一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法，本发明的特异性杀伤细胞为DC疫苗，CIK，CTL细胞的混合物，所述制剂含有胸腺五肽，将其和杀伤细胞混合具有明显提高治疗效果的作用。
【专利说明】一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗肿瘤的细胞免疫治疗新技术，特别涉及一种初始T细胞来源的新型肿瘤特异性杀伤细胞(DC-CIK-CTL)制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]中国专利2012101271586描述了一种效应细胞制备方法，即应用⑶4+和⑶8+混合的初始T细胞，制备DC-CIK-CTL效应细胞，同时提供一种应用复合制剂对肿瘤微环境进行干扰，从而打破肿瘤免疫耐受，在此基础上进行效应细胞回输治疗的新技术。其中DC-CIK-CTL效应细胞的制备方法是:外周血获得单状核细胞，体外分离出DC细胞和总T细胞。DC细胞经过5天的培养扩增并加入病人自体肿瘤相关全抗原至第7天成熟，获得肿瘤特异性DC疫苗备用。T细胞则进一步分离出初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞，将两种初始T细胞按1:1混合，经INF- Y冲击后，应用⑶3单抗和IL-2扩增至第7天制备CIK。半数细胞移瓶后加入DC疫苗激活制备肿瘤特异性CTL，另外半数细胞继续CIK培养，至第10天分别收获CIK和CTL效应细胞，混合移入含有2.0g人血白蛋白的250ml0.9%氯化钠中，制备成高效DC-CIK-CTL。回输前首先对病人实施微环境干扰，方法是:环磷酰胺(CTX)600-1200mg静脉滴入，I次/日共2天，次日静脉回输DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。细胞回输治疗第一天引流区域淋巴结注射DC疫苗，每周一次共三次。
[0003]但实验 发现使用该方法，临床有效率虽然有所提高，但还未达到理想程度，为此本发明人对上述方法进行了改进，取得了意想不到的技术效果。
【发明内容】
[0004]本发明的主要目的在于:解决目前DC-CIK-CTL方法肿瘤杀伤率低、临床有效率低的问题，应用本技术，可以显者提闻肿瘤的杀伤效率，提闻临床有效率和客观疗效。
[0005]为保证上述技术的实施，本发明提供了一种特异性肿瘤杀伤细胞制剂及其制备方法。
[0006]本发明的制剂包括肿瘤特异性杀伤细胞(DC-CIK-CTL)和胸腺五肽。
[0007]本发明提供一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂，其特征在于，含有肿瘤特异性杀伤细胞以及胸腺五肽，其中胸腺五肽加入量为5mg。
[0008]本发明的制剂，所述肿瘤特异性杀伤细胞，制备方法采:
[0009]外周血单状核细胞采集:
[0010]应用COBESPECTRA细胞成分分离机，按照说明书设定参数设定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞120_140ml，分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清，4°C冷藏备用，收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpmX15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层，分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpmX10分钟，弃上清，加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpmX 5分钟洗涤，弃上清，重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数，
[0011]DC和T细胞分离:
[0012]175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化，将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在I X IO7个/ml，加入终浓度10-20%的自体血清，37°C，5%C02饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为外周血总T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞，
[0013]DC成熟和肿瘤特异性DC疫苗制备:
[0014]贴壁的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml，置于37°C，5%C02饱和湿度培养箱中扩增培养5天，第6天加入自体肿瘤相关抗原50ug/ml，次日补充10-15%的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测⑶83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗，
[0015]初始⑶4+T细胞及初始⑶8+T细胞分选:
[0016]I)、应用美国BD、美国R&D、或德国美天旎公司生产的免疫磁珠试剂盒进行初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选，采用美天旎公司的50nm微小磁珠，该磁珠可被细胞生物降解而无需解离磁珠，对细胞无损伤、无激活、且对细胞生理功能无影响，
[0017]①、初始⑶4+T细胞分选:将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照Na'ivera4+TcellisolationkitII, human试剂盒说明书，首先加入生物素偶联的鸡尾酒单抗作为一抗，然后加入抗生 物素磁珠，置于磁场进行初始CD4+T细胞阴性分选，以祛除非初始T细胞及NK细胞等，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始CD4+T细胞，将所获得的CD4+T细胞离心洗涤2-3次备用，
[0018]②、初始⑶8+T细胞分选:将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照Nai've⑶8+Tcellisolationkit, human试剂盒说明书分两步进行分选,第一步,分别加入生物素偶联的鸡尾酒单抗作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行阴性分选，以祛除非初始T细胞和NK细胞，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始T细胞，第二部，对所收集的初始T细胞进行⑶8+磁珠标记，置于磁场进行阳性分选，收获初始⑶8+T细胞，离心洗涤2-3次备用，
[0019]2 )、应用临床级自动细胞分选设备如美天旎的CI i tii MACS' Plus进行分选，CliniVIACSi Plus 细胞分选系统包括 CliniMACSPlus 仪器、CliniMACS 管道、CliniMACS 试剂和CliniMACS缓冲液，是一个以MACS技术为基础的临床级全自动细胞分选系统，使操作者能够在完全封闭、无菌的系统内进行临床级的靶细胞富集或去除，使用CliniMACS.? Plus仪器，能够实现高纯度、高回收率的靶细胞分选，分选出的靶细胞可以直接应用于实验研究和临床治疗，
[0020]将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，注入CliniMACSPlus细胞准备袋，用相应细胞特异性抗体磁性标记靶细胞，洗涤细胞以去除多余的抗体，然后，细胞准备袋与管道相连，后者依次连接CliniMACS缓冲液袋和细胞收集袋，分别设定初始⑶4+T细胞和初始⑶8+T细胞的分选程序，CliniMACSPlus仪器将按照程序自动开始分选，总T细胞将自动通过分选柱，并进行一系列洗涤步骤，最终从分选柱中洗脱靶细胞至收集袋中，收获初始⑶4+T细胞和初始⑶8+T细胞，将初始⑶4+T细胞和初始⑶8+T细胞按照1:1混合备用，[0021]CIK 制备:
[0022]取175cm2培养瓶，分别加入AIM-V无血清培养基20ml，将悬浮的初始T细胞移入，置于37°C，5%C02细胞培养箱中培养，次日，补充50%的CIK培养基，第5天补充IL-2培养基，以后根据培养液颜色适量补充IL-2培养基，每次补充40%以上，第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养，
[0023]CTL 制备:
[0024]第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5:1，继续培养3天获取CTL，
[0025]高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备:
[0026]第10天分批取DC疫苗1-2 X IO7复苏、洗涤后、和数量分别为0.5 X IO9的CIK和CTL细胞混合，细胞总数量控制为1-2 X 109，加入50ml离心管，生理盐水离心洗涤3_6次去除细胞碎片，得到肿瘤特异性杀伤细胞(DC-CIK-CTL)。
[0027]因此本发明的制剂，含有肿瘤特异性杀伤细胞(DC-CIK-CTL)和胸腺五肽，根据需要还可以加入1%的2.0g人血白蛋白，使用时将其溶解在250ml0.9%氯化钠输液中，输入到患者体内。
[0028]本发明的另一个内容是，用本发明的细胞制剂治疗肿瘤病人，其方法是将本发明制备的制剂回输到肿 瘤病人体内。
[0029]本发明还包括制备一种干扰微环境制剂，该制剂为注射用环磷酰胺CTX，注射用CTX,以干扰肿瘤微环境为目的，而不以抗肿瘤为目的，该制剂的制备方法依据制剂学常规技术制备即可，如制备成水针或粉针，也可直接制备成输液剂。以上制剂的剂量范围分别为可一次性用于病人的剂量，如静脉注射用CTX—次用量为400-600mg/m2，制备成的制剂可直接输注，也可加入含有0.9%氯化钠或5%-10%的葡萄糖注射液中给病人输注。
[0030]本发明的细胞制剂和干扰微环境制剂的使用方法如下:
[0031 ] 环磷酰胺(CTX)600-1200mg静脉滴入，I次/日共2天，次日静脉回输DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。细胞回输治疗第一天引流区域淋巴结注射DC疫苗，每周一次共三次。
[0032]本发明的制剂的制备方法是将:肿瘤特异性杀伤细胞和胸腺五肽，人血白蛋白，以及0.9%氯化钠输液混合而成。
[0033]本发明将肿瘤特异性杀伤细胞和胸腺五肽联合使用，回输给患者，两者作用互补，起到协同增效作用，对肿瘤的杀伤效率大大提高。
[0034]以下通过实验数据说明本发明的有益效果:
[0035]采用不同方法进行B16黑色素瘤的荷瘤小鼠抗肿瘤体内实验。
[0036]
【权利要求】
1.一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂，其特征在于，含有肿瘤特异性杀伤细胞以及胸腺五肽。
2.根据权利要求1的制剂，其中胸腺五肽加入量为5mg。
3.根据权利要求1的制剂，其中肿瘤特异性杀伤细胞总数量控制为1-2X109，加入1%人血白蛋白2.0g，胸腺五肽5mg，250ml生理盐水，制备成肿瘤特异性杀伤细胞细胞制剂。
4.根据权利要求1的制剂，其中肿瘤特异性杀伤细胞为DC-CIK-CTL。
5.一种权利要求1的制剂的制备方法，所述肿瘤特异性杀伤细胞制备方法如下: 外周血单状核细胞采集: 应用COBESPECTRA细胞成分分离机，按照说明书设定参数设定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞120_140ml，分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清，4°C冷藏备用，收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpmX15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层，分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpmX10分钟，弃上清，加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpmX 5分钟洗涤，弃上清，重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数， DC和T细胞分离: 175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化，将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在I X IO7个/ml，加入终浓度10-20%的自体血清，37°C，5%C02饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为外周血总T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞， DC成熟和肿瘤特异性DC疫苗制备: 贴壁的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml，置于37°C，5%C02饱和湿度培养箱中扩增培养5天，第6天加入自体肿瘤相关抗原50ug/ml，次日补充10-15%的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测CD83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗， 初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选: I)、应用美国BD、美国R&D、或德国美天旎公司生产的免疫磁珠试剂盒进行初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选，采用美天旎公司的50nm微小磁珠，该磁珠可被细胞生物降解而无需解离磁珠，对细胞无损伤、无激活、且对细胞生理功能无影响， ①、初始⑶4+T细胞分选:将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照Nalve⑶4+Tcellisolationkitll, human试剂盒说明书，首先加入生物素偶联的鸡尾酒单抗作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行初始CD4+T细胞阴性分选，以祛除非初始T细胞及NK细胞等，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始CD4+T细胞，将所获得的CD4+T细胞离心洗涤2-3次备用， ②、初始⑶8+T细胞分选:将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照RVive⑶8+Tcellisolationkit, human试剂盒说明书分两步进行分选,第一步,分别加入生物素偶联的鸡尾酒单抗作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行阴性分选，以祛除非初始T细胞和NK细胞，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始T细胞，第二部，对所收集的初始T细胞进行⑶8+磁珠标记，置于磁场进行阳性分选，收获初始⑶8+T细胞，离心洗涤2-3次备用， 2)、应用临床级自动细胞分选设备如美天旎的QiniMACf Plus进行分选，CliniMACS*Plus细胞分选系统包括CliniMACSPlus仪器、CliniMACS管道、CliniMACS试剂和CliniMACS缓冲液，是一个以MACS技术为基础的临床级全自动细胞分选系统，使操作者能够在完全封闭、无菌的系统内进行临床级的靶细胞富集或去除，使用Cl.1ni\WC+SS' Plus仪器，能够实现高纯度、高回收率的靶细胞分选，分选出的靶细胞可以直接应用于实验研究和临床治疗， 将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，注入CliniMACSPlus细胞准备袋，用相应细胞特异性抗体磁性标记靶细胞，洗涤细胞以去除多余的抗体，然后，细胞准备袋与管道相连，后者依次连接CliniMACS缓冲液袋和细胞收集袋，分别设定初始⑶4+T细胞和初始⑶8+T细胞的分选程序，CliniMACSPlus仪器将按照程序自动开始分选，总T细胞将自动通过分选柱，并进行一系列洗涤步骤，最终从分选柱中洗脱靶细胞至收集袋中，收获初始CD4+T细胞和初始⑶8+T细胞，将初始⑶4+T细胞和初始⑶8+T细胞按照1:1混合备用， CIK制备: 取175cm2培养瓶，分别加入AIM-V无血清培养基20ml，将悬浮的初始T细胞移入，置于370C，5%C02细胞培养箱中培养，次日，补充50%的CIK培养基，第5天补充IL-2培养基，以后根据培养液颜色适量补充IL-2培养基，每次补充40%以上，第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养， CTL制备: 第8天DC疫苗回收后，将 每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5:1，继续培养3天获取CTL， 高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备: 第10天分批取DC疫苗1-2X IO7复苏、洗涤后、和数量分别为0.5X IO9的CIK和CTL细胞混合，细胞总数量控制为1-2 X IO9,加入50ml离心管，生理盐水离心洗涤3_6次去除细胞碎片。
【文档编号】C12N5/0783GK103800898SQ201410092414
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】蔡建辉, 徐建强, 杨小岗, 胡玲玲 申请人:蔡颖