一组快速检测牛、羊赤羽病病毒的等温扩增引物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一组快速检测牛、羊赤羽病病毒的等温扩增引物及其应用。所述引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～4所示。本发明以样品RNA反转录获得的cDNA为模板，利用上述引物进行环介导等温扩增检测，反应结束后，可通过两种方式判断结果：一是扩增产物进行电泳，出现特异阶梯状条带的样品判定为阳性；二是通过向反应体系中加入钙黄绿素，通过肉眼判断，出现颜色变化的样品判定为牛、羊赤羽病病毒阳性。本发明利用所述引物检测牛、羊赤羽病病毒的等温扩增方法对仪器设备要求低、快速、安全、特异性好、敏感性强，为畜牧业牛、羊赤羽病的检测，尤其是基层检疫单位对牛羊的快速检测工作提供了技术支持，具有非常好的推广应用价值。
【专利说明】—组快速检测牛、羊赤羽病病毒的等温扩增引物及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于病毒分子生物学检测【技术领域】。更具体地，涉及一组快速检测牛、羊赤羽病病毒的等温扩增引物及其应用。
【背景技术】
[0002]赤羽病(Akabane disease, AKAD)又名阿卡斑病，是由赤羽病病毒(Akabanevirus,AKAV)引起的牛、绵羊和山羊的一种多型性病毒传染病。该病的病症主要有流产、早产、死胎、胎儿畸形、木乃伊等，能引起先天性关节弯曲和积水性无脑综合症。该病为虫媒性传染病，传播媒介为吸血的蚊、库蠓等。赤羽病是世界动物卫生组织(OIE)法定通报性疾病，也是我国从国外进口牛、羊必须检测的7种疫病之一。研究表明，该病在我国进口牛、羊的主要国家存在，因此有随着牛、羊进口引进该病的风险。如果该病随着大量牛、羊的进口传入我国，将给我国畜牧业造成严重的经济损失。
[0003]由于感染动物早期一般不出现临床症状，该病在8~9月份发生流产及早产，且数量激增，至10月份为最高峰，往往被误认为是由热应激引起，不易在感染早期发现。因此，及早发现牛、羊群是否感染赤羽病病毒，是减少生产损失的有效途径。由于感染早期动物体内的病毒复制有限，不易检测，因此感染早期的动物往往检测不出来。 [0004]为防治和消灭牛、羊赤羽病，首先必须迅速、准确地检测出赤羽病病毒。经过几十年的努力，赤羽病检测技术从最早的病毒分离鉴定到血清学试验，目前已发展为更敏感、更特异、更方便、更经济的分子生物学检测技术。张吉红等根据GenBank中赤羽病病毒的基因序列，设计了特异性引物和探针，建立了检测赤羽病病毒的Real-time RT-PCR方法，检测下限达到1.18ng/^L，但该方法需要使用昂贵的实时定量PCR仪，不利于在基层检测单位中推广和使用。2011年，鱼海琼等根据GenBank中赤羽病病毒的S基因保守序列，设计了特异性引物，建立了赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法，但其核酸检测极限仅为1.08 ng/^L，敏感性未达到更优水平，一定程度上仍然满足不了对感染早期牛、羊群准确检测的要求。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有检测牛、羊赤羽病病毒方法不够灵敏、成本高等技术不足，提供一种安全、简单、快速、敏感性更好的环介导等温扩增检测牛、羊赤羽病病毒的方法。
[0006]本发明的目的是提供一组快速检测牛、羊赤羽病病毒的等温扩增引物。
[0007]本发明另一目的是提供一种利用所述引物进行环介导等温扩增来检测牛、羊赤羽病病毒的方法。
[0008]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明提供了一组快速检测牛、羊赤羽病病毒的等温扩增引物组，所述引物组包括一对外引物和一对内引物；所述外引物为F3和B3，核苷酸序列如SEQ ID N0.1~2所示；所述内引物为FIP和BIP，核苷酸序列如SEQ ID N0.3~4所示。[0009]所述引物是根据GenBank中赤羽病病毒的S基因保守序列,利用PrimerExplorerV4 (https: //primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index, html)基因分析软件设计，所有引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。
[0010]本发明还提供了一种检测牛、羊赤羽病病毒核苷酸的方法，该方法是以样品cDNA为模板，利用引物F3和B3、FIP和BIP进行环介导等温扩增反应；
所述扩增反应结果的阳性判定方法为:将扩增产物进行凝胶电泳，如果出现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有牛、羊赤羽病病毒核酸，即为牛、羊赤羽病病毒阳性；
或者所述扩增反应结果的阳性判定方法为:扩增反应结束后，向反应产物加入钙黄绿素，如果反应产物出现由橘红色变为浅绿色的颜色变化，则判定样品中含有牛、羊赤羽病病毒核酸，即该样品为牛、羊赤羽病病毒阳性；如反应体系维持橘红色，说明了样品RNA中不含有牛、羊赤羽病病毒核酸，即该样品为牛、羊赤羽病病毒阴性。
[0011]其中，所述样品cDNA的获得是按照TIANGEN核酸提取试剂盒的说明书进行操作，提取病毒RNA，再经过反转录得到。
[0012]所述环介导等温扩增反应的反应体系如下:
Bst DNA 聚合酶(8U/μ L)I μ L ；
Bst DNA聚合酶缓冲 液(10 X ) 2.5μ L ；
模板2 μ L ;
MgS04 (25mmol/yL)2.5 μ L ；
Betaine (0.4mol/μ L)2.5 μ L ；
dNTP (25mmol/yL)2.5 μ L ；
BIP/FIP (20pmol/μ L)2μ L ；
F3/B3 (10pmol/yL)0.5 μ L ；
H2O9.5yL。
[0013]所述环介导等温扩增反应的反应条件如下:63°C 55min,98°C lmin。
[0014]所述凝胶电泳是使用质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶，恒压120V电泳20~30min。
[0015]所述加入2.5yL钙黄绿素后，25°C静置5min。
[0016]本发明建立的检测牛、羊赤羽病病毒cDNA的RT-LAMP方法，仅采用两对引物，即外引物和内引物即可完成。检测结果可通过肉眼判断，并且颜色反应使用的钙黄绿素价格便
宜、易得。
[0017]本发明利用所述等温扩增引物进行环介导等温扩增检测牛、羊赤羽病病毒的方法的原理的如下:
(I)引物组成:该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，且可在等温条件进行扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率高，可在15~60min扩增IO9~101°倍；特异性高,祀基因序列的检测可只通过扩增产物的有、无来判定。有、无扩增反应是利用电泳的阶梯型条带来判断的，本发明在反应结束后，加入钙黄绿素可实现扩增结果的可视化。
[0018](2)扩增原理:DNA在65°C左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。在链置换型DNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2区段的3’末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补，以3’末端为起点，通过链置换型DNA聚合酶的作用，一边置换之前FIP引物合成的DNA链，一边合成自身DNA，如此向前延伸。最终F3引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。由FIP引物先合成的DNA链被F3弓丨物进行链置换产生一条单链，这条单链在5’末端存在互补的Flc和Fl区段，发生自我碱基配对，形成环状结构。同时，BIP引物同该单链杂交结合，以BIP引物的3’端为起点，合成互补链，在此过程中环状结构被打开。接着，类似于F3、B3引物从BIP引物外侧插入，进行碱基配对，以3’端为起点，在聚合酶的作用下，合成新的互补链。通过上述两过程，形成双链DNA。而被置换的单链DNA两端存在互补序列，自然发生自我碱基配对，形成环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构。该结构是环介导等温扩增法基因扩增循环的起始结构。至此为止的所有过程都是为了形成环介导等温扩增法基因扩增循环的起点结构。环介导等温扩增法基因扩增循环:首先在哑铃状结构中，以3’末端的Fl区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，FIP引物F2与环上单链F2c杂交，启动新一轮链置换反应。通过此过程，结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构，直至完成模板的复制扩增。
[0019]本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一组快速检测牛、羊赤羽病病毒的环介导等温扩增引物及检测方法。所述引物特异性强、灵敏度更好、且具有很好的重复性。本发明利用所述引物进行环介导等温扩增反应检测牛、羊赤羽病病毒方法的检测下限为2.71X10_5yg/yL，敏感性比普通RT-PCR提高了 10倍，很好地解决了敏感性问题。且本发明无需环引物LoopB和LoopF即可很好地完成样品的环介导等温扩增引物，有效地缩短了检测反应时间、增加了反应的特异度。
[0020]本发明仅需使用简单的恒温仪器就能完成全部的检测，并且检测时间仅为56min，比普通的RT-PCR提前了 2~ 3h，简单快速、对环境要求低、无需大型仪器，非常适合在基层检测单位中使用。
[0021]另外，本发明可以通过加入钙黄绿素实现扩增反应结果的可视化，准确可靠，无需电泳检测，不使用溴化乙锭，保障了工作人员的安全，为畜牧业牛、羊赤羽病的检测，尤其是进境牛、羊的赤羽病检疫工作提供了技术支持，具有非常好的推广应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为环介导等温扩增牛、羊赤羽病病毒的结果图；1、2、3为牛、羊赤羽病病毒，M为DNA分子量标记，N为阴性对照。
[0023]图2为普通RT-PCR扩增牛、羊赤羽病病毒的敏感性结果；1~6分别为2.71 μδ/μ?的cDNA稀释10' 10' 10' 10' 10' IO-6倍的稀释液，M为DNA分子量标记，N为阴性对照。
[0024]图3为环介导等温扩增牛、羊赤羽病病毒的敏感性结果；1~6分别为2.7?μδ/μ?的cDNA稀释10—1、10_2、10' 10_4、10_5、10_6倍的稀释液，M为DNA分子量标记，N为阴性对照。
[0025]图4为环介导等温扩增检测牛、羊赤羽病病毒的特异性结果；图中I为牛、羊赤羽病病毒，2为牛传染性鼻气管炎病毒，3牛病毒性腹泻病毒，4为蓝舌病病毒，N为阴性对照。
[0026]图5为环介导等温检测牛、羊赤羽病病毒的可视化检测的效果图；图中P为牛、羊赤羽病病毒，N为阴性对照。
【具体实施方式】
[0027]以下结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本【技术领域】常规试剂、方法和设备。
[0028]除非特别说明，本发明使用的试剂和试剂盒均为市购。
[0029]以下实施例中使用的牛、羊赤羽病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和蓝舌病病毒核酸均由澳大利亚麦克阿瑟农业研究所惠赠。
[0030]实施例1引物的设计与合成
根据赤羽病病毒S基因保守片段序列，利用PrimerExplorer V4 (https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index, html)基因分析软件，设计了两对特异的外引物和内引物，无需设计环引物。所述外引物为F3和B3，核苷酸序列如SEQ ID N0.1~2所示；所述内引物为FIP和BIP，核苷酸序列如SEQ ID N0.3~4所示。
[0031]SEQ ID N0.1 (F3):
5’ - TGCAAATCCAGTGTCAGACA-3’ ；
SEQ ID N0.2 (B3):
5’ - GGGGCAAATCCCAGGTAC-3’ ；
SEQ ID N0.3 (FIP):
5’- CTTGCACTGCTCAGCAACCCATGCCTTTACGCTTCACCG-3’ ；
SEQ ID N0.4 (BIP):
5’- GCAGAGGCAGCTGCCACAATTGCATACCCCGTCACTCCAG-3’ 。
[0032]所有引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。
[0033]实施例2模板的制备 1、病毒RNA提取
将牛、羊赤羽病病毒(病毒由澳大利亚麦克阿瑟农业研究所惠赠)经细胞培养繁殖后，取200 μ L培养液加入到干净的1.5mL离心管中，按照TIANGEN核酸提取试剂盒的说明书进行操作，提取病毒RNA。
[0034]病毒RNA直接进行反转录或者-20°C冻存备用。
[0035]2、反转录
参照宝生物(大连)有限公司的Reverse Transcriptase XL (AMV)反转录酶使用说明书，进行目的基因cDNA第一链合成(RT)。在20 μ L的反转录体系中加入如下成分:
5 X AMV Buffer4 μ L ;
dNTPs (10pmol/yL)2μ L ；
反转录引物(30pmol/μ L)I μ L ；
Rnasin (20U)I μ L ；
病毒 RNA11.5μ L ；
AMV RTase (5U)I μ L。
[0036]混匀后置于42°C水浴lh，反应产物置于_20°C保存或立即进行PCR扩增。[0037]实施例3环介导等温扩增反应体系的建立
1、通过大量的实验探索，建立了一个最优的环介导等温扩增反应体系及反应条件。
[0038]所述最优反应体系的具体成分及含量如下(25 μ L):
Bst DNA 聚合酶(8U/μ L)I μ L ；
Bst DNA聚合酶缓冲液(10 X ) 2.5μ L ；
模板2 μ L ;
MgS04 (25mmol/yL)2.5 μ L ；
Betaine (0.4mol/μ L)2.5 μ L ；
dNTP (25mmol/yL)2.5 μ L ；
BIP/FIP (20pmol/μ L)2μ L ；
F3/B3 (10pmol/yL)0.5 μ L ；
H2O9.5yL。
[0039]反应条件如下:63°C55min,98°C lmin。
[0040]反应结束后进行电泳检测，恒压120V电泳20~30 min，观察结果。 [0041]2、扩增结果
本实施例利用所述反应体系及反应条件，以牛、羊赤羽病病毒cDNA为模板进行环介导等温扩增反应。结果显示，三个重复扩增的产物，均出现了典型的特异性阶梯状条带(如附图1所示)，阴性对照无条带，说明上述体系能够成功的扩增出赤羽病病毒的基因。且整个环介导等温扩增过程只需56分钟即可完成。
[0042]实施例4环介导等温扩增反应体系的敏感性
1、模板cDNA
根据分光光度法测定，牛、羊赤羽病病毒cDNA的浓度为2.71 μ g/μ?。
[0043]2、模板的稀释
将cDNA依次作10倍梯度稀释，分别作为I号、2号、3号、4号、5号、6号，然后每个稀释液做为模板。
[0044]3、普通 RT- PCR
以上述各梯度稀释液为模板，进行RT-PCR扩增，反应结束，进行凝胶电泳检测。
[0045]4、环介导等温扩增反应
以上述各梯度稀释液为模板，利用实施例3所述反应体系，进行环介导等温扩增反应，反应结束进行凝胶电泳检测。
[0046]结果表明，普通RT-PCR扩增:1号到4号都有特异性的带出现，5，6号未见目的带(如附图2所示)，PCR扩增的敏感性是2.71 X 10_4 Ug/μ L0
[0047]以本发明提供的引物进行环介导等温扩增，I号至5号都出现了特异性阶梯状条带(如附图3所示)，可见敏感性比PCR提高10倍，达到了 2.71 X 10_5 μ g/ μ L。
[0048]实施例5环介导等温扩增反应的特异性
分别以牛、羊赤羽病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、蓝舌病病毒(BLUV)为模板，同时设立阴性对照，采用实施例3优化的反应体系和反应条件，检测所建立环介导等温扩增方法的特异性。
[0049]结果如附图4所示，使用上述体系进行的环介导等温扩增反应，除牛、羊赤羽病病毒出现明显的特异性梯状条带，其他样品没有出现电泳条带，表明本发明所述引物组合环介导等温扩增反应体系能特异性的扩增赤羽病病毒的基因，对牛、羊赤羽病病毒具有专一性，可很好地区分与牛、羊赤羽病症相似的一些疾病。
[0050]实施例6环介导等温扩增反应的可视化
本发明所述环介导等温扩增反应可以提高添加钙黄绿素(DNA荧光染料，橘红色)进行可视化观察。根据实施例3的反应体系和反应条件进行环介导等温扩增反应，反应结束后，在扩增反应产物中添加2.5μ L钙黄绿素，室温放置5min，观察结果，阳性产物呈现出由橘红色变为浅绿色的颜色变化。同时使用琼脂糖凝胶电泳技术对产物进行分析，验证上述可视化的可靠性。
[0051]结果显示，环介导等温扩增反应结束后，在反应产物中加入钙黄绿素，阳性管可观察到由橘红色变为浅绿色的现象；空白对照或其它毒株DNA则仍然为橘红色，不发生颜色变化(如附图5所示)。
[0052]同时，电泳结果显示，可视化呈现阳性的样品，电泳结果均呈现特异性阶梯状条带；而可视化呈现阴性的样品，电泳结果均无条带，表明本发明所述环介导等温扩增反应结束后加入钙黄绿素即可根据颜色变化来判定阳性的方法是可靠的。
[0053]实施例7环介导等温扩增反应的重复性
以实施例3建立的反应体系重复对实施例2获得的梯度稀释的模板进行环介导等温扩增检测，结果显示，重复3次的结果一致(如附图1所示)，阳性模板全部都可扩增出典型的特异性阶梯状条带，无模板的阴性对照扩增后不出现条带，表明本发明所述的引物，以及环介导等温扩增反应体系具有 很好的重复性。SEQUENCE LISTING<110>广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心〈120〉一组快速检测牛、羊赤羽病病毒的等温扩增引物及其应用〈130〉
〈160〉 4
<170> PatentIn ver sion 3.3
〈210〉I
〈211〉20
〈212〉DNA〈213〉引物 F3
〈400〉 I
tgcaaatcca gtgtcagaca20
〈210〉 2〈211〉 18〈212〉 DNA〈213〉引物 B3
〈400〉 2
ggggcaaatc ccaggtac18
〈210〉3
〈211〉39
〈212〉DNA〈213〉引物 FIP
〈400〉 3
cttgcactgc tcagcaaccc atgcctttac gcttcaccg39〈210〉4
〈211〉40
〈212〉DNA〈213〉引物 bip〈400〉 4
gcagaggcag ctgccacaat tgcatacccc gtcactccag40
【权利要求】
1.一组快速检测牛、羊赤羽病病毒的等温扩增引物组，其特征在于，所述引物组包括一对外引物和一对内引物；所述外引物为F3和B3，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1~2所示；所述内引物为FIP和BIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3~4所示。
2.一种检测牛、羊赤羽病病毒的等温扩增方法，其特征在于，该方法是以样品cDNA为模板，利用引物F3和B3、FIP和BIP进行环介导等温扩增反应； 所述扩增反应结果的阳性判定方法为:将扩增产物进行凝胶电泳，如果出现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有牛、羊赤羽病病毒核酸，即为牛、羊赤羽病病毒阳性； 或者所述扩增反应结果的阳性判定方法为:扩增反应结束后，向反应产物中加入钙黄绿素，如果反应产物由橘红色变为浅绿色，则判定样品中含有牛、羊赤羽病病毒核酸，即该样品为牛、羊赤羽病病毒阳性。
3.根据权利要求2所述检测牛、羊赤羽病病毒的等温扩增方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应的反应体系如下: Bst DNA 聚合酶(8U/μ L)I μ L ； Bst DNA聚合酶缓冲液(10 X ) 2.5μ L ； 模板2 μ L ; MgS04 (25mmol/yL)2.5 μ L ； Betaine (0.4mol /μ L)2.5 μ L ； dNTP (25mmol/yL)2.5 μ L ； BIP/FIP (20pmol/yL)2μ L ； F3/B3 (10pmol/yL)0.5 μ L ；H2O9.5yL。
4.根据权利要求2所述检测牛、羊赤羽病病毒的等温扩增方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应的反应条件如下:63°C反应55min，98°C反应lmin。
5.根据权利要求2所述检测牛、羊赤羽病病毒的等温扩增方法，其特征在于，所述凝胶电泳是使用质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶，恒压120V电泳20~30 min。
6.根据权利要求2所述检测牛、羊赤羽病病毒的等温扩增方法，其特征在于，所述加入钙黄绿素后，25 °C静置5min。
【文档编号】C12Q1/68GK103834746SQ201410070988
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】鱼海琼, 贾坤, 罗长保, 赵吟, 田纯见, 吴晓薇, 陈芳, 罗琼, 刘志玲, 张敏 申请人:广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心