21个短串联重复序列的复合扩增体系及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及“21个短串联重复序列的复合扩增体系及试剂盒”，用于检测人类基因组中具有多态性的遗传标记基因，属于生物【技术领域】。本发明涉及在一个PCR体系中同时扩增多个短串联重复序列，具体基因座为20个具有高度遗传多态性的短串联重复序列及1个性别决定位点，分别设计引物并标记荧光基团，该体系具有极高的个体识别率和非父排除率，本发明可用于法医个体识别、亲子鉴定以及群体遗传学分析，准确性更高，灵敏度好。
【专利说明】21个短串联重复序列的复合扩增体系及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种荧光标记的复合PCR扩增体系，该体系同时扩增多个人类基因组DNA短串联重复序列(STR)，可以快速准确地进行人类STR分型，进而对法医个体识别和亲子鉴定等提供判断依据。
【背景技术】
[0002]真核细胞基因组中充满了各种重复的DNA序列，广泛存在于染色体着丝粒周围。其中包含2~6个碱基重复单位的DNA区域称为简单序列重复或短串联重复序列(STR)。STR重复单位小，在整个基因组中分布广泛，平均每10000个碱基有一个，并且杂合子个体的两个等位基因在大小上相似，因而易于进行PCR扩增，两个等位基因之间没有差异扩增问题，所以成为广泛使用的DNA重复遗传标记。STR遗传标记的核心序列重复次数在个体间有很大的差异，所以使得STR可以有效地进行人类个体识别。许多学术和商业实验室对大量的STR遗传标记进行了分析，将其应用于疾病基因定位研究、法医个体识别及亲子鉴定等多个方面。
[0003]在法医DNA分型中，使用变异性较高的DNA遗传标记，或联合使用大量多态性较低的DNA遗传标记来获得足够的样本识别能力，都可以进行人类个体识别判断。但是小片段的STR等位基因(100-400bp)更适合于法医领域特殊检材的需求。所以基于生物学和技术方面的原因，STR在法医鉴定方面更有优势。
[0004]为了保证法医DNA分型标记在司法体系中具有有效性，从1996年开始由美国FBI实验室发起倡议,构建CODIS (Combined DNA Index System),选出了 13个核心STR基因座(CSF1P0、FGA、THOU TPOX, vWA, D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11)作为通用的标准遗传标记。在过去的十多年间，一些商业化的STR试剂盒相继面世，为法庭科学提供了可用的STR遗传标记检测方法，并且随着检测技术的飞速发展，检测STR等位基因的方法也 更加灵敏、快速、准确。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种21个短串联重复序列的复合扩增体系及试剂盒，具有4色荧光标记，灵敏度极高，低至0.1ng的DNA模板均可检测获得完整的基因分型图谱。本发明所采用的位点组合，均为CODIS基因座，具有极高的个体识别率和非父排除率，本发明可用于法医个体识别、亲子鉴定以及群体遗传学分析，准确性更高，灵敏性更好。
[0006]短串联重复序列的复合扩增体系，该复合扩增体系中包括20对引物，可同时扩增20 个 STR 位点:D2S441、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、CSF1P0、FGA、Penta D、Penta E、THOU TPOX和vWA，所述的20对引物分别为:
[0007]
【权利要求】
1.短串联重复序列的复合扩增体系，该复合扩增体系中包括20对引物，可同时扩增.20 个 STR 位点:D2S441、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、CSF1PO、FGA、Penta D、Penta E、THOU TPOX和vWA，所述的20对引物分别为: 扩增D19S433的上游引物D19S433-f如SEQ ID NOl所示， 扩增D19S433的下游引物D19S433-r如SEQ ID N02所示； 扩增D5S818的上游引物D5S818-f如SEQ ID N03所示， 扩增D5S818的下游引物D5S818-r如SEQ ID N04所示 扩增D21S11的上游引物D21Sll-f如SEQ ID N05所示 扩增D21S11的上游引物D21Sll-r如SEQ ID N06所示 扩增D18S51的上游引物D18S51-f如SEQ ID N07所示， 扩增D18S51的下游引物D18S51-r如SEQ ID N08所示； 扩增D6S1043的上游引物D6S1043-f如SEQ ID N09所示， 扩增D6S1043的下游引物D6S1043-r如SEQ ID NOlO所示； 扩增D3S1358的上游引物D3S1358-f如SEQ ID NOll所示， 扩增D3S1358的下游引物D3S1358-r如SEQ ID N012所示； 扩增D13S317的上游引物D13S317-f如SEQ ID N013所示， 扩增D13S317的下游引物D13S317-r如SEQ ID N014所示； 扩增D7S820的上游引物D7S820-f如SEQ ID N015所示， 扩增D7S820的下游引物D7S820-r如SEQ ID N016所示； 扩增D16S539的上游引物D16S539-f如SEQ ID N017所示， 扩增D16S539的下游引物D16S539-r如SEQ ID N018所示； 扩增CSFlPO的上游引物CSFlPO-f如SEQ ID N019所示， 扩增CSFlPO的下游引物CSFlPO-r如SEQ ID N020所示； 扩增Penta D的上游引物Penta D_f如SEQ ID N021所示， 扩增Penta D的下游引物Penta D_r如SEQ ID N022所示； 扩增D2S441的上游引物D2S441-f如SEQ ID N023所示， 扩增D2S441的下游引物D2S441-r如SEQ ID N024所示； 扩增vWA的上游引物vWA-f如SEQ ID N025所示， 扩增vWA的下游引物vWA-r如SEQ ID N026所示； 扩增D8S1179的上游引物D8S1179-f如SEQ ID N027所示， 扩增D8S1179的下游引物D8S1179-r如SEQ ID N028所示； 扩增TPOX的上游引物TPOX-f如SEQ ID N029所示， 扩增TPOX的下游引物TPOX-r如SEQ ID N030所示； 扩增Penta E的上游引物Penta Ε-f如SEQ ID N031所示， 扩增Penta E的下游引物Penta Ε-r如SEQ ID N032所示； 扩增THOl的上游引物THO1-f如SEQ ID N033所示， 扩增THOl的下游引物THO1-r如SEQ ID N034所示； 扩增D12S391的上游引物D12S391-f如SEQ ID N035所示，扩增D12S391的下游引物D12S391-r如SEQ ID N036所示； 扩增D2S1338的上游引物D2S1338-f如SEQ ID N037所示， 扩增D2S1338的下游引物D2S1338-r如SEQ ID N038所示； 扩增FGA的上游引物FGA-f如SEQ ID N039所示， 扩增FGA的下游引物FGA-r如SEQ ID N040所示。
2.根据权利要求1所述的复合扩增体系，还包括I对能扩增性别识别位点Amelogenin的引物，所述引物为: 扩增Amel的上游引物Ame1-f如SEQ ID N041所示， 扩增Amel的下游引物Ame1-r如SEQ ID N042所示。
3.根据权利要求2所述的复合扩增体系，所述复合扩增体系中的被扩增位点分别由四种颜色的荧光标记，相同荧光标记视为同一组，四组组合分别为:第一组D19S433、D5S818、D21S11、D18S51 和 D6S1043 ;第二组 Amel, D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSFlPO 和Penta D ;第三组 D2S441、vWA、D8S1179、TPOX 和 Penta E ;第四组 THOU D12S391、D2S1338和 FGA。
4.根据权利要求3所述的复合扩增体系，所述第一组的标记为FAM标记，第二组的标记为HEX标记，第三组的标记为TAMRA标记，第四组的标记为ROX标记。
5.根据权利要求1或2所述的复合扩增体系，所述扩增体系还包括PCR缓冲液、模板DNA和Taq DNA聚合酶。
6.根据权利要求5所述的复合扩增体系，所述PCR缓冲液成分包括:10mM的硫酸铵，IOmM的氯化钾，50mM的pH8.3的Tris-HCl，2mM的镁离子和0.2mM的dNTP，所述Taq DNA聚合酶用量为2U。
7.根据权利要求2所述的复合扩增体系，所述扩增体系扩增时的反应条件为: 第I步:95°C变性11分钟，第2步:94°C变性30秒，第3步60°C退火I分钟，第4步:70°C延伸1分钟，重复2至4步30次，最后60°C延伸60分钟。
8.—种试剂盒，包括权利要求1-7任一复合扩增体系。
9.权利要求1-7任一扩增体系或权利要求8所述的试剂盒在个体识别、亲子鉴定中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103820559SQ201410076618
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月4日 优先权日:2014年3月4日
【发明者】陈初光, 于在亮, 宋欣欣, 付亮剑 申请人:苏州阅微基因技术有限公司, 北京阅微基因技术有限公司