一种血清淀粉样蛋白a及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种血清淀粉样蛋白A及其编码基因和应用。血清淀粉样蛋白A基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1的第148位-567位碱基所示。血清淀粉样蛋白A，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。该基因在软体动物中属于首次发现，目前该基因除了在脊椎动物中有发现之外，在无脊椎动物中则只有在棘皮动物有所发现。定量PCR实验表明，牡蛎SAA在细菌感染后显著上调，与哺乳动物极为相似，因此该基因也可以作为检测牡蛎健康状况的金标准。通过检测该基因可以随时监测牡蛎的健康状况，对于牡蛎疾病的预防提供一个积极而准确的警戒信号，防止了灾害的扩大。该技术的应用，将进一步提升养殖贝类的种质创新能力，支撑产业的高效可持续性发展。
【专利说明】—种血清淀粉样蛋白A及其编码基因和应用
【技术领域】:
[0001]本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种血清淀粉样蛋白A及其编码基因和应用。
【背景技术】:
[0002]作为世界上最大的贝类养殖国，我国的贝类养殖已经成为沿海海水养殖业的支柱之一。我国贝类年产量占世界贝类总产量的60%以上。据2012年商务部统计，2011年，我国海洋贝类养殖产量为1179.6万吨，其中牡蛎375.63万吨，经济价值达到200多亿元人民币，占海水贝类养殖产量的30 %以上，因此，牡蛎的养殖在我国沿海经济社会发展中占据举足轻重的地位，并具有巨大的发展潜力。但是，我国海洋贝类的发展是以传统养殖育种为主，以面积、能耗为代价的，产量因各种条件变化而波动，而且，由于缺乏有效的疾病检测手段，随着养殖规模的扩大，对于牡蛎养殖的风险也越来越大。以太平洋牡蛎为例，大规模死亡事件频繁发生，甚至一些养殖的二龄牡蛎死亡率也达到40%-50%，有的高达70%-80%，有的养殖场的牡蛎几乎全部死光。引起牡蛎死亡的原因很多，其中致病菌及寄生虫的侵害加重了牡蛎的大量死亡，特别是在水交换差、水质欠佳的高温季节更易使牡蛎患病死亡。因此，建立实时的牡蛎养殖病害的预防防治机制，是人们所亟待解决的问题之一。
[0003]血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A, SAA)属于载脂蛋白家族成员，是目前应用最为广泛的病理检测的金标准。在人类等脊椎动物中，SAA已经被开发成型的试剂盒，广泛的应用于甄别宿主的健康与否。环境胁迫、创伤以及病原菌感染均能引起SAA的急性显著性应答，这些因素使该蛋白具有广阔的应用前景。而且，该蛋白正常情况下表达水平不高，而病理情况下的表达高达正 常水平的数百倍至数千倍，从而提高了仪器检验的灵敏度，检测手段的可操作性大大提高。
【发明内容】
:
[0004]本发明的第一个目的是提供一个牡蛎的病理检测的标志性基因，即血清淀粉样蛋白 A (serum amyloid A, SAA)基因。
[0005]本发明的血清淀粉样蛋白A基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第148位-567位碱基所示。
[0006]本发明的第二个目的是提供血清淀粉样蛋白A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID N0.2 所示。
[0007]本发明的第三个目的是提供血清淀粉样蛋白A基因作为牡蛎健康状况的标志性基因在制备牡蛎的病理检测试剂中的应用。
[0008]本发明在香港巨牡蛎转录组测序的基础上，发现了一个牡蛎的病理检测的标志性基因，即血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A, SAA)基因。通过RACE技术，我们获得了该基因的全长，该基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1的148bp-567bp所示，其编码的血清淀粉样蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。该基因的核酸序列具有高度的物种特异性，其核酸序列约有40-60%同源于已知其他物种的SAA基因，该基因在软体动物中属于首次发现，目前该基因除了在脊椎动物中有发现之外，在无脊椎动物中则只有在棘皮动物有所发现。定量PCR实验表明，牡蛎SAA在细菌感染后显著上调，与哺乳动物极为相似，因此，该基因也可以作为检测牡蛎健康状况的金标准。通过检测该基因可以随时监测牡蛎的健康状况，对于牡蛎疾病的预防提供一个积极而准确的警戒信号，防止了灾害的扩大。该技术的应用，将进一步提升养殖贝类的种质创新能力，支撑产业的高效可持续性发展。
【专利附图】
【附图说明】:
[0009]图1.实时定量PCR检测SAA mRNA在不同组织中的分布。实验结果表明SAA在性腺、外套膜与触唇中有显著性表达，在鳃、心脏、闭壳肌和消化腺中有中度表达，在血细胞几乎无表达。
[0010]图2.病原菌刺激诱导SAA的表达。溶藻弧菌(A)、葡萄球菌图(B)与酵母菌图(C)等病原菌分别刺激后，血细胞中SAA的表达显著上调。星号(**)指示和对照组差异极其显著。
【具体实施方式】:
[0011]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0012]实施例1:
[0013]一、RNA提取及反转录
[0014]a).香港巨牡贩细胞或组织加Trizol后,采用组织研磨器研磨,室温放置5min,使其充分裂解。
[0015]b).12，OOOrpm 离心 5min,弃沉淀。
[0016]c).按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿,振荡混匀后室温放置15min。
[0017]d).4°C 12，OOOg 离心 15min。
[0018]e).吸取上层水相，至另一离心管中。
[0019]f).按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5_10min。
[0020]g).4°C 12，OOOg 离心 lOmin，弃上清，RNA 沉于管底。
[0021]h).按lml75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
[0022]i).4°C 8, OOOg 离心 5min,尽量弃上清。
[0023]j).室温晾干或真空干燥5-10min。
[0024]k).可用 50ul H20, TE buffer 或 0.5%SDS 溶解 RNA 样品，55_60°C，5-lOmin。
[0025]l).在室温孵育 15min 之后，加入 250 μ L DNase Stop Solution (DSA),在
13,000 X g 离心 lmin。
[0026]m).重复步骤a-j，加IOOyL无核酸酶水，然后，在13，OOOXg离心lmin，弃离心柱，使用分光光度计测量所收集的溶液中的RNA的浓度，分装后，贮存于_80°C。
[0027]η).第一条链cDNA的合成
[0028]l)DNase I 消化
[0029]按照如下组分分别将各组的RNA加入到PCR离心管中
[0030]
【权利要求】
1.一种血清淀粉样蛋白A基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第148位-567位碱基所示。
2.一种血清淀粉样蛋白A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A基因作为牡蛎健康状况的标志性基因在制备牡蛎的病理检测试剂中的应用。
【文档编号】C12N15/12GK103834663SQ201410084163
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】向志明, 瞿符发, 肖述, 喻子牛 申请人:中国科学院南海海洋研究所