烟草鲨烯环氧酶蛋白、烟草鲨烯环氧酶基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟草鲨烯环氧酶蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。烟草鲨烯环氧酶基因NtSE是烟草甾醇合成途径的关键调控基因。在幼嫩组织中特异高表达，将构建好的病毒介导的基因沉默载体TRV-NtSE接种本氏烟草，并得到高沉默效率的植株，检测本氏烟草中植物甾醇的含量，发现基因沉默植株中甾醇含量显著下降，下降了21.37%，表明沉默该基因可以显著的降低植物的甾醇含量。烟草鲨烯环氧酶基因NtSE是烟草甾醇合成途径的关键调控基因，可用于调节烟草的甾醇含量，有助于低甾醇优质烟草的基因工程育种。
【专利说明】烟草鲨烯环氧酶蛋白、烟草鲨烯环氧酶基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及烟草留醇合成及调控关键基因，特别是涉及烟草鲨烯环氧酶基因在减低烟草留醇含量上的应用。
【背景技术】
[0002]烟草是双子叶植物纲管花目茄科烟草属植物。烟草属(Nicotiana)有60多个种，2个栽培种中普通烟草(又称红花烟草，Nicotiana tabacum)占据主要面积，黄花烟草(Nicotiana rustica)的面积很小。栽培烟草按烟叶品质特点、生物学性状和栽培调制方法等可分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟和黄花烟六个类型，其中烤烟是栽培最广的普通烟草。我国烤烟种植面积和总产量均居世界第一位。作为一种叶用经济作物，烤烟的栽培技术有别于其它大田作物，不仅要求有一定的烟叶产量，而且更注重烟叶品质。烟叶品质决定烟叶的可用性，直接影响卷烟商品的色、香、味和商品价值，也关系到烟农的经济效益，是烟草行业的生命和出发点。为使在未来的国内外市场竞争中立于不败之地，满足国内外卷烟企业对优质烟叶不断增长的需求，必须提高烟叶品质和安全性。
[0003]植物留醇是烟草中一类重要的化合物，归属于脂类化合物，其基本结构是环戊烷多菲碳架。烟草中主要含有胆固醇，菜籽留醇，豆留醇和谷留醇，麦角留醇和菜油甾醇也少量存在。研究表明烟草的己烷萃取物(留醇、三萜等)是卷烟烟气致癌物多环芳烃的主要前体物之一。由于留醇的结构中都含有羟基，热解时其母体的四轮环戊烯[α]菲环结构可形成稠环芳烃，因此烟草中的留醇是一种潜在的影响人体健康的物质，所以降低烟草成熟叶片中留醇含量也是卷烟降焦减害的有效途径之一，目前尚无有效减低烟草中留醇含量的有效方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于寻找调控烟草留醇含量的功能基因，进而提供一种降低烟草甾醇含量的方法，为低留醇烟草育种提供技术手段。
[0005]本发明的技术方案是:一种烟草鲨烯环氧酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0006]一种烟草鲨烯环氧酶基因，编码权利要求1所述烟草鲨烯环氧酶蛋白的基因。
[0007]一种烟草鲨烯环氧酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0008]所述烟草鲨烯环氧酶基因的特异性核酸片段是序列表中SEQ ID Ν0:2的第629-1127位核苷酸序列。
[0009]所述的烟草鲨烯环氧酶基因在减低烟草留醇含量中的应用。通过转基因技术或瞬时表达技术干扰、沉默、或敲出所述烟草鲨烯环氧酶，获得留醇含量减低的烟草转化植株。构建所述烟草鲨烯环氧酶基因的病毒诱导沉默载体或RNAi干涉载体并转化烟草，获得甾醇含量减低的转基因烟草 。所述烟草鲨烯环氧酶基因的病毒诱导基因沉默载体和RNAi载体通过下述方法构建:以所述烟草鲨烯环氧酶蛋白基因的特异性核苷酸片段作为引导序列，将该特异性核酸片段以正反两个方向插入到植物表达载体中。
[0010]对于栽培种烟草鲨烯环氧酶基因进行了克隆，并利用病毒诱导的基因沉默手段进行功能分析，为优质烟草的基因工程育种提供新的策略和工具。
[0011]本发明研究发现，烟草中鲨烯环氧酶基因是烟草留醇合成途径的关键调控基因，通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)的技术，在烟草中干扰其表达，获得基因沉默植株，检测发现这些基因沉默植株中留醇含量相对于对样品含量显著下降。鉴于该基因的应用价值及其利用潜力的应用前景，有必要通过专利加以保护。
[0012]本发明提供的用于减低留醇含量的基因编码烟草鲨烯环氧酶，来源于烟草(Nicotiana tabacum),命名为NtSE,编码下述蛋白质(i)或(ii):
(i)序列表中的SEQID NO:I所不氣基酸序列的蛋白质；
(ii)序列表中的SEQID NO:1所示氨基酸学列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺少或添加而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与(i)所述蛋白质相同的功能。
[0013]序列表中的SEQ ID NO:1序列由531个氨基酸残基组成，其中第5位至第27为氨基酸残基是跨膜结构域，所述取代、缺少或添加的一至十个氨基酸残基可以是上述结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。对氨基酸残基进行取代、缺少或添加，以及对相对功能的检测可以通过本领域的常规技术来实现。
[0014]本发明的烟草鲨烯环氧酶SE基因NtSE可以是cDNA序列，也可以是基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。例如序列表中SEQ ID NO:2所示的DNA序列。
[0015]通过同源克隆的方法，根据高等植物中的鲨烯环氧酶基因序列，以栽培种烟草叶片的总RNA反转录的cDNA为材料，设计引物克隆了 NtSE的ORF全长1596bp序列(SEQ IDNO:2),其编码的蛋白序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，序列结果分析表明，该蛋白含有同源性很高，高度保守。其次利用通过real-time PCR发现该基因是在烟草各个组织中都表达，在烟草幼嫩组织中特异高表达。
[0016]本发明的有益效果是:通过病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)技术构建了 NtSE基因的VIGS载体，成功获得了抑制NtSE在本氏烟草中的沉默植株，所获得的沉默植株拥有甾醇含量相对对照植株明显降低的特异表型。可见，利用基因沉默技术或敲出NtSE基因能够获得留醇含量降低的基因沉默植株，这使得低留醇含量烟草育种成为可能，为降低烟草甾醇含量提供了一种有效的技术手段。
[0017]烟草鲨烯环氧酶基因是烟草留醇合成途径的关键调控基因。在幼嫩组织中特异高表达，将构建好的病毒介导的基因沉默载体TRV-NtSE接种本氏烟草，并得到高沉默效率的植株，检测本氏烟草中植物留醇的含量，发现基因沉默植株中留醇含量显著下降，下降了 21.37%，表明沉默该基因可以显著的降低植物的留醇含量。烟草鲨烯环氧酶基因财见是烟草留醇合成途径的关键调控基因，可用于调节烟草的留醇含量，有助于低留醇优质烟草的基因工程育种。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为不同组织中NtSE的相对表达量；
图2为基因沉默植株中的NtSE基因的相对表达量；图3为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的主要甾醇含量。
【具体实施方式】
[0019]一种烟草鲨烯环氧酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0020]一种烟草鲨烯环氧酶基因，编码权利要求1所述烟草鲨烯环氧酶蛋白的基因。
[0021]一种烟草鲨烯环氧酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0022]所述烟草鲨烯环氧酶基因的特异性核酸片段是序列表中SEQ ID NO:2的第629-1127位核苷酸序列。
[0023]所述的烟草鲨烯环氧酶基因在减低烟草留醇含量中的应用。通过转基因技术或瞬时表达技术干扰、沉默、或敲出所述烟草鲨烯环氧酶，获得留醇含量减低的烟草转化植株。构建所述烟草鲨烯环氧酶基因的病毒诱导沉默载体或RNAi干涉载体并转化烟草，获得甾醇含量减低的转基因烟草。所述烟草鲨烯环氧酶基因的病毒诱导基因沉默载体和RNAi载体通过下述方法构建:以所述烟草鲨烯环氧酶蛋白基因的特异性核苷酸片段作为引导序列，将该特异性核酸片段以正反两个方向插入到植物表达载体中。
[0024]首先，选择此基因中较特异的一段核算片段(序列表SEQ ID NO:2的第629位-第1127位核苷酸序列)为VIGS的引导序列，设计引物获得此序列。然后将此核算片段插入VIGS载体中，构建TRV-NtSE载体。
[0025]本氏烟草种植时间及地点:2013年9月，郑州。
[0026]具体沉默步骤如下:
(1)烟草种子播种于育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵(10cmXIOcm)中，于22°C，16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等；
(2)生长4-5w，选取长势一致将含有TRV1、TRV2、TRV2-SS农杆菌单菌落接入YEB(5ml)培养基中(含相应抗生素)，28°C、250 r/min过夜振荡培养至OD约为1.0 ；
(3)测OD值，计算亚培养需要的菌液体积X值，并吸取X体积的菌液接入50ml YEB中，内含10 mmol/L2-N-吗琳基乙横酸(MES)和20 μ 1/L乙駄丁香丽(acteosyringone,As)，即在 50 mlYEB 加入 5 ml As, 500 ml MES，50 ml antibiotic，28°C 过夜振荡培养至 OD约为 0.2-2.0 ；
(4)测OD 值，计算加入的 MMA(10 mmol/L MgCl2,10 mmol/L MES 和 IOOmmoI/LAS)的量Y值，调整悬浮液的浓度0D600=2.0,4000 r/min离心8 min收集农杆菌到50 ml离心管中，倒出上清，向各菌体中加入MMA，再在TRV2、TRV2-SS MMA悬浮液中等体积加入TRVl的MMA悬浮液混匀，室温静止I h后即可接种，挑选长势一致，约4-5片叶子的烟草植株，用Iml无针头无菌注射器通过压滤法把含有不同TRV重组质粒的农杆菌悬浮液从叶片背面压入全部展开的叶片中，使菌液充满整个叶片，于22°C，75%空气湿度中培养。
[0027]试剂配制方法:
(1)LB 液体培养基(IL):10 g 细菌蛋白胨(bacteriological peptone) ; 10 g 氯化钠(NaCl) ；5 g酵母抽提物(yeast extract),高温高压灭菌； (2)YEB液体培养基(IL):5 g牛肉浸膏(beef extract) ；5 g细菌蛋白胨(bacteriological peptone) ；5 g 鹿糖(sucrose) ;1 g 酵母抽提物(yeast extract) ；2 mlIM硫酸镁(MgSO4),高温高压灭菌；(3)IM 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)储备液:ddH20溶解，过滤灭菌，_20°C储存备用；
(4)200 mM乙酰丁香酮(Acetosyringone)储备液:二甲基亚砜(DSMO)溶解，_20°C储存备用；
(5)MMA(1L):20 g 鹿糖(sucrose);5 g MS salts (Duchefa Biochemie)；1.95 g MES ；I ml乙酰丁香酮(200 mM，)；ΡΗ:5.6，现配现用。
[0028]TRV-NtSE 载体信息:
表1 S烯环氧酶(squalene monooxygenase, SE)基因沉默载体构建引物信息
【权利要求】
1.一种烟草鲨烯环氧酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一种烟草鲨烯环氧酶基因，编码权利要求1所述烟草鲨烯环氧酶蛋白的基因。
3.一种烟草鲨烯环氧酶基因，其碱基序列如SEQ ID N0:2所示。
4.如权利要求2所述的烟草鲨烯环氧酶基因，其特征在于:所述烟草鲨烯环氧酶基因的特异性核酸片段是序列表中SEQ ID NO:2的第629-1127位核苷酸序列。
5.如权利要求2或3或4所述的烟草鲨烯环氧酶基因在减低烟草留醇含量中的应用。
6.如权利要求5所述的烟草鲨烯环氧酶基因的应用，其特征在于:通过转基因技术或瞬时表达技术干扰、沉默、或敲出所述烟草鲨烯环氧酶，获得留醇含量减低的烟草转化植株。
7.如权利要求6所述的烟草鲨烯环氧酶基因的应用，其特征在于:构建所述烟草鲨烯环氧酶基因的病毒诱导沉默载体或RNAi干涉载体并转化烟草，获得留醇含量减低的转基因烟草。
8.如权利要求7所述的烟草鲨烯环氧酶基因的应用，其特征在于:所述烟草鲨烯环氧酶基因的病毒诱导基因沉默载体和RNAi载体通过下述方法构建:以所述烟草鲨烯环氧酶蛋白基因的特异性核苷酸片段作为引导序列，将该特异性核酸片段以正反两个方向插入到植物表达载体中 。
【文档编号】C12N9/02GK103805576SQ201410062817
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月24日 优先权日:2014年2月24日
【发明者】陈千思, 周会娜, 刘萍萍, 王燃, 翟妞, 金立锋, 魏春阳, 陈霞, 李锋, 杨军, 林福呈, 郑庆霞 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院