一种带有绿色荧光蛋白基因的ca16感染性克隆及构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆及构建方法和应用。以低拷贝质粒pACYC177为载体，首先插入CA16/GD09/24病毒株的全长cDNA；然后以此全长感染性克隆为骨架，在5’UTR和VP4间插入eGFP报告基因并添加2A蛋白酶切割位点(AITTL)，从而获得带有eGFP报告基因的CA16全长感染性克隆。本发明所构建的带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆可以拯救出具有与重组CA16病毒及亲本CA16生长趋势相似的eGFP-CA16报告病毒，并可以用于抗病毒药物筛选，为深入开展病毒复制与致病机理研究提供了便捷的平台，为今后筛选和开发新型疫苗奠定了坚实的基础。
【专利说明】—种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆及构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆，还涉及该克隆的的构建方法，还涉及利用反向遗传学技术由该克隆拯救出的eGFP-CA16报告病毒的应用。
【背景技术】
[0002]柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16, CA 16)属于小RNA病毒科肠道病毒属，病毒颗粒为立体对称的20面体，呈球形，直径为23~30nm，无包膜和突起，由核酸和衣壳组成。其核酸是全长约为7410个核苷酸的单股正链RNA，基因组由一个开放读码框架(ORF)和5’，3’非编码区(UTR)组成。ORF编码一个多聚前体蛋白，经蛋白酶切水解为P1、P2和P3三个前体蛋白，Pl编码病毒的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP1、VP2、VP3三个多肽暴露在病毒外壳的表面，VP4包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密连接，VPl区长891bp，编码297个氨基酸残基，是病毒主要的中和抗原表位所在区；P2、P3区编码非结构蛋白，包括2A、2B、2C、3A、VPg(3B)、3C和3D。5，，3，非编码区(UTR)分别含有多肽翻译和RNA合成的起始信号，在3’非编码区的末端带有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴(polyA)。
[0003]CA16于1951年首次在南非被成功分离并与肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)成为了引起手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)的最主要病原，主要引起5岁以下婴幼儿出现手、足、口部疱疹、咽峡炎等症状，少数患者可出现心肌炎、无菌性脑膜炎等多种并发症。自1957年首例HFMD在多伦多报道以来，CA16常与EV71交替或共同流行，已造成全球范围内多次大流行。以往研究多认为EV71感染除引起HFMD外还可引起较为严重的并发症，如无菌性脑炎、脑膜炎、肺水肿等，而CA16感染引起的HFMD症状较温和，且并发症的发生率也较低，但近年来，越来越多的报道显示除引起轻症外，CA16感染亦可导致心肌、心包、脑部和肺部等疾病，甚至引发致死性心肌炎、脑干脑炎和肺炎等致死性症状。近几年的流行病学资料显示，中国已成为HFMD高流行区，每年HFMD报告病例数均在100万以上，CA16和EV71引起的HFMD已成为我国的一种严重的公共卫生问题。目前对EV71的相关研究投入较多，EV71的疫苗和药物得到了快速的发展，而对CA16的感染、致病机制等了解较少，缺乏流行病学研究资料，其疫苗和治疗药物的研究也相对滞后，因此深入开展对CA16的研究具有重要意义。
[0004]目前反向遗传学技术已广泛应用于生命科学研究的各个领域，尤其是在RNA病毒的研究方面显示出了巨大的作用。通过构建RNA病毒的全长感染性克隆，按照研究方向和目的，在DNA分子水平上对病毒基因组进行体外操作，再由感染性克隆通过体外转录获取病毒基因组RNAdfM RNA转染病毒敏感细胞中可以拯救出活病毒。通过观察其表型变化，来判断这些操作对病毒的影响，从而为病毒复制机制、致病机理以及新型疫苗的研发等方面提供平台。因此，感染性克隆的构建解决了 RNA病毒基因组难以操作的困扰，为RNA病毒的研究提供了有效的工具。报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。目前，增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因因其检测不需要添加任何底物或辅助因子，不使用同位素，也不需要测定酶的活性，对细胞无毒害作用，具有能在活细胞状态下直接观察等优点被广大科学工作者广泛应用。在全长感染性克隆的基础上，将eGFP报告基因与病毒基因组融合，构建含有报告基因的病毒感染性克隆，拯救出具有感染性的稳定表达报告基因的病毒，通过荧光显微镜观察eGFP的表达情况即可直观指示病毒生长情况。因此，带有报告基因的感染性克隆较不带标签的感染性克隆有着更加便捷的优势。
[0005]本发明提供一种带有绿色荧光蛋白(eGFP)基因的CA16病毒的感染性克隆的构建方法，以及利用反向遗传学技术由该克隆拯救出的eGFP-CA16报告病毒与CA16病毒在生物学特性方面的比较，以及其在抗病毒药物筛选中的应用。本发明所构建的带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆将为深入了解CA16的感染、致病机制，以及其疫苗和治疗药物的研究提供有效的平台，对开展CA16的基础研究和应用研究具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供了一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆pACYC177-eGFP-CA16-FL (其拯救出的病毒简称为eGFP_CA16)，其序列为SEQ ID N0.1所示。本发明所构建的带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆可以拯救出具有与CA16病毒生长趋势相似的eGFP_CA16报告病毒。
[0007]本发明的另一个目的在于提供了一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆eGFP-CA16的构建方法。首先构建CA16全长感染性克隆(pACYC177-CA16_FL)(其拯救出的病毒简称为重组CA16)，在5’UTR和VP4间采用融合PCR的方法加入BsiWI和NotI酶切位点，以及2A蛋白酶切割位点(AITTL)，然后再通过BsiWI和NotI双酶切插入eGFP报告基因，从而获得带有eGFP 报告基因的CA16全长感染性克隆。
[0008]本发明的另一个目的在于提供了一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆在抗病毒药物筛选上的应用。利用反向遗传学技术由该克隆拯救出的eGFP-CA16报告病毒通过荧光显微镜观察eGFP的表达情况即可直观指示药物对病毒的抑制情况，可以作为有效的抗病毒药物筛选平台。
[0009]为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案:
[0010]一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆pACYC177-eGFP-CA16-FL，其构建方法如下:
[0011]1.提取亲本CA16 (CA16/⑶09/24)病毒株基因组RNA ；
[0012]2.CA16/⑶09/24病毒株基因组序列分段扩增:
[0013]以步骤I中的亲本CA16病毒RNA为模版，采用RT-PCR分别获得片段A、B、C和D，四对引物分别为 SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7 ；SEQ ID N0.8和 SEQ ID N0.9 ；SEQ ID N0.10和 SEQ ID N0.11 ；SEQ ID N0.12 和 SEQ ID N0.13 所示。四个片段分别用 AatII 和 SmaI/ClaI插入低拷贝质粒pACYC177载体，质粒均经过DNA测序鉴定为正确序列，分别命名为CA16-A, CA16-B, CA16-C 和 CA16-D ；
[0014]3.含有病毒基因组的CA16cDNA全长感染性克隆的构建:
[0015](1)CA16基因组片段A+B的拼接:用NdeI和SmaI酶切上述步骤2中所得的CA16-A和CA16-B，回收CA16-A的大片段与CA16-B的大片段；将CA16-A的大片段作为载体，CA16-B的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，测序正确的质粒命名为 CA16-AB ；
[0016](2) CA16基因组片段C+D的拼接:用AatII和SphI酶切上述步骤2中所得的CA16-C和CA16-D，回收CA16-C的大片段与CA16-D的大片段；将CA16-D的大片段作为载体，CA16-C的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，测序正确的质粒命名为 CA16-CD ；
[0017](3) CA16基因组全长A+B+C+D的拼接:用AatII和EcoRV酶切上述步骤中所得的CA16-AB和CA16-⑶，回收CA16-AB的大片段与CA16-⑶的大片段；CA16_⑶的大片段作为载体，CA16-AB的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，测序正确的质粒即为拼接完成的含有CA16全长基因组的cDNA质粒，命名为pACYC-CA16-FL。
[0018]4.带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆的的构建:
[0019](I)插入BsiWI和NotI酶切位点，以及2A蛋白酶切割位点(AITTL)的CA16全长感染性克隆的构建:
[0020]①片段T7-5，UTR-Bsiff1-Not1-2A protease cleavage site_VP4 的扩增:以PACYC-CA16-FL 为模板，扩增含有 T7-5’UTR-BsiW1-NotI 的序列，引物为 SEQ ID N0.6 和 SEQID N0.14 所不；扩增含有 NotI_2A protease cleavage site_VP4 的序列，引物为 SEQ IDN0.15和SEQ ID N0.13所示，2A蛋白酶切割位点(AITTL)的序列如SEQ ID N0.4所示，分别回收PCR产物；以上述所得的2段PCR回收产物为模板，扩增含有T7-5 ’ UTR-BsiW1-Not1-2Aprotease cleavage site_ VP4 的序列，引物为 SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.13，回收 DNA 片段；
[0021]②pACYC177-CA16-FL-5’ UTR-Bsiff1-Not1-VP4 克隆的构建:分别用 AatII和 SalI 双酶切片段 T7-5，UTR-Bsiff1-Not1-2A protease cleavage site_VP4 和质粒PACYC-CA16-FL，经过T4DNA连接酶将回收的酶切产物进行连接，测序正确的质粒即为插入BsiffI和NotI酶切位点，以及2A蛋白酶切割位点(AITTL)的CA16全长感染性克隆，命名为pACYC 177-CA16-FL-5，UTR-BsiW1-No11-VP4。
[0022](2) PCR扩增绿色荧光蛋白基因eGFP片段:
[0023]以带有eGFP基因的质粒pEGFPNl为模版，使用PrimeSTAR HS酶，扩增eGFP基因片段，序列为SEQ ID N0.5所示，扩增eGFP的引物为SEQ ID N0.16和SEQ ID N0.17。
[0024](3)将绿色荧光蛋白基因 eGFP 插入载体 pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiW1-NotI_VP4:将 eGFP 和载体 pACYC177-CA16-FL-5’ UTR-Bsiff1-Not1-VP4 分别用 BsiWI 和 NotI 双酶切。经过T4DNA连接酶将回收的酶切产物进行连接，测序正确的质粒即为带有绿色荧光蛋白基因eGFP的CA16感染性克隆，命名为pACYC177-eGFP-CA16-FL，其序列为SEQ ID N0.1所示。
[0025]本发明提供的带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆成功拯救出与重组CA16病毒生长趋势相似的eGFP_CA16报告病毒,其步骤是:
[0026]1、用 MluI 分别对 pACYC177-CA16-FL 及 pACYC177_eGFP-CA16_FL 进行线性化处理，线性化产物经酚氯仿抽提后作为模板，使用体外转录试剂盒MEGA Script T7kit (购自美国Ambion公司)，按照试剂盒说明书分别得到重组CA16的RNA及eGFP_CA16的RNA。[0027]2、体外转录得到的重组CA16的RNA及eGFP_CA16的RNA分别使用脂质体转染的方法转染于每孔放置了三个IOmmX IOmm盖玻片的6孔板中的vero细胞，37°C，5%C02培养箱中培养，并同时设置未转染RNA的细胞为对照组，显微镜下每天观察实验组和对照组的细胞状态，并收集实验组的病毒上清，作为eGFP-CA16病毒与重组CA16病毒转染后不同时间点的病毒样，于_80°C保存。于荧光显微镜下每天观察eGFP-CA16eGFP的表达情况，并分别于转染后24、48、72h后取一个玻片用5%丙酮固定液(购于国药集团化学试剂公司)对细胞进行固定，使用鼠源的CA16VLP多抗进行免疫荧光检测。
[0028]3、于35mm细胞培养皿中接种2 X IO5Vero细胞，在37°C，5%C02培养条件下，待汇合度达到60%时，按照感染复数MOI为0.1，分别向每孔中加入400 μ I稀释后的重组CA16及亲本CA16病毒液，37°C、5%C02培养箱中吸附Ih后，弃病毒液，每孔中加入2ml含2%胎牛血清的DMEM培养基，分别于感染后12、24、36、48h收病毒上清，作为重组CA16及亲本CA16病毒相同感染复数下不同时间点的病毒样，于_80°C保存。
[0029]4.单层噬斑检测转染后不同时间点的重组CA16及eGFP_CA16病毒滴度，以及相同感染复数下不同时间点的重组CA16及亲本CA16病毒的噬斑形态及生长曲线:在24孔细胞培养板的各孔中分别接种I X IO5个Vero细胞，待细胞汇合度达到90%时，弃孔中的培养基，加入100 μ I用含2%FBS的DMEM培养基10倍比稀释的上述步骤3和4收集的病毒，37°C吸附Ih,每15分钟充分晃动一次。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入含有2%FBS的DMEM培养基和2%甲基纤维素的覆盖物，于37°C、5%C02的培养箱中培养3天，待噬斑形成后用含有1%结晶紫和3.7%甲醛的染色液染色,室温处理30min后,取出孔中的染色液,并用流水冲洗孔底，烘干后即可观察噬斑形态并计数。
[0030]一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆eGFP_CA16在抗病毒药物筛选中的应用，其步骤是 :
[0031 ] 选取对亲本CA16有抑制作用的药物NITD008来检测其对重组CA16及eGFP_CA16的抑制作用:
[0032]1.在12孔细胞培养板每孔中接种IXlO5Vero细胞，在37°C，5%C02培养条件下，待汇合度达到60%时，按照感染复数MOI为0.1，分别向每孔中加入200 μ I稀释后的亲本CA16、重组CA16及eGFP-CA16病毒液，37°C、5%C02培养箱中吸附Ih后，弃病毒液，每孔中加入Iml含2%胎牛血清的DMEM培养基；
[0033]2.用DMSO将存储的浓度为20mM的NITD008分别稀释为0、l、2、3、4mM，于孔中分别加入I μ I稀释后的NITD008，即终浓度分别为0、1、2、3、4μ M。37°C、5%C02的培养箱中培养48h，用荧光显微镜观察不同浓度NITD008作用下eGFP的表达情况，并收集亲本CA16、重组CA16及eGFP-CA16病毒上清，用单层噬斑方法检测不同浓度NITD008作用下亲本CA16、重组CA16及eGFP-CA16病毒滴度。
[0034]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
[0035]1、本发明构建的带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆是通过将CA16全长基因组分成4个片段扩增并拼接后克隆到低拷贝质粒pACYC177载体上，所扩增的片段相对较短，不仅避免了长片段扩增的操作难度，还能够更好地保证所扩增片段序列的保真性。用低拷贝质粒PACYC177作为载体，以大肠杆菌感受态HBlOl作为宿主菌，保证了全长感染性克隆的稳定性。同时在全长CDNA5’端非编码区连接T7RNA聚合酶的启动子序列，3’末端添加一个多聚腺苷酸尾巴(Poly(A)27)序列；然后以此全长感染性克隆为骨架，在5’UTR和VP4间插入eGFP报告基因并添加2A蛋白酶切割位点(AITTL)，获得的带有eGFP报告基因的CA16全长感染性克隆可以高效获得正确的病毒RNA，并解决了外源基因插入病毒基因组造成基因组不复制的现象，转录出的RNA转染细胞后，RNA可正常复制，并产生具有感染性的病毒粒子。
[0036]2、本发明中的带有CA16病毒基因组的全长感染性克隆拯救出的重组CA16病毒与亲本CA16病毒具有相似的生物学特性，可以用来开展CA16的相关研究，，同时eGFP-CA16报告病毒感染性克隆拯救出的eGFP_CA16与重组CA16病毒有着相同的生长趋势，eGFP-CA16病毒滴度又与eGFP表达水平相关，随着病毒滴度的增加，eGFP表达水平也在提高，因此，可通过用荧光显微镜直接观察eGFP表达情况即可判断eGFP-CA16的病毒生长情况，继而反映亲本CA16病毒的生长情况。因此，可通过直接观察eGFP的表达情况来替换传统的病毒滴度测定方法，通过eGFP的表达情况来反映病毒生长趋势更加方便快捷、更加经济节约。
[0037]3、通过药物抑制实验，证明本发明中的带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆所拯救出的eGFP-CA16病毒可有效地应用于药物筛选。与传统的药物筛选方法相比，eGFP-CA16病毒可通过直接观察eGFP的表达情况来反映药物作用下病毒的生长趋势，省去了费时费力的各种检测，不仅更加方便快捷、经济节约，还可以用于高通量筛选抗病毒药物，可同时对多种药物抗病毒效果进行快速检测，缩短药物研发周期，是研发出特异性抗CA16病毒药物的有效工具。同时本发明所拯救出的eGFP-CA16病毒含有病毒全长基因组，可形成具有感染性的病毒粒子，不仅可以筛选作用靶点为非结构蛋白的药物，还能筛选出作用靶点为结构蛋白的药物，并可区分出所筛选药物的作用机制是基于病毒的复制过程还是包装过程，最重要的是能够更加真实地反映药物对野生型病毒的抑制情况。
[0038]因此，以本发明为基础，将为深入开展CA16病毒复制与致病机理研究提供便捷的平台，为今后筛选和开发新型疫苗奠定坚实的基础，具有十分重要的理论意义和现实意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为一种含有CA16/⑶09/24病毒株基因组cDNA的全长感染性克隆的构建示意图。
[0040]图2为一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆的构建示意图。
[0041]图3为亲本CA16与由感染性克隆拯救出的重组CA16的噬斑形态及生长曲线示意图。
[0042]A:亲本CA16及重组CA16噬斑形态示意图。；
[0043]B:相同感染复数下亲本CA16及重组CA16病毒的生长曲线示意图。
[0044]图4为由感染性克隆拯救出的重组CA16及eGFP_CA16病毒免疫荧光及噬斑形态示意图。
[0045]A:转染后不同时间点重组CA16及eGFP_CA16病毒免疫荧光图；
[0046]B:重组CA16及eGFP_CA16噬斑形态示意图。
[0047]图5为重组CA16及eGFP_CA16RNA转染vero细胞后的病毒生长曲线和eGFP_CA16病毒eGFP的表达情况示意图。[0048]A:转染后eGFP_CA16病毒的eGFP的表达情况示意图；；
[0049]B:转染后重组CA16及eGFP_CA16病毒的生长曲线示意图。
[0050]图6为抗病毒药物NITD008对亲本CA16、重组CA16及eGFP-CA16病毒的抑制作用示意图。
[0051]A:不同浓度NITD008作用下eGFP_CA16病毒的eGFP表达情况；
[0052]B:不同浓度NITD008作用下亲本CA16、重组CA16及eGFP_CA16病毒的病毒滴度曲线示意图。
【具体实施方式】
[0053]本实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以下实施例，还可以有许多变形。因此本领域的技术人员在本发明公开内容的基础上做的修改或改进，均应属于本发明要求保护的范围。
[0054]实施例1:
[0055]一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆的制备，其步骤是:
[0056]1.CA16/⑶09/24 病毒 RNA 的提取:
[0057]取140ul 的亲本 CA16:CA16/⑶09/24 病毒液(来自 Jian-Feng Han, NanYu, Yu-Xian Pan, S1-Jie He, L1-Juan Xu, Ru1-Yuan Cao, Yue-Xiang Li, Shun-YaZhu, Yu Zhang, E-De Qin,Xiao-Yan Che,Cheng-Feng Qin.Phenotypic and genomiccharacterization of humancoxsackievirus A16strains with distinct virulence inmice.Virus Res.2014.Tan22; 179:212-9.,按照 QIAamp Viral RNA Mini Kit (购至 Qiagen公司)试剂盒说明书的要求抽提CA16的RNA，于_80°C保存备用；
[0058]2.CA16/⑶09/24病毒株基因组序列分段扩增:
[0059]构建带有CA16全长基因组的cDNA感染性克隆:根据CA16/⑶09/24病毒株序列(GenBank accession n0.KC117317),以步骤I中的病毒RNA为模版，采用RT-PCR分成四个片段进行基因扩增，这四个片段分别命名为片段A，片段B，片段C，和片段D，其中片段A为T7+基因组l-2441nt序列，T7为启动子，启动子序列如SEQ ID N0.2所示，位于病毒基因组5’ UTR之前，是为了保证构建的cDNA在体外转录得到基因组RNA;片段B为基因组2101-3782nt序列，片段C为基因组3511_6362nt序列，片段D为基因组5940-7409nt+poly (A)27 序列,poly (A)27 序列为 SEQ ID N0.3 所示，四个片段分别用 AatII和Smal/Clal插入低拷贝质粒pACYC177载体，转化至大肠杆菌感受态HB101 ;质粒均经过DNA测序鉴定为正确序列，分别命名为CA16-A，CA16-B, CA16-C和CA16-D ；
[0060]3.含有病毒基因组的CA16cDNA感染性克隆的构建:
[0061](1)CA16基因组 片段A+B的拼接:用NdeI和SmaI (均购于美国NEB公司)酶切上述步骤2中所得的CA16-A和CA16-B，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技有限公司)回收CA16-A的大片段与CA16-B的大片段，使用Thermo ScientificNanoDrop2000 (购于Thermo公司)测定回收片段的浓度,使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的质量。将CA16-A的大片段作为载体，CA16-B的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶(购于美国NEB公司)将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101，挑取菌落并进行PCR鉴定。PCR的鉴定反应体系为:10Xbuffer:2y l，dNTP:0.4μ 1，引物(5，-GAAGTCAACAACCTAAAGAC-3，):0.2 μ 1，引物(5，-CACTAGCTGGTGACATGAAG-3，):0.2 μ I，Taq 酶:0.2 μ 1，水:16.8 μ 1，总体系 20 μ 1.扩增条件为:94°C 2min，94°C 20s, 55°C 10s,72°C lminl0s,72°C 5min，16°C 10min，30个循环。将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，将测序正确的质粒命名为CA16-AB ；
[0062](2) CA16基因组片段C+D的拼接:用AatII和SphI (均购于美国NEB公司)酶切上述步骤2中所得的CA16-C和CA16-D，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收CA16-C的大片段与CA16-D的大片段,使用Thermo Scientific NanoDrop2000测定回收片段的浓度,使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的质量。将CA16-D的大片段作为载体，CA16-C的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101，挑取菌落并进行PCR鉴定。PCR鉴定的反应体系为:10 Xbuffer: 2 μ 1，dNTP: 0.4 μ 1，引物(5，-CCTATTCTGGTGCACCTAAG-3，):0.2μ I,引物(5，-GTGTCATTGTCAACCCATAC-3，):0.2μ I1TaqSI:0.2 μ 1，水:16.8 μ 1，总体系 20 μ 1.扩增条件为:94°C 2min, 94°C 20s, 55°C 10s,72°C lmin50s,72°C 5min, 16°C 10min，30个循环。将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒命名为CA16-CD ；
[0063](3)CA16基因组全长A+B+C+D的拼接:用AatII (前面已述)和EcoRV (购于美国NEB公司)酶切上述步骤中所得的CA16-AB和CA16-CD，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收CA16-AB的大片段与CA16-CD的大片段，使用Thermo Scientif icNanoDrop2000测定回收片段的浓度，使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的质量。将CA16-CD的大片段作为载体，CA16-AB的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101，挑取菌落并进行PCR鉴定。PCR鉴定的反应体系为:10Xbuffer:2y I, dNTP :0.4 μ I,引物(5，-GACACCTCGCTACACACAAC-3，):0.2 μ 1，引物(5，-TCTCTGATTAGCTCTGACAC-3’ ):0.2 μ 1，Taq 酶:0.2 μ 1，水:16.8 μ 1，总体系 20 μ 1.扩增条件为-MV 2min，94°C 20s, 55°C 10s，72。。lmin50s,72°C 5min, 16°C 10min，30 个循环。将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒即为拼接完成的包含有CA16全长基因组的cDNA质粒(图1)，命名为pACYC_CA16_FL。
[0064]4.带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆的的构建:
[0065](I)插入BsiWI和NotI酶切位点，以及2A蛋白酶切割位点(AITTL)的CA16全长感染性克隆的构建:
[0066]①片段T7-5，UTR-Bsiff1-Not1-2A protease cleavage site_VP4 的扩增:以PACYC-CA16-FL 为模板，分别使用 PrimeSTAR HS 酶扩增含有 T7_5’ UTR-Bsiff1-NotI 的序列，引物为 SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.14 所示，以及含有 NotI_2A protease cleavagesite-VP4的序列，引物为SEQ ID N0.15和SEQ ID N0.13所示，2A蛋白酶切割位点(AITTL)的序列如SEQ ID N0.4所示，分别回收PCR产物；以上述所得的2段PCR产物为模板，使用 PrimeSTAR HS 酶扩增含有 T7-5’ UTR-Bsiff1-Not1-2A protease cleavage site_VP4 的序列，引物为SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.13，回收DNA片段。PCR的反应体系均为5 XPSbuffer:10 μ 1，dNTP:4 μ 1，引物:0.5 μ 1，引物:0.5 μ 1，模板:0.5 μ 1，PrimeSTAR HS 酶:
0.5 μ 1，水:34 μ I。扩增条件为-MV 2min, 94。。20s, 55°C 10s, 68°C 2min40s, 68°C IOmin, 16°C IOmin, 30 个循环。；
[0067]②pACYC177-CA16-FL-5’ UTR-Bsiff1-Not1-VP4 克隆的构建:分别用 AatII和 Sail 双酶切片段 T7-5，UTR-Bsiff1-Not1-2A protease cleavage site_VP4 和质粒PACYC-CA16-FL，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，经过T4DNA连接酶将回收的酶切产物按照片段:载体摩尔比为6:1进行连接，并将连接产物转化HBlOl感受态，将PCR鉴定阳性的菌落进行培养并抽提质粒，测序正确，获得的质粒即为插入BsiWI和NotI酶切位点，以及2A蛋白酶切割位点(AITTL)的CA16全长感染性克隆，命名为pACYC177-CA16_FL-5’ UTR-Bsiff1-Not1-VP40
[0068](2) PCR扩增绿色荧光蛋白基因eGFP片段:
[0069]以带有eGFP基因的质粒pEGFPNl (购自Clontech公司)为模版，使用PrimeSTARHS酶，由特异引物扩增eGFP基因片段，其序列为SEQ ID N0.5所示，扩增eGFP的引物为SEQID N0.16和SEQ ID N0.17。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物，并于_20°C保存备
用。；
[0070](3)将绿色荧光蛋白基因 eGFP 插入载体 pACYC177-CA16-FL_5’ UTR-Bsiff1-Not1-VP4:将 eGFP 和载体 pACYC177-CA16-FL_5’ UTR-Bsiff1-Not1-VP4 分别用 BsiWI 和 NotI 双酶切。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，使用Thermo Scientific NanoDrop2000测定回收产物的浓度，使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测回收产物的质量。经过T4DNA连接酶将回收的酶切产物按照片段:载体摩尔比为6:1进行连接，并将连接产物转化HBlOl感受态，将PCR鉴定阳性的菌落进行培养并抽提质粒，测序正确，获得的质粒即为带有绿色荧光蛋白基因eGFP的CA16感染性克隆(图2)，命名为pACYC177-eGFP-CA16_FL，其序列如SEQID N0.1 所示。
[0071]实施例2:
[0072]带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆成功拯救出与重组CA16病毒生长趋势相同的病毒:
[0073]1.质粒的线性化和酚氯仿抽提:用MluI(前面已述)分别酶切IOyg质粒PACYC177-CA16-FL 和质粒 pACYC177-eGFP-CA16_FL，37°C酶切两小时，经 0.8% 琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切完全后，向酶切产物中加入100 μ I饱和酚(购自国药集团化学试剂公司)，振荡混匀，17000g离心5min，吸取上清于新的离心管中，并向原离心管中加入100 μ I无菌水振荡混匀，17000g离心5min ;吸取上清与上一步所得上清合并(总体积约200μ 1)，加入200 μ I氯仿(购自国药集团化学试剂公司)混匀，17000g离心5min ;吸取上清于无RNAase的离心管中(约150~200 μ I),加入十分之一体积的pH5.2, 3mol/l醋酸钠(购自国药集团化学试剂公司)和2.5倍体积无水乙醇(购自国药集团化学试剂公司)混匀，_20°C放置30min，17000g离心5min ;吸弃上清，加入lml70%乙醇洗涤，17000g离心5min，吸弃上清；室温放置15min,最后加入 11 μ I 无 RNAase 的水溶解，使用 Thermo Scientific NanoDrop2000 测定DNA的浓度，使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，于_20°C保存备用。
[0074]2.体外转录RNA:各取I μ g上述酚氯仿抽提的pACYC177-CA16-FL和pACYC177-eGFP-CA16-FL线性化产物作为模板，使用体外转录试剂盒MEGA Script T7kit(购自美国Ambion公司)，按照试剂盒说明书分别得到重组CA16的RNA及eGFP_CA16的RNA。用Thermo Scientific NanoDrop2000测定RNA的浓度,使用0.8%新鲜制备的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量,于_80°C保存备用,用于以下实施例。
[0075]3.转染后不同时间点的重组CA16及eGFP_CA16病毒样以及相同感染复数下(感染复数MOI为0.1)不同时间点的重组CA16及亲本CA16病毒样收集:(I)于转染前一天，接种2 X IO5个vero细胞于6孔板培养板中，每孔放置三个IOmmX IOmm盖玻片，使细胞在转染当天达到约80%;转染时，先弃小皿中培养基，用Iml Opt1-MEM洗一次，再加Iml Opt1-MEM(使细胞处于浸润状态)；于1.5mlEP管中加入Iml Opt1-MEM，加4ul DMRIE-C (DMRIE-C用前先混匀)先上下颠倒混匀，再分别加入Iug体外转录得到的重组CA16的RNA及eGFP_CA16的RNA (对照组不加RNA)，上下颠倒混匀；迅速弃小皿中Opt1-MEM，将混匀物加入孔中(动作要轻，勿对着细胞吹打)；于37°C二氧化碳培养箱中培养4h后，弃培养物，再各加2mL含2%FBS的DMEM培养基；37°C，5%C02培养箱中培养，显微镜下每天观察实验组和对照组的细胞状态，并收集实验组的病毒上清，作为eGFP-CA16病毒与重组CA16病毒转染后不同时间点的病毒样，于_80°C保存，于荧光显微镜下每天观察eGFP-CA16eGFP的表达情况，并分别于转染后24、48、72h后取一个玻片，用5%丙酮固定液对细胞室温固定15分钟，PBS洗三遍后，于4°C保存。(2)于35mm细胞培养皿中接种2 X IO5Vero细胞，在37°C，5%C02培养条件下，待汇合度达到60%时，按照感染复数MOI为0.1，分别向每孔中加入400 μ I稀释后的重组CA16及亲本CA16病毒液，37°C、5%C02培养箱中吸附Ih后，弃病毒液，每孔中加入2ml含2%胎牛血清的DMEM培养基，分别于感染后12、24、36、48h收病毒上清，作为重组CA16及亲本CA16病毒相同感染复数下不同时间点的病毒样，于-80°C保存。
[0076]4.亲本CA16、重组CA16及eGFP_CA16病毒的生物学特性比较:使用单层噬斑的方法检测相同感染复数下亲本CA16及重组CA16病毒的生长曲线及噬斑形态，同时用单层噬斑方法检测转染后不同时间点的重组CA16病毒与eGFP-CA16报告病毒生长曲线，具体方法是:在24孔细胞培养板的各孔中分别接种I X IO5个VeiO细胞，待细胞汇合度达到90%时，弃孔中的培养基，加入100μ I用含2%FBS的DMEM培养基10倍比稀释的病毒，37°C吸附lh，每15分钟充分晃动一次。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入含有2%FBS的DMEM培养基和2%甲基纤维的素覆盖物，于37°C、5%C02的培养箱中培养3天，待噬斑形成后用含有1%结晶紫和3.7%甲醛的染色液染色，室温处理30min后，取出孔中的覆盖物，并用流水冲洗孔底，烘干后即可观察噬斑形态(图3A;图4B)并计数(图3B，表1 ;图5B，表2)。从图中可以看到，重组CA16病毒与亲本CA16病毒具有相似的噬斑形态和生长曲线，eGFP-CA16病毒生长曲线与CA16病毒生长曲线趋势相同，同时，eGFP-CA16的病毒滴度随着eGFP的表达水平提高而增加，表明eGFP的表达情况可以反映eGFP-CA16病毒的生长情况，进而反映出亲本CA16病毒的生长趋势。
[0077]表1相同感染复数下不同时间点的重组CA16及亲本CA16病毒的病毒滴度
[0078]
【权利要求】
1.一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆pACYC177-eGFP-CA16-FL，其序列为SEQ ID N0.1 所示。
2.权利要求1所述感染性克隆的构建方法，步骤如下: 1).提取亲本CA16(CA16/⑶09/24)病毒株基因组RNA ； 2).CA16/⑶09/24病毒株基因组序列分段扩增: 以步骤I中的亲本CA16病毒RNA为模版，采用RT-PCR分别获得片段A、B、C和D，四对引物分别为 SEQ ID N0.6和 SEQ ID N0.7 ；SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9 ；SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11 ；SEQ ID N0.12 和 SEQ ID N0.13 所示;四个片段分别用 AatII 和 Smal/Clal插入低拷贝质粒PACYC177载体，质粒均经过DNA测序鉴定为正确序列，分别命名为CA16-A，CA16-B, CA16-C和 CA16-D ； 3).含有病毒基因组的CA16cDNA全长感染性克隆的构建: (OCA16基因组片段A+B的拼接:用NdeI和SmaI酶切上述步骤2中所得的CA16-A和CA16-B,回收CA16-A的大片段与CA16-B的大片段；将CA16-A的大片段作为载体，CA16-B的大片段作为片段，使用T4 DNA连接酶将载体与片段连接，测序正确的质粒命名为CA16-AB ； (2)CA16基因组片段C+D的拼接:用AatII和SphI酶切上述步骤2中所得的CA16-C和CA16-D，回收CA16-C的大片段与CA16-D的大片段；将CA16-D的大片段作为载体，CA16-C的大片段作为片段，使用T4 DNA连接酶将载体与片段连接，测序正确的质粒命名为CA16-CD ； (3)CA16基因组全长A+B+C+D的拼接:用AatII和EcoRV酶切上述步骤中所得的CA16-AB和CA16-⑶，回收CA16-AB的大片段与CA16-⑶的大片段；CA16_⑶的大片段作为载体，CA16-AB的大片段作为片段，使用T4 DNA连接酶将载体与片段连接，测序正确的质粒即为拼接完成的含有CA16全长基因组的cDNA质粒，命名为pACYC-CA16-FL ； 4).带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆的的构建: (1)插入BsiWI和NotI酶切位点，以及2A蛋白酶切割位点(AITTL)的CA16全长感染性克隆的构建: ①片段T7-5， UTR-Bsiff1-Not1-2A protease cleavage site_VP4 的扩增:以PACYC-CA16-FL 为模板，扩增含有 T7-5’UTR-BsiW1-NotI 的序列，引物为 SEQ ID N0.6 和 SEQID N0.14 所不；扩增含有 NotI_2A protease cleavage site_VP4 的序列，引物为 SEQ IDN0.15和SEQ ID N0.13所示，2A蛋白酶切割位点(AITTL)的序列如SEQ ID N0.4所示，分别回收PCR产物；以上述所得的2段PCR回收产物为模板，扩增含有T7-5 ’ UTR-BsiW1-Not1-2Aprotease cleavage site_VP4 的序列，引物为 SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.13，回收 DNA 片段； ②pACYC177-CA16-FL-5’ UTR-Bsiff1-Not1-VP4 克隆的构建:分别用 AatII 和 SalI 双酶切片段n-5，UTR-BsiW1-Not1-2A protease cleavage site_VP4和质粒pACYC_CA16_FL，经过T4 DNA连接酶将回收的酶切产物进行连接，测序正确的质粒即为插入BsiWI和NotI酶切位点，以及2Α蛋白酶切割位点(AITTL)的CA16全长感染性克隆，命名为pACYC177_CA16-FL-5’ UTR-Bsiff1-Not1-VP4 ； (2)PCR扩增绿色荧光蛋白基因eGFP片段: 以带有eGFP基因的质粒pEGFPNl为模版，使用PrimeSTAR HS酶，扩增eGFP基因片段，序列为SEQ ID N0.5所示，扩增eGFP的引物为SEQ ID N0.16和SEQ ID N0.17 ；(3)将绿色荧光蛋白基因 eGFP 插入载体 pACYC177-CA16-FL-5’ UTR-Bsiff1-Not1-VP4:将 eGFP 和载体 pACYC177-CA16-FL-5’ UTR-Bsiff1-Not1-VP4 分别用 BsiWI 和 NotI 双酶切；经过T4 DNA连接酶将回收的酶切产物进行连接，测序正确的质粒即为带有绿色荧光蛋白基因eGFP的CA16感染性克隆。
3.权利要求1所述的感染性克隆在制备病毒上的应用。
4.权利要求1所述的感染性克隆在抗CA16病毒药物筛选上的应用。
【文档编号】C12N15/66GK103805634SQ201410077204
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月5日 优先权日:2014年3月5日
【发明者】张波, 邓成林, 徐琳琳, 秦成峰, 李晓丹, 袁志明, 叶寒青 申请人:中国科学院武汉病毒研究所