一种实时fret-pcr和巢式pcr检测和分型立克次氏体的引物、探针及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种实时FRET-PCR和巢式PCR检测和分型立克次氏体的引物、探针及试剂盒。所述引物、探针如序列1-8所示。本发明设计FRET-PCR的引物和探针，可以特异地扩增所有立克次氏体种属的核酸，从而快速的判断出阳性样品；然后选择相同基因的其他保守区间设计巢式PCR的2对引物，并通过巢式PCR、琼脂糖凝胶电泳和测序确定相应阳性样品的立克次氏体种属。因此，此系统不仅能快速、特异的检测到所有种属的立克次氏体，而且能确定其种属。
【专利说明】—种实时FRET-PCR和巢式PCR检测和分型立克次氏体的引物、探针及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明建立了一套基于柠檬酸合成酶基因、可以对所有立克次氏体的种进行检测和分型的系统。本系统通过实时FRET-PCR和巢式PCR相结合的方式而达到快速检测和分型所有立克次氏体种的目的。
【背景技术】
[0002]立克次氏体是一种细菌，但同时具有病毒的特征，是严格的细胞内寄生生物，寄生在各种吸血节肢动物和昆虫体内。人和动物通过被感染立克次氏体的媒介昆虫叮咬或接触其粪便而感染，可引起人类和动物发热、头痛和皮疹等临床症状。该病多发生在热带与亚热带国家和地区，目前立克次氏体感染已成为世界性问题。目前我国已将流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒等由立克次氏体感染所引起的传染病列为乙类传染病。我国存在10种以上立克次氏体感染引起的疾病，如流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、恙虫病、北亚蜱传斑点热、黑龙江蜱传斑点热、内蒙古蜱传斑点热、Q热、人单核细胞埃立克体病、人粒细胞埃立克体病以及巴尔通体病等。立克次氏体严格细胞内寄生性决定了鉴定立克次氏体感染不同于传统的细菌学诊断，如不易于分离和培养。立克次氏体在世界范围内检出率不高且阳性样品中立克次氏体核酸含量相对较低，亟需一种高效和高灵敏度的检测方法。
[0003]1.分离培养。对于细菌性感染，从发病机体内分离和培养病原体是测定其种属的常用方法。立克次氏体是一类介于细菌和病毒之间，更接近于细菌的原核生物。目前分离培养立克次氏体的常用方法有:(1)细胞培养。是目前临床标本初步分离立克次氏体使用最广泛的方法，最常用的细胞系有L929及vero细胞。(2)动物接种法。用于初代分离，常用实验动物有小白鼠、豚鼠、大白鼠、地鼠等。(3)鸡胚卵黄囊培养法。作为动物培养的辅助方法，用于动物培养失败的弱毒株和无毒株培养，也可用于病原体在动物体内的传代接种，它能直接从现场标本中分离病原体。由于立克次氏体为严格的细胞内寄生，同时感染的人或动物菌血症时间较短且病原菌含量很低，使得立克次氏体的分离培养较为困难。
[0004]2.血清学。立克次氏体特异抗体的检测是WHO推荐的主要诊断技术之一，然而血清抗体一般在发病5到10天能够检测到，主要是IgM型抗体。单份血清特异抗体明显高于当地正常人群血清滴度或双份血清发生血清转换(血清抗体4倍升高)可进行明确诊断。血清学方法通常根据实验目的、实验条件进行。通用的国际标准是间接免疫荧光(IFA)检测血清抗体。(1)间接免疫荧光(IFA)。主要采用立克次氏体特异抗原检测感染人或动物血清抗体，且同一抗原片可以同时检测多种立克次氏体。(2)补体结合试验(CF)。是一种有补体参与并以绵羊红细胞和溶血素为指标系统的免疫检测方法。(3)酶联免疫吸附试验(ELISA)0包被抗原通常为重组抗原，可用于急性病例诊断和流行病学调查。由于立克次氏体较难分离培养，使得试剂盒中抗原提纯不足而使结果中经常出现假阳性或交叉感染。
[0005]3.免疫组化。免疫组化荧光检测立克次氏体能在血清转化前诊断病人或动物的感染。新鲜组织、福尔马林固定或石蜡包埋的标本均可用于免疫检测，在普通显微镜下观察到细胞周围感染的立克次氏体具有较高的灵敏性和特异性，尤其在没有荧光显微镜的实验室更加方便。但此方法专业性较强，且操作繁琐。
[0006]4.分子生物学。以PCR扩增及测序为主要手段的分子生物学技术目前已取代病原分离作为直接诊断依据。PCR技术包括常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR(real-timequantitative PCR)。(I)常规PCR。通常选用属、群或种特异基因进行扩增。如立克次氏体属16SrRNA，斑疹伤寒和斑点热群17KD、gltA和外膜蛋白ompB等。(2)巢式PCR。如17KD、gltA、ompB、56KD巢式PCR分别被用来检测斑疹伤寒群和斑点热群、恙虫病立克次氏体。(3)实时荧光定量PCR。这是目前检测病原体最快速、准确、特异、灵敏的核酸检测技术。如根据gltA基因序列设计引物和探针建立了斑疹伤寒和斑点热群立克次氏体的荧光定量PCR检测技术。然而，目前的分子诊断方法还不够成熟。部分通过传统PCR和琼脂糖凝胶电泳的检测方法可以涵盖所有的立克次氏体种属，但是操作繁琐，不适应于大量样本的检测。现存的定量PCR仅能检测立克次氏体的部分种，而且不能区分有致病性差异的不同种立克次氏体。
【发明内容】
[0007]1.要解决的技术问题
[0008]目前立克次氏体的检测方法如下:1)病原菌的分离和培养。通过从感染人或动物体内分离得到立克次氏体，然后接种细胞等并培养来判断。但由于立克次氏体的严格胞内寄生性使得立克次氏体病原菌的分离和培养较为困难。2)血清学检测。用抗原和抗体结合的理论，通过包被的抗原检测人或动物的血清抗体来判断。但由于试剂盒中抗原提纯不够或检测过程中出现的交叉感染，使结果经常出现假阳性。3)分子生物学检测。主要通过PCR方法检测样本中有无立克次氏体核酸来判断。立克次氏体有3个属、12个种，不同属和种的立克次氏体的致病性及感染后的预后明显不同。因此，我们亟需建立一种快速、精确地检测并区分所有种立克次氏体的方法。
[0009]2.技术方案
[0010]本发明的原理和最核心的思路是发明一种高度灵敏、特异、快速检测和分型所有立克次氏体种的方法体系。同时确保此系统不扩增其它非立克次氏体的微生物，尤其是与其相近的其他病原体，如埃里克体、贝纳柯克斯体和无形体等。本发明选择柠檬酸合成酶基因作为目标基因，并选择相对保守的区域设计引物和探针。总体的思路是:巧妙地设计FRET-PCR的引物和探针，可以特异地扩增所有立克次氏体种属的核酸，从而快速的判断出阳性样品；然后选择相同基因的其他保守区间设计巢式PCR的2对引物，并通过巢式PCR、琼脂糖凝胶电泳和测序确定相应阳性样品的立克次氏体种属。因此，此系统不仅能快速、特异的检测到所有种属的立克次氏体，而且能确定其种属。
[0011](I) FRET-PCR。首先从NCBI上获得所有立克次氏体种的gltA基因序列，并选择相对保守的区间设计引物(FRET-上游引物和FRET-下游引物)和探针(FRET-6-FAM探针和FRET-LCRed640探针)。然后用该引物和探针对样品进行实时、定量和快速检测。对于含有立克次氏体核酸的样品，在FRET-PCR结果中其荧光曲线会在640nm处出现或增强，同时在其高分辨率熔解曲线中其熔解峰会出现在不同的温度处。因此，可以根据熔解峰温度区分猫立克次氏体和其它种的立克次氏体。(2)巢式PCR。基于gltA基因设计内部和外部2对引物(N-上游引物-1和N-下游引物-1、N-上游引物-2和N-下游引物_2)，然后用此引物对实时FRET-PCR检测为阳性的样品做巢式PCR。首先用外部引物扩增目的片段，然后用内部引物扩增外部引物的PCR产物。将最终的PCR产物进行基因测序，最后将测序结果和各个立克次氏体种的标准核酸序列进行比对，从而确定其立克次氏体的种。
[0012]从GenBank (www.ncb1.nlm.nih.gov)获取如下立克次氏体种属的柠檬酸合成酶基因的序列后，用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法对所有序列进行比对:Rickettsia africae U59733, R.akari U59717, R.australis U59718, R.canadensis U59713, R.conorii U59730, R.felis JQ674484, R.helvetica U59723, R.honei AF018074,R.japonica U59724, R.massiliae U59719, R.mongolotimonae U59731, R.montana U74756, R.pakeri U59732, R.rhipicephali U59721, R.rickettsii U59734, R.solvaca U59725, R.thphi U59714, R.hoogstraalii FJ767737, R.japonica AY743327, R.prowazekii U59715。据此,本发明设计的引物和探针为(图1_8):具体序列如下
[0013](I)定量FRET-PCR引物及探针
[0014]FRET-上游引物:5’-TTRCAAATAGCAATAGAACTTGAAGCT-3，(SEQ ID N0.1)
[0015]FRET-下游引物:5，-ATCCAGCCTACGGTTCTTGCT-3，(SEQ ID N0.2)
[0016]6-FAM 探针:5，-ATCGCTCTTAAAGATGAATATTTTATTGAG-6-FAM-3，(SEQ ID N0.3)
[0017]LCRed640 探针:5’ -LCRed-640-GAAAATTATATCCAAATGTTGATTTTTATTC-磷酸 _3’(SEQ ID N0.4)
[0018](2)巢式 PCR
[0019]N-上游引物-1:5’ -AGTAAATCCAATAATAAAAAATGCKCTTAATA-3’ (SEQ ID N0.5)
[0020]N-下游引物-1:5，-ATTTTCTCTCAATAAAATATTCATCTTTAAG-3，(SEQ ID N0.6)
[0021]N-上游引物-2:5’ -ATGAGCAGAATGCTTCTACTTCAACA-3’ (SEQ ID N0.7)
[0022]N-下游引物-2:5’ -AGCTTCAAGTTCTATTGCTATTTGYAA-3，(SEQ ID N0.8)
[0023]本发明还提供了用于实时FRET-PCR和巢式PCR检测和分型立克次氏体的试剂盒，包括:
[0024]( I)实时荧光定量PCR试剂
[0025]20 μ I的扩增体系包含:10 μ I的样品DNA模板或者定量标准试剂、IxPCR缓冲液、I μ MFRET-上游引物、I μ M FRET-下游引物、0.2 μ M 的 6-FAM 探针、0.2 μ M 的 LCRed640 探针、2个单位的商业化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0026](2)巢式PCR试剂
[0027]巢式PCR-外部:
[0028]20 μ I的扩增体系包含:10 μ I的样品DNA模板或者定量标准试剂、IxPCR缓冲液、I μ MN-上游引物_1、1 μ M N-下游引物-1、2个单位的商业化Taq酶、200 μ M dNTP ；
[0029]巢式PCR-内部:
[0030]20 μ I的扩增体系包含:10μ I巢式PCR外部引物产物、IxPCR缓冲液、I μ M N-上游引物_2、1μΜ N-下游引物_2、2个单位的商业化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0031]柠檬酸合成酶-PCR特异性的确定。本发明的特异性从四个方面得到保证:
[0032]I)设计的引物和探针经过GenBank的BLAST搜索，确认本发明设计的引物能特异地扩增所有的立克次氏体，而不扩增其它非立克次氏体尤其是与其相近种属病原体的核酸。通过BLAST确认，FRET-PCR探针和引物及巢式PCR的引物能特异地扩增和检测所有立克次氏体种的核酸；
[0033]2)本发明检测猫立克次氏体和伤寒立克次氏体标准品、埃立克体阳性样品和无形体阳性样品。结果表明，本发明系统可以扩增猫立克次氏体和伤寒立克次氏体的核酸，而不扩增埃立克体和无形体阳性样品的核酸；
[0034]3)观察以上扩增对象在PCR过程中荧光强度(640nm)的变化，以及PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的条带的大小。荧光在640nm波长出现或增强，显示阳性；在琼脂糖凝胶电泳中，RT-PCR显示167碱基对(bp)和巢式PCR外部444bp和内部352bp的条带大小；
[0035]4)对扩增的PCR产物进行测序，测序的结果和GenBank的标准序列进行比对，从而判定其立克次氏体的种。
[0036]柠檬酸合成酶-PCR灵敏度的确定:由IDT合成立克次氏体中的猫立克次氏体和伤寒立克次氏体柠檬酸合成酶基因的序列。依据合成物的分子量和绝对重量，计算合成物所含的基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制备每IOyl合成物的稀释试剂含10，000拷贝、1，000拷贝、100拷贝、10拷贝、I拷贝的基因。用本发明系统扩增含不同基因浓度的稀释液，来确定本发明检测此基因的灵敏度。结果显示，此发明可以在反应系统中扩增单拷贝的目的柠檬酸合成酶基因。
[0037]3.有益效果
[0038]1)本发明可以特异性地检测所有的立克次氏体。目前为止，立克次氏体可以分为斑点热群、伤寒群和恙虫病立克次氏体3个属,共12个种，如R.rickettsia、R.akar1、R.conori1、R.sibirica、R.australis、R.felis、R.japonica、R.africae、R.hoogstraali1、R.prowazeki1、R.typhi等。因此,能够同时检测到立克次氏体的所有种很重要,尤其对于同源性差别较大的种属。同时，检测到所有的种可以更方便的发现新的立克次氏体的种或株，并及时的更新立克次氏体的分类，从而更好地认识该病原体。
[0039]2)本发明可以对不同种的立克次氏体进行分型。不同的立克次氏体种可以引起不同的疫病，如普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)是流行性斑疫伤寒和斑疫伤寒的病原体，莫氏立克次氏体(Rickettsia mooseri)是地方性斑疹伤寒(也称鼠型斑疹伤寒)的病原体，立克次氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)是引起落基山斑疫伤寒的病原体，恙虫病立克次氏体(Rickettsia tsutsugamushi )是恙虫病(丛林斑疫伤寒)的病原体。因此，确定阳性样本的立克次氏体的种从而根据对应的病原体特点采取相应的治疗和控制措施，同时可以根据不同传染病的传染源和传播途径采取相应的防治措施，从而更好的预防和控制立克次氏体的感染。
[0040]3)本发明操作便捷，适合于检测大量样本。由于立克次氏体是严格的细胞内寄生，且感染立克次氏体的人或动物在菌血症及其后期机体内(如血液)立克次氏体的细菌含量相对较低，这就需要通过鉴定较多的样品或极其灵敏的检测方法来确诊感染。在实际应用中，如流行病学调查或检测大量送检样品，对于普通PCR结合琼脂糖凝胶电泳等方法需要极大的工作量。而本发明可以先从大量样本中筛选出阳性样本，然后再通过巢式PCR、琼脂糖凝胶电泳和测序确定其立克次氏体的种。
[0041]立克次氏体是一种细菌，但其严格的细胞内寄生性、缺乏特异性的临床表现和较短的菌血症时间等特点决定了立克次氏体检测不同于传统的细菌学检测。由于检测时间和样本量的限制，聚合酶链式反应(PCR)检测成为主要的检测手段和方法，尤其是定量FRET-PCR 和巢式 PCR。
[0042]4)本发明综合了定量PCR和巢式PCR的优点，而摒弃了他们的缺点。本发明能够特异、灵敏和快速的检测所有的立克次氏体且确定相关阳性样品的立克次氏体的种，这将为立克次氏体感染的检测和控制提供强有力的技术支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1.本发明的定量FRET-PCR的上游引物。FRET-上游引物序列:5 ‘-TTRCAAATAGCAATAGAACTTGAAGCT-3 ’( 27bp )，其中有一个兼并碱基R。此兼并碱基R可以同时扩增A和G碱基，所以R.hoogstraalii有一个错配碱基,而其他种的立克次氏体和此引物完全吻合。
[0044]图2.本发明的定量FRET-PCR的下游引物。FRET-下游引物序列:5’ -ATCCAGCCTACGGTTCTTGCT-3’(21bp)，此序列为图中获得序列对称链的核苷酸序列。在立克次氏体的所有种中，R.prowazekii和R.typhi有I个错配，R.helvetica有2个错配。
[0045]图3.本发明的定量FRET-PCR的6-FAM探针。6-FAM探针序列为:5 ‘-ATCGCTCTTAAAGATGAATATTTTATTGAG-6-FAM-3’(21bp)，在其3’端标记有荧光激发基团。此探针在R.canadensis 和 R.slovaca 有 I 个错配，在 R.prowazekii 和 R.typhi 有 2 个错配，而和其他种的立克次氏体完全吻合。
[0046]图4.本发明的定量FRET-PCR的LCRed640探针。FRET-PCR中LCRed640探针的核苷酸序列:5 ‘ -LCRed-640-GAAAATTATATCCAAATGTTGATTTTTATTC-磷酸-3 ’( 3 Ibp )，其 5 ’端标记640荧光接受基团，3’端标记磷酸基团阻止其在PCR反应体系中继续向下延伸。此段引物序列和所有种的立克次氏体柠檬酸合成酶基因完全相同。
[0047]图5.本发明的巢式PCR的N-上游引物-1。巢式PCR外部引物N-上游引物-1的核苷酸序列为:5’ -AGTAAATCCAATAATAAAAAATGCKCTTAATA-3’(32bp)，且引物中含有一个兼并碱基K。兼并碱基K可以同时扩增碱基G和T，使得引物可以涵盖更多的立克次氏体种属。引物在R.canadensis中有2个错配碱基,而与其他种的立克次氏体的核苷酸序列完全吻合。
[0048]图6.本发明的巢式PCR的N-下游引物-1。巢式PCR中外部引物N-下游引物-1的核苷酸序列为:5’ -ATTTTCTCTCAATAAAATATTCATCTTTAAG-3’( 3Ibp)，此引物序列为图中获得核苷酸链的对称链序列。此引物是巢式PCR扩增外面部分的下游引物,其在R.prowazekii中有I个错配碱基，而与其他立克次氏体种对应gltA基因核苷酸的序列全部相同。
[0049]图7.本发明的巢式PCR的N-上游引物_2。此巢式PCR内部上游引物N-上游引物_2的核苷酸序列为:5’ -ATGAGCAGAATGCTTCTACTTCAACA-3’，长26个核苷酸。此引物在R.felis和R.canadensis中分别有I个错配喊基，在R.hoogstraalii中有2个错配喊基。
[0050]图8.本发明的巢式PCR的N-下游引物-2。此巢式PCR内部引物N-下游引物_2的核苷酸序列为:5’ -AGCTTCAAGTTCTATTGCTATTTGYAA-3’，其长27个碱基，同时含有一个兼并碱基Y。此兼并碱基Y可以同时扩增碱基C和T。此引物为下游引物，其序列为图中核苷酸链的对称链的核苷酸序列。除兼并碱基位点外，此引物和R.hoogstraalii有I个错配碱基。
[0051]图9.本发明中立克次氏体的熔解曲线。本发明结束后，对于不同种的立克次氏体，其熔解曲线中熔解峰的温度会不同。如图表示猫立克次氏体、阴性对照和其它种立克次氏体的熔解曲线中的熔解峰。可以通过熔解峰温度的不同初步判断立克次氏体的种属。如图所示，猫立克次氏体溶解峰温度为61.9°C,而其它种的立克次氏体溶解峰温度为57.9℃。
[0052]图10.实施例1 中 ompB-F 和 ompB-R 引物。文章 “Molecular evidence ofRickettsia felis infection in dogs from northern territory, Australia，，(Hii SFet al., Parasit Vectors.2011 ;4:198)中的 ompB-F 和 ompB-R 引物。该文章的引物只能检测猫立克次氏体的核酸，而不能涵盖立克次氏体其他种属。
[0053]图11.实施例1 中引物 CS-78、CS-323、CS-239 和 CS-1069 以及引物 CS-5 和CS-6。(I)文章“A novel Rickettsia infecting Amblyomma dubitatum ticks inBrazil^ (Almeida AP et al.，Ticks Tick Borne Dis.2011; 2 (4):209-212)中的引物CS-78,CS-323,CS-239和CS-1069。此套引物需要和琼脂糖凝胶电泳相结合，这会加大检测时的工作量，尤其是面对大量样本。
[0054](2)文章“Rickettsia Species Infecting Amblyomma cooperi Ticks froman Area in the State of Sa ~o Paulo, Brazil, Where Brazilian Spotted Fever IsEndemic^dabruna MB et al.,J Clin Microbiol.2004; 42 (I):90-98.)中的引物 CS-5 和CS-6。此文章中的引物和探针只是检测到了蜱中立克次氏体的存在，并没有通过更多动物种类样品的检测。
[0055]图12:本发明定量FRET-PCR产物在琼脂糖凝胶电泳的条带位置。图中共11个泳道，其中I泳道为标准品，8泳道为阴性样品，其余泳道为阳性样品。本试验所使用的标准品条带大小如图标注，从下到上依次为IOObp，250bp, 500bp, 750bp等。本发明中FRET-PCR产物的条带大小为167bp。
[0056]图13.本发明巢式PCR内部引物和外部引物PCR产物的条带位置。巢式PCR用内外两对引物分两步扩增目的条带，首先用外部引物扩增目的片段，然后用其产物作为模板并用内部引物扩增。图中共12个泳道，其中1、12泳道是标准品，2-6泳道为外部引物扩增的产物，7-11泳道为内部引物扩增产物。在样品中，2 (7)、5 (10),6 (11)泳道为阳性样品，3 (8)、4 (9)泳道为阴性样品。本试验所用的标准品的条带大小如图所示，从下到上依次为lOObp，250bp, 500bp, 750bp等。巢式PCR产物中，外部产物的条带大小为444bp，而内部产物的条带大小为352bp。
【具体实施方式】
[0057]1.立克次氏体PCR检测方法所用引物和探针的核苷酸序列如下:
[0058](1) FRET-PCR
[0059]FRET-上游引物:5 ’ -TTRCAAATAGCAATAGAACTTGAAGCT-3 ’
[0060]FRET-下游引物:5 ’ -ATCCAGCCTACGGTTCTTGCT-3 ’
[0061 ]6-FAM 探针:5，-ATCGCTCTTAAAGATGAATATTTTATTGAG-6-FAM-3，
[0062]LCRed640 探针:5，-LCRed640_GAAAATTATATCCAAATGTTGATTTTTATTC-磷酸-3，
[0063](2)巢式 PCR
[0064]N-上游引物-1:5 ’ -AGTAAATCCAATAATAAAAAATGCKCTTAATA-3 ’[0065]N-下游引物-1:5’ -ATTTTCTCTCAATAAAATATTCATCTTTAAG-3’
[0066]N-上游引物-2:5 ’ -ATGAGCAGAATGCTTCTACTTCAACA-3 ’
[0067]N-下游引物-2:5’ -AGCTTCAAGTTCTATTGCTATTTGYAA-3’
[0068]2.制备PCR用的标准定量试剂。由IDT合成立克次氏体种属(猫立克次氏体、伤寒立克次氏体)的基因gltA的序列。依据合成物的分子量和绝对重量，计算合成物所含的基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制备每?ο μ I合成物的稀释试剂分别含10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝、I拷贝的基因，作为PCR用的标准定量试剂；
[0069]3.制备待检样品的DNA模板。本发明所用的检测模板包括人全血、犬全血、跳蚤、蜱、虱子以及蚊子。
[0070]I)从猫和犬身上采集跳蚤、蜱和虱子经种属鉴定后，以单个个体保存于含有400ul核酸保护剂的试管中，经PRECELLUS粉碎器60秒粉碎后，用商业化核酸提取试剂盒对所有样品进行核酸抽提。核酸提取的相关操作流程按照相应试剂盒的使用说明书操作，且最后用 T10Eai (含 IOmM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, ρΗ8.5)洗脱核酸至 IOOul 作为 PCR 扩增模板。
[0071]2)收集人和犬的全血样品于含EDTA的采血管中，用商业化核酸提取试剂盒对相关样品进行核酸提纯。核酸提取的相关程序按照相应的商业化试剂盒的使用说明书操作，最后洗脱在200 μ I TltlEai洗脱液中作为PCR的扩增模板；
[0072]3)被捕捉的单个蚊子经属种鉴定后，立即保存于含有400微升核酸保护剂的试管中，经PRECELLUS粉碎器30秒粉碎后，用于DNA纯化；按照商业化试剂盒相关操作说明对粉碎后的蚊子样品进行核酸提纯，最后洗脱在80 μ I TltlEai洗脱液中作为PCR的扩增模板；
[0073]4.PCR扩增体系。
[0074]I)实时荧光定量PCR
[0075]20 μ I的扩增体系包含:10 μ I的样品DNA模板或者定量标准试剂、IxPCR缓冲液、I μ MFRET-上游引物、I μ M FRET-下游引物、0.2 μ M 的 6-FAM 探针、0.2 μ M 的 LCRed640 探针、2个单位的商业化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0076]2)巢式 PCR
[0077]巢式PCR-外部:20 μ I的扩增体系包含:10 μ I的样品DNA模板或者定量标准试剂、IxPCR缓冲液、I μ M N-上游引物-1、I μ M N-下游引物-1、2个单位的商业化Taq酶、200 μ M dNTP ο
[0078]巢式PCR-内部:20μ I的扩增体系包含:10μ I巢式PCR外部引物产物、IxPCR缓冲液、I μ M N-上游引物_2、1μΜ N-下游引物_2、2个单位的商业化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0079]5.PCR扩增循环参数。
[0080]I) FRET-PCR
[0081]PCR扩增包括:预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的荧光获得循环、I个持续荧光获得的熔解循环和I个降温循环。预变性:lX2min@95°C ；18个温度递减的高严谨循环:6xlsec@95 °C，12seci70 °C,8seci72 °C ；9xlseci95 °C, 12seci68 °C,8seci72 °C ; 3xlseci95 °C，12seci66 °C，8seci72 °C ;40 个欠严谨的荧光获得循环:40xlseci95°C，8seci57°C (在此收集荧光)，30seci67°C，and30seci72°C ；1 个熔解循环:lxlseci95°C，10sec@38°C，@85°C持续收集荧光；降温循环:lxlsec@38°C。
[0082]2)巢式PCR (内部和外部巢式PCR两部分反应用以下相同的PCR循环程序)[0083]PCR扩增包括:预变性、18个温度递减的高严谨循环、40个欠严谨的荧光获得循环和I个降温循环。预变性:lX2min@95 °C ;18个温度递减的高严谨循环:6xlsec@95 °C , 12seci70 °C,8seci72 °C ；9xlseci95 °C, 12seci68 °C,8seci72°C ; 3xlseci95°C, 12seci66°C，8sec@72°C ;40 个欠严谨的荧光获得循环:40xlsec@95°C，8seci57°C，30seci67°C，and30seci72°C ;降温循环:lxlsec@38°C。
[0084]6.PCR结果的判定。
[0085]DNA模板的制备过程均设有DNA提取的阴性和阳性对照，随后的PCR扩增对象包括待测样品的DNA模板、DNA提取的阴性和阳性对照。此发明有着高度的特异性，不仅能检测到所有立克次氏体的核酸，而且能够确定相应样品的立克次氏体种属。阳性样品和阳性对照在FRET-PCR的荧光扩增曲线中有荧光的出现或增强，且熔解曲线中有熔解峰出现。对于不同种属的立克次氏体，其熔解峰的温度会有差异。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中的条带大小不同，FRET-PCR目的条带大小出现在167bp，巢式PCR外部产物条带大小为444bp、内部产物为352bp。I) FRET-PCR对于阳性样品和阳性对照，荧光在640nm出现或增强；在熔解曲线中会有熔解峰出现，且对于猫立克次氏体和其它种的立克次氏体其熔解峰会出现在不同的温度值处(图9)。2)巢式PCR首先使用外部引物(N-上游引物-2和N-下游引物-2)扩增阳性样品；然后用外部引物的PCR产物作为模板，用内部引物(N-上游引物-1和N-下游引物-1)扩增目的核酸。且二者在琼脂糖凝胶电泳的条带大小为:外部引物444bp，内部引物352bp。
[0086]实施例1:本发明检测方法与相关分子检测方法的比较
[0087]本发明可以快速、准确、特异的检测各种物种样本中的立克次氏体核酸，并确定其立克次氏体的种。
[0088]I)本发明可以检测所有的立克次氏体种属。立克次氏体可以分为斑点热(spotted fever group SFG)、斑疫伤寒(typhus group)和恙虫病(scrub typhus group)等，而对于不同的种属会引起不同的疾病，如普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)是流行性斑疫伤寒和斑疫伤寒的病原体，莫氏立克次氏体(Rickettsia mooseri)是地方性斑疹伤寒(也称鼠型斑疹伤寒)的病原体，立克次氏立克次氏体(Rickettsiarickettsii)是落基山斑疹伤寒的病原体，而恙虫病立克次氏体是恙虫病(丛林斑疹伤寒)的病原体。目前很多检测方法只能检测出斑点热或者斑疹伤寒，而不能检测所有的立克次氏体，如 “Molecular evidence of Rickettsia felis infection in dogs fromnorthern territory, Australia，，(Hii SF 等，Parasit Vectors.201 IOctlI; 4:198.do1:10.1186/1756-3305-4-198)中的 ompB-F 和 ompB-R (图 10.)就只能检测所有的斑点热且不能通过PCR荧光发光来快速判断样品是否为阳性，所以操作较为繁琐。
[0089]2)本发明可以快速检测从而减少工作量。对于普通PCR，必须要通过琼脂糖凝胶电泳来判断PCR产物中目的条带的有无，对于从大量样品中筛选阳性样品就需要及其繁琐的工作，由此势必会影响样本检测的速度和准确性。如“A novel Rickettsia infectingAmblyomma dubitatum ticks in Brazil，，(Almeida AP et al., Ticks Tick BorneDis.2011; 2 (4):209-12)中的引物 CS-78 (forward)和 CS-323 (reverse)及引物 CS-239和CS-1069 (图11.)就是通过普通PCR和电泳来判断样品中是否含有立克次氏体相关种属的。[0090]3)本发明从更多的物种的不同类型的样品中检测到了立克次氏体的相关种属。对于一种检测方法需要从来自多种物种的样本中检测到目的核酸才更能说明其可行性，为相关立克次氏感染的检测和诊断提供技术支持。如“Rickettsia Speciesinfecting Amblyomma cooperi ticks from an area in the state of Sa ~oPaulo, Brazil, where Brazilian spotted fever is endemic，，(Labruna MB et al.,J ClinMicrobiol.2004; 42 (I):90-98.)中的引物 CS-5 (forward)和 CS-6 (reverse)(图-11)及探针5，6-FAM d (CATTGTGCCATCCAGCCTACGGT) BHQ-13，只是从蜱中检测到了立克次氏体种属的相关核酸，未能通过其他种类的样本进行确定。
[0091]实施例3:检测人血样中的猫立克次氏体。
[0092]从扬州市某医院获取人全血样品822份，置于含有EDTA的商业采血管中。然后用商业核酸提取试剂盒并按照相关说明书操作对人全血样品进行核酸提取，作为PCR扩增模板。然后通过FRET-PCR和巢式PCR相结合的方式判断出阳性样品并确定其立克次氏体的种。结果显示，在822份人全血样品中检测出1份立克次氏体阳性样品。这是扬州市首次也是中国国内首次证实人感染猫立克次氏体的病例。
[0093]实施例4:检测狗血样中的立克次氏体。
[0094]从云南省昆明市和上海市某动物医院和动物门诊共采取犬全血146份。其中昆明162份，上海84份。运用本发明对所有样品进行检测，结果显示，有8只犬的样品感染了立克次氏体。在感染立克次氏体的狗中，有6只来自云南省昆明市，有2只来自上海市。对阳性样品经测序种属鉴定后发现，有6个阳性样品为猫立克次氏体，而另外2个阳性样品为新的立克次氏体菌株，并且将该新型菌株提交到NCBI(http://www.ncb1.nlm.nih.gov),并获得了对应的编号(GenBank N0.:KJ440515和KJ440516)。这不仅是在昆明市和上海市，同时也是在中国国内首次猫立克次氏体的报道，同时也发现了新的立克次氏体菌株。
[0095]实施例5:检测尼加拉瓜犬血样中的立克次氏体。
[0096]从中美洲加勒比海岛国-尼加拉瓜采集39份狗全血样品，并用本发明方法进行检测。结果显示，其中有2只犬感染了立克次氏体，且该立克次氏体属于猫立克次氏体。这是该国家首次报道猫立克次氏体，同时也是该国家首次在犬血样中发现猫立克次氏体。
[0097]实施例6:检测哥斯达黎加的犬血样中的立克次氏体。
[0098]从中美洲的岛国-哥斯达黎加采集犬全血样品40份，并用本发明系统体系检测其立克次氏体的感染状况。结果显示，样品全部显示阴性，即没有立克次氏体的感染。同时用此40份狗全血样品,通过埃立克体(Ehrlichia)和无形体(Anaplasma)的引物及探针分别检测埃立克体和无形体病原体。结果显示,感染埃立克体的个体达36个，同时有3份样品感染了无形体。此结果同时也说明了，本发明不仅可以特异的检测到所有立克次氏体的种属，而且不会扩增非立克次氏体种属，尤其是与其同源性较高的种属，如埃立克体、无形体等。
[0099]实施例7:检测跳蚤、蜱、虱子样本中的立克次氏体。
[0100]从扬州市的流浪猫身上采集60只跳蚤，经种属鉴定全部为猫栉首蚤；从扬州市某狗场的商业狗身上采集146只蜱和47只虱子，经种属鉴定蜱全部为血红扇头蜱。用商业化核酸提取试剂盒对全部样品进行核酸抽提后作为PCR扩增模板，然后用本发明检测所有样本。结果显示，在60只跳蚤中有57只感染了立克次氏体，且所有的立克次氏体为猫立克次氏体；所有的蜱样本中有15只为阳性，其中14只为猫立克次氏体，有I只携带的立克次氏体为新的菌株(GenBank N0.:KJ440521) ；47只虱子中有6只为阳性，其中有3只为猫立克次氏体，其他3个为新的立克次氏体菌株(GenBank N0.:KJ440517、KJ440518、KJ440522)。这是扬州地区首次报道跳蚤、虱子和蜱感染立克次氏体，同时也是中国国内首次从跳蚤、虱子和蜱中检测到猫立克次氏体的报道，而且发现了新的立克次氏体菌株。
[0101]实施例8:检测蚊子样本中的立克次氏体。
[0102]从扬州市捕捉428只蚊子检验本发明方法，从而为本发明更广阔的样本应用范围提供理论支撑。用商业化核酸提取试剂盒对所有蚊子样品进行核酸提取后，通过本发明方法检测蚊子样本是否携带了立克次氏体病原体。结果表明，在428只蚊子中有153只蚊子携带立克次氏体病原体。其中，有150只蚊子携带的立克次氏体为猫立克次氏体，而其余的3只蚊子 携带了三种新的立克次氏体菌株(GenBank N0.:KJ440519、KJ440520、KJ440523)。这是扬州市首次立克次氏体的报道、首次蚊子携带立克次氏体的报道，同时也是中国国内首次报道猫立克次氏体、首次报道蚊子携带猫立克次氏体病原体报道，而且发现了新的立克次氏体菌株。
【权利要求】
1.用于实时FRET-PCR和巢式PCR检测和分型立克次氏体的引物及探针，其特征在于，由FRET-PCR引物、探针，以及巢式PCR引物组成，所述引物、探针的具体序列如下: (1)FRET-PCR 引物、探针: FRET-上游引物:5’ -1TRCAAATAGCAATAGAACTTGAAGCT-3’ FRET-下游引物:5’ -ATCCAGCCTACGGITCTTGCT-3’
6-FAM 探针:5’ -ATCGCTCTTAAAGATGAATATTTTATTGAG-6-FAM-3’ LCRed640 探针:5’ -LCRed-640-GAAAATTATATCCAAATGTTGATTTTTATTC-磷酸-3’ ； (2)巢式PCR: N-上游引物-1:5’ -AGTAAATCCAATAATAAAAAATGCKCTTAATA-3’ N-下游引物-1:5’ -AnTTCTCTCAATAAAATAITCATCTTTAAG-3’ N-上游引物-2:5’ -ATGAGCAGAATGCTTCTACTTCAACA-3’ N-下游引物-2:5’ -AGCTTCAAGTTCTAITGCTAITTGYAA-3’。
2.用于实时FRET-P CR和巢式PCR检测和分型立克次氏体的试剂盒，其特征在于由以下构成: .1)实时荧光定量PCR试剂 . 20 u I的扩增体系包含=IOiU的样品DNA模板或者定量标准试剂、IxPCR缓冲液、IU MFRET-上游引物、I U M FRET-下游引物、0.2 y M 的 6-FAM 探针、0.2 y M 的 LCRed640 探针、2个单位的Taq酶、200 U M dNTP ； . 2)巢式PCR试剂 巢式PCR-外部: .20 u I的扩增体系包含=IOiU的样品DNA模板或者定量标准试剂、IxPCR缓冲液、Iii MN-上游引物-l、lii M N-下游引物_1、2个单位的Taq酶、200 ii M dNTP ； 巢式PCR-内部:. 20 u I的扩增体系包含:10u I巢式PCR外部引物产物、IxPCR缓冲液、Iii M N-上游引物-2、Iii M N-下游引物_2、2个单位的Taq酶、200 ii M dNTP。
【文档编号】C12Q1/04GK103789442SQ201410061800
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月24日 优先权日:2014年2月24日
【发明者】王成明, 张继垒, 陆光武, 张毅 申请人:扬州大学