一种用于检测海产品中九种致病性弧菌的基因芯片的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测海产品中九种致病性弧菌的基因芯片及其试剂盒。该基因芯片包括固相载体和寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含从以下核苷酸序列中选取的一种或多种：1）从霍利斯弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、弗尼斯弧菌、拟态弧菌和海鱼弧菌基因中选取的DNA序列；2）上述1）中选取的DNA序列的互补DNA序列；3）上述1）或2）中选取的DNA序列的互补RNA序列。所述试剂盒包含上述的基因芯片。利用本发明的基因芯片及试剂盒检测海产品中九种致病性弧菌，操作简便，灵敏度好，重复性强。
【专利说明】—种用于检测海产品中九种致病性弧菌的基因芯片
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物分子检测技术【技术领域】，尤其涉及一种检测海产品中九种致病性弧囷的基因芯片。
【背景技术】
[0002]浙江省是海洋大省，海产品种类极其丰富，海鲜产品深受当地民众的喜爱，且很多居民有生食海鲜的习惯。然而，随着海洋环境污染的日益加剧，病原微生物在水产品中大量富集，因食用海水产品而引发的食源性疾病和食物中毒屡屡发生，给人们的生命健康带来了很大的威胁。致病性弧菌是在海产品中最主要的病原微生物，包括霍乱弧菌、拟态弧菌、副溶血性菌、霍利斯性菌、溶藻弧菌、弗尼斯菌、创伤弧菌、美人鱼弧菌、哈维弧菌等九种，上述九种致病性弧菌的致病性差别较大，所致疾病的种类和毒性差别也较大。在这九种致病菌中，最重要的，也是导致发生疾病最多的是01群霍乱弧菌、非01群霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌。
[0003]我国目前对于海产品的病原菌检测、鉴定手段仍停留常规的微生物学检验水平，通常以分离培养、生化试验及血清学试验为主，具有操作复杂、手工劳动量大、检验周期长(6~7天)、特异性不强等缺点，在相当大的程度上限制了对食源性疾病病源海产品的快速检测鉴定能力。并且在判断是否为阳性时只靠实验人员肉眼观察，没有足够可靠的依据，降低实验结果的准确性，不能达到新鲜海产品贮藏时间短、需要快速检测的要求。一些简单的分子生物学的方法如PCR、ELISA都有较高的假阳性结果出现，并且运用PCR和ELISA得出的结果都不能作为最终的检测依据。因此我国有必要建立起海产品致病菌的高通量、快速、准确的监测体系，以确保在相对较短的时间内正确判定海产品的安全性，这是有效地预防和控制食源性疾病的重要前提。只有这样才能在一定程度上提前消除由于海产品中的致病菌所造成的危害，提高我国食源性疾病的检测和控制能力。
【发明内容】
`
[0004]本发明的目的是提供一种检测海产品中九种致病性弧菌的基因芯片及其试剂盒，以弥补传统常见海产品致病菌检测技术存在的费时耗力的缺陷，扩展病原菌检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。
[0005]本发明提供的用于检测海产品中九种致病性弧菌的基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的，用于检测霍乱弧菌、拟态弧菌、副溶血性菌、霍利斯性菌、溶藻弧菌、弗尼斯菌、创伤弧菌、美人鱼弧菌、哈维弧菌的寡聚核昔酸探针，其中所述寡聚核昔酸探针是从霍利斯弧菌的16s rRNA基因、溶藻弧菌的16s rRNA和/或toxR基因、霍乱弧菌的gyrB基因、美人鱼弧菌的16s rRNA基因、弗尼斯弧菌的16s rRNA基因、哈维弧菌的16s rRNA基因和/或toxR基因、拟态弧菌的gyrB弧菌、副溶血性弧菌的trh基因、创伤弧菌的16s rRNA基因和/或toxR基因的序列中设计的；
[0006]其中所述用于检测霍利斯性菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1-2 ；[0007]所述用于检测美人鱼弧菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3-12 ；
[0008]所述用于检测霍乱弧菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 13-18 ；
[0009]所述用于检测拟态弧菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 19-21 ；
[0010]所述用于检测弗尼斯菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:22-31 ；
[0011]所述用于检测创伤弧菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:32-54 ；
[0012]所述用于检测哈维弧菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:55-56 ；
[0013]所述用于检测溶藻弧菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:57-66 ；
[0014]所述用于检测副溶血性菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:67-74。
[0015]本发明所述的基因芯片，还包含固定在固相载体上的阳性对照探针、阴性对照探针或荧光探针中的任一种或几种。
[0016]所述的阳性对照探针选在细菌16s rRNA保守区片段或者与其互补的DNA或RNA序列。
[0017]所述阳性对照探针的核苷酸序列为SEQ ID N0:76。
[0018]所述的阴性探针为 SEQ ID NO:77 ；
[0019]荧光探针为SEQ ID NO:75。
[0020]本发明还提供与本发明的芯片配合使用的，用于扩增霍乱弧菌、拟态弧菌、副溶血性菌、霍利斯性菌、溶藻弧菌、弗尼斯菌、创伤弧菌、美人鱼弧菌、哈维弧菌的检测引物，所述检测引物的序列为SEQ ID NO:78-91 ；
[0021]本发明还提供一种用于检测海产品中九种致病性弧菌的试剂盒，其包含上述的基因芯片及引物。
[0022]本发明将基因芯片技术引入海产品中致病性弧菌检测领域同时检测九种弧菌，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的全新的用于检测海产品中九种致病性弧菌的基因芯片及其试剂盒，利用本发明的基因芯片可以达到检测海产品中九种致病性弧菌的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，可用于医学检验、食品安全检验、进出口检验检疫和流行病学调查。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
[0024]实施例1:探针的设计和制备
[0025]1.序列获得:
[0026]根据目标物种的物种ID号在Genbank数据库中检索该物种所有的序列信息，并下载检索到的全部序列的genbank格式的信息；收集的相关基因见下表1。
[0027]
【权利要求】
1.用于检测海产品中九种致病性弧菌的基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的，用于检测霍乱弧菌、拟态弧菌、副溶血性菌、霍利斯性菌、溶藻弧菌、弗尼斯菌、创伤弧菌、美人鱼弧菌、哈维弧菌的寡聚核昔酸探针，其中所述寡聚核昔酸探针是从霍利斯弧菌的16s rRNA基因、溶藻弧菌的16s rRNA和/或toxR基因、霍乱弧菌的gyrB基因、美人鱼弧菌的16s rRNA基因、弗尼斯弧菌的16s rRNA基因、哈维弧菌的16s rRNA基因和/或toxR基因、拟态弧菌的gyrB弧菌、副溶血性弧菌的trh基因、创伤弧菌的16s rRNA基因和/或toxR基因的序列中设计的； 其中所述用于检测霍利斯性菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1-2； 所述用于检测美人鱼弧菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3-12 ； 所述用于检测霍乱弧菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 13-18 ； 所述用于检测拟态弧菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 19-21 ； 所述用于检测弗尼斯菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:22-31 ； 所述用于检测创伤弧菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:32-54； 所述用于检测哈维弧菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:55-56 ； 所述用于检测溶藻弧菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:57-66 ； 所述用于检测副溶血性菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:67-74。
2.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，在固相载体上还固定有阳性对照探针、阴性对照探针或荧光探针中的任一种或几种。
3.如权利要求2所述的基因芯片，其特征在于所述的阳性对照探针为细菌16srRNA保守区片段或者与其互补的DNA或RNA序列。
4.如权利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述的阳性对照探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:76。
5.如权利要求2所述的基因芯片，其特征在于所述的阴性探针的核苷酸序列为SEQIDN0:77。
6.如权利要求2所述的基因芯片，其特征在于所述的荧光探针的核苷酸序列为SEQIDN0:75。
7.与权利要求1所述的基因芯片配合使用的引物，其特征在于，所述的引物用于从霍乱弧菌、拟态弧菌、副溶血性菌、霍利斯性菌、溶藻弧菌、弗尼斯菌、创伤弧菌、美人鱼弧菌、哈维弧菌中的一种 或几种扩增出核苷酸片段，所述检测引物的序列为SEQ ID N0:78-91。
8.一种用于检测海产品中九种致病性弧菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的基因芯片和权利要求7所述的引物。
【文档编号】C12Q1/04GK103820558SQ201410075018
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月3日 优先权日:2014年3月3日
【发明者】薛超波, 黄朱梁, 王萍亚 申请人:舟山市质量技术监督检测研究院