ng载体pHsh-T和50ng的PCR产物(连接酶和缓冲液按大连Takara生物公司的产品说明书使用)；用连接液转化E.coli DHlOB感受态细胞后，将细胞涂布于含有氯霉素(25g/mL)的LB固体平板上，置于30°C恒温培养箱中培养15-20小时后，挑选平板上的转化子，提取质粒进行酶切验证，并且用pHsh系统测序引物pHsh-UP/DOWM测序引物进行序列测定。测序引物的序列为:pHsh-UP:CCGCA GCCGA ACGACCGA ；pHsh-D0WN:GCACA GATGC GTAAG GAGAA。[0062]本次克隆共得到85个转化子，序列测定结果表明，它们都是带有重组质粒PHsh-RSP ;约有50 %的RSP基因为正向插入，其表达受Hsh pro启动子的调控，其余反向插入的RSP基因受Hkg pro调控表达。
[0063]实施例3.外源基因的正、反向表达试验
[0064]从实施例2得到的不同转化子中提取质粒，取3个正向和3个反向插入pHsh-T的RSP基因表达质粒，分别转化至BL21 (DE3)，涂布于具有氯霉素抗性的LB平板上于30°C培养，待平板上长出单菌落后，挑取不同质粒转化的单菌落转接至LB液体中进行基因表达试验。
[0065]正向插入载体的RSP基因通过热激诱导表达，方法是:转化子置于30°C恒温培养箱中，180rpm培养至0D600达到0.6，放入42°C水浴摇床进行热激诱导6_8小时，离心收获细胞；RSP基因反向插入载体的转化子在30°C培养至菌液0D600达到2.0，离心收获细胞。通过SDS-PAGE检测目标蛋白分析基因表达情况(图2)。结果表明，通过TA连接克隆到pHsh-T中的RSP基因无论在Hsh pro还是Hkg pro的调控下都得到了有效表达。
[0066]实施例4.转化率测定
[0067]重组质粒pET-RSP的构建:用Nco I和Xho I酶切割pHsh-RSP分离出RSP基因，与经NcoI和XhoI双酶切的pET-28a载体连接，构建成pET-RSP重组质粒。
[0068]转化率比较:取pET-RSP质粒和实施例2中得到的pHsh-RSP的质粒IOOng分别转化至E.coli BL21(DE3)中，加入SOC培养基30°C振荡培养45min，按不同稀释度涂平板。30°C培养18小时，待菌落长出后计算平板上菌落个数并计算转化率。最终测得pET-RSP转化率为2 X 103cfu/g,而pHsh-RSP转化率平均为I X 104cfu/g。
[0069]实施例5.用pHsh-T构建基因文库并进行目标基因的活性筛选
[0070]基因组基因片段的制备:从亚栖热菌Meiothermus ruber RH提取DNA,用限制性内切酶Sau3A I进行不完全切割，琼脂糖凝胶电泳分离后，割胶回收2kb-4kb的DNA片段，具体操作方法参见分子克隆指南(Sambrook and Russell, 2001, CSHL Press, Cold SpringHarbor, New York)。所获得的是5’端悬挂的粘性末端DNA片段。
[0071]基因片段的末端修饰:用Taq DNA聚合酶对上述基因片段的粘性末端进行补平并且附加3’端悬挂的碱基A。[0072]基因片段与载体pHsh-T连接:将基因片段与载体以2: 1的比例混合，用T4DNA连接酶进行连接(16°C温箱中孵育12小时)；用连接液转化E.coli DHlOB感受态细胞。
[0073]建立文库与木聚糖酶活性筛选:转化E.coli BL21感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，涂布在含有2%桦树木聚糖(Sigma，USA)和25g/mL氯霉素的LB培养基平板上，置37°C温箱中培养长出转化子单菌落；菌落周围有透明圈的转化子为产生木聚糖酶活性的克隆；提取其中的质粒分析和鉴定被克隆的木聚糖酶基因。
[0074]实施例6.用环状质粒扩增法更换pHsh-T载体上的抗药基因
[0075]环状质粒扩增方法是本研究组发明的“变性-退火-延伸-连接”四步PCR循环，用于从环状质粒扩增出环状质粒(PPCP)的新方法(Le et al.，DNA Research, 2013, 20:375-382)。本实验通过PPCP方法将pHsh_T载体携带的氯霉素抗性基因CmR更换为氨苄青霉素抗性基因AmpR或卡那霉素抗性基因KanR。操作步骤如下:
[0076](1)设计一对引物与pHsh系列载体共有序列互补的引物:UP:5’ -TCTCA GTACAATCTG CTCTG-3’ ；D0WN:5’ -GCGAG GTATG TAGGC GGT-3’。
[0077](2)分别以 pHsh-Amp 或 pHsh-Kan (GenBank 登录号:FJ571619 或 FJ571621)为模板，扩增不同的抗药基因及其两端的同源臂序列；
[0078](3)用T4多聚核苷酸激酶处理步骤(2)获得的PCR产物，使其5’端磷酸化；
[0079](4)以本发明的T载体的环状前体质粒为模板，以步骤(3)中磷酸化的双链DNA片段为超大引物，通过PPCP获得更换了抗药基因的T载体的前体质粒；
[0080](5)用Bfu I完全酶切后纯化得到的线性DNA为带有不同抗药基因的T载体。
【权利要求】
1.一种新型表达型T载体，其基本特征在于在两个末端TA连接位点的上游各有I个强启动子及相应的基因表达元件(含转录起始位点、核糖体结合位点和下游的转录终止子)，使正向和反向插入的外源基因都能得到有效表达。
2.如权利要求1所述T载体，其特征在于将pHsh系列载体构建成T载体，使pHsh表达质粒的构建不再需要限制性内切酶切割，从而基因的克隆不再受限于酶切位点的匹配性。
3.如权利要求1所述T载体，其特征在于具有大肠杆菌载体系统pHsh的基本结构和高效表达功能，利用热激(Hsh)启动子对目标基因的表达进行调控。
4.如权利要求3所述的表达型T载体，其特征在于在Hsh启动子的相反方向安装I个人工设计合成的持家基因(Hkg)启动子，使反向插入的目标基因能够自由表达。
5.如权利要求4所述T载体的用途，其特征在于不仅适用于PCR产物的克隆和表达，还可以应用于基因文库的构建和筛选。
6.如权利要求5所述T载体的应用方法，其特征在于在构建基因文库的过程中，用TaqDNA聚合酶处理拟与T载体连接的DNA`片段的末端，使它们都带有3’端悬挂的碱基A。
【文档编号】C12N15/63GK103865943SQ201410061452
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年2月24日 优先权日:2014年2月24日
【发明者】邵蔚蓝, 周蓉, 王洪成 申请人:南京仙奕基因科技有限公司