一种基于乳酸脱氢酶测定的卷烟烟气细胞毒性评价方法
【专利摘要】一种基于乳酸脱氢酶测定的卷烟烟气细胞毒性评价方法，包括以下步骤：1）配制实验试剂；2）细胞接种；3）卷烟烟气染毒；4）LDH测定；5）结果与分析。本发明通过烟气粒相物萃取液和烟气气相物吸收液的制备，可分别考察烟气粒相物、气相物的细胞毒性，适于多种贴壁培养细胞，可用于考察卷烟烟气对不同细胞系的细胞毒性。通过细胞裂解液的选择、LDH基质液反应时间的优化提高检测灵敏度。并通过卷烟烟气染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。通过LDH的测定，可反映卷烟烟气粒相物和气相物对细胞膜的损伤程度，揭示卷烟烟气的细胞毒性机理。此外，本测定方法还具有操作快速简便、灵敏性高、结果稳定的优点。
【专利说明】一种基于乳酸脱氢酶测定的卷烟烟气细胞毒性评价方法【技术领域】
[0001]本发明涉及卷烟烟气体外毒理学评价研究领域，具体说是一种基于乳酸脱氢酶(LDH)测定卷烟烟气粒相物或气相物细胞毒性的方法。
【背景技术】
[0002]开展体外毒理学实验是评价吸烟对健康危害的重要方法。其中，细胞毒性在包括癌症、炎症等许多病理过程中起到重要作用，细胞毒性试验是了解化合物与细胞和组织之间作用机理的重要途径。如何科学准确地评价卷烟产品以及烟草添加剂的危害性，目前国际上还没有统一的方法和程序。检测细胞毒性可通过多种生物学终点进行，例如通过测定酸性磷酸酶或其他蛋白活性来计算细胞数量、测定细胞代谢活性以及检测细胞膜的完整性等生物学终点进行评价。根据不同检测原理开展细胞毒性评价，可从不同角度揭示卷烟烟气细胞毒性的作用机理。
[0003]细胞凋亡或化合物染毒而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通过检测释放的乳酸脱氢酶的活性，可表征细胞膜的完整性，实现对化合物细胞毒性的定量分析。
[0004]目前，进行卷烟烟气细胞毒性评价时采用的方法大多基于细胞存活率测定的原理，考察卷烟烟气染毒对细胞膜完整性的影响还研究较少，亟需建立基于LDH测定的卷烟烟气细胞毒性评价方法，定量准确评价卷烟烟气粒相物和气相物的细胞毒性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是建立的一种基于LDH测定的卷烟烟气细胞毒性评价方法，为卷烟产品的细胞毒性评价提供方法学支持。LDH法的测定原理是基于在乳酸脱氢酶的作用下，氧化型辅酶I (NAD+)被反应生成的还原型辅酶I (NADH)，再与氧化型2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-苯四唑(INT)在硫辛酰胺脱氢酶(diaphorase)的催化下反应生成强生色物甲臜(formazan)，在490nm波长下产生吸收峰，从而确定释放的乳酸脱氢酶的活性，作为细胞膜完整性的标志，实现对细胞毒性的定量分析。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
一种基于乳酸脱氢酶测定的卷烟烟气细胞毒性评价方法，包括以下步骤:
I)配制实验试剂:有以下几种:
1、LDH基质液的配制:用0.2 mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐-盐酸(Tris-HCl)缓冲液(pH8.2)配制LDH基质液，其中各成分及其终浓度分别为:乳酸锂5 X IO-2 mol/L、硝基氯化四氮唑(INT) 6.6X10-4 mol/L、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS) 2.8X IO^4 mol/L、氧化型辅酶I (NAD) 1.3X10_3 mol/L，LDH基质液应在临用前配制。
[0007]2.细胞裂解液:20% 的曲拉通 100 (Triton-100)。
[0008]3.终止液:4M的盐酸(HCl)溶液。[0009]4.细胞培养基:溶剂为RPM1-1640培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为lOOyg/ml。
[0010]5.卷烟烟气染毒溶液:烟气染毒溶液包括烟气粒相物萃取液和烟气气相物吸收液。其具体制备方法如下:卷烟样品于温度(22±1) °C和相对湿度60%±3%条件下平衡48h;然后使用转盘式吸烟机抽吸卷烟，烟气总粒相物用剑桥滤片收集，根据烟气总粒相物质量加入相应体积的DMSO溶剂，得到最终浓度为10 mg/ml的烟气粒相物萃取液，使用前在一70 V以下储存；在收集烟气总粒相物的同时将气相物通入装有PBS溶液的吸收瓶(冰浴)中，粒相物收集完毕后，将PBS吸收液定容至与烟气粒相物萃取液中DMSO体积相同，通过
0.2 μ m的滤膜除菌后，得到最终浓度与烟气粒相物萃取液相当的烟气气相物吸收液，且必须在制备后半小时内使用。
[0011]2)细胞接种:本方法所用细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞。由于不同的细胞系中LDH酶的含量不同，因此在考察卷烟烟气对CHO细胞系的细胞毒性时，需开展预实验，对细胞接种密度进行优化。向96孔板的每孔中加入100 μ L细胞悬液，按照优化好的细胞接种密度进行细胞接种，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100 μ I生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μ I细胞悬液，于37 °C、5% C02条件下培养24 h。
[0012]3)卷烟烟气染毒:使用细胞培养基将卷烟烟气染毒溶液调整到不同浓度，设置7个非零浓度，细胞接种24h后，吸去培养液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔为一组分别设置为正常对照组、7个不同剂量的烟气染毒组和LDH最大释放组(细胞能释放出来的LDH最大量)，正常对照组和LDH最大释放组均每孔加入100 μ I的细胞培养基，烟气染毒组每孔加入100 μ I不同浓度的烟 气染毒溶液，96孔板的最外周36个孔中选择其中6个孔作为培养基背景对照，再选择6个孔加入最高染毒溶液作为染毒溶液背景对照，于37 °C、5%CO2条件下培养24 h。
[0013]4)LDH测定:染毒结束前15分钟，在LDH最大释放量孔中加入5 μ I裂解液。染毒结束后使用250g离心力对细胞培养板离心5分钟，每孔移取50 μ I上清至透明96孔板，加入100 μ ILDH基质液，反应一段时间后，加入50 μ I终止液，使用酶标仪检测每孔在490 nm波长处的吸光值。
[0014]5)结果与分析
原始吸光值A:A = A490 nm A (染毒孔吸光度值)=6个平行孔的吸光度平均值 A (染毒溶液背景)=6个平行孔的吸光度平均值 A (培养基背景)=6个平行孔的吸光度平均值 A(空白对照组)=6个平行孔的吸光度平均值 A (最大释放组)=6个平行孔的吸光度平均值
【权利要求】
1.一种基于乳酸脱氢酶测定的卷烟烟气细胞毒性评价方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)配制实验试剂: (1)LDH基质液的配制:用0.2mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐-盐酸(Tris-HCl)缓冲液(PH8.2)配制LDH基质液，其中各成分及其终浓度分别为:乳酸锂5 X IO-2 mol/L、硝基氯化四氮唑(INT) 6.6X10—4 mol/L、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS) 2.8X10—4 mol/L、氧化型辅酶I (NAD) 1.3X 10_3 mol/L, LDH基质液应在临用前配制； (2)细胞裂解液:20%的曲拉通100(Triton-100)； (3)终止液:4M的盐酸(HCl)溶液； (4)细胞培养基:溶剂为RPM1-1640培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM,青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100 μ g/ml ； (5)卷烟烟气染毒溶液； 2)细胞接种:所用细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞；向96孔板的每孔中加入100μ L细胞悬液，按照优化好的细胞接种密度进行细胞接种，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100 μ I生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μ I细胞悬液，于37 °C、5%C02条件下培养24 h ； 3)卷烟烟气染毒:使 用细胞培养基将卷烟烟气染毒溶液调整到不同浓度，设置7个非零浓度，细胞接种24h后，吸去培养液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔为一组分别设置为正常对照组、7个不同剂量的烟气染毒组和LDH最大释放组，正常对照组和LDH最大释放组均每孔加入100 μ I的细胞培养基，烟气染毒组每孔加入100 μ I不同浓度的烟气染毒溶液，96孔板的最外周36个孔中选择其中6个孔作为培养基背景对照，再选择6个孔加入最高染毒溶液作为染毒溶液背景对照，于37 °C、5% CO2条件下培养24 h； 4)LDH测定:染毒结束前15分钟，在LDH最大释放量孔中加入5 μ I裂解液，染毒结束后使用250g离心力对细胞培养板离心5分钟，每孔移取50 μ I上清至透明96孔板，加入100 μ ILDH基质液，反应一段时间后，加入50 μ I终止液，使用酶标仪检测每孔在490 nm波长处的吸光值； 5)结果与分析 原始吸光值A:A = A490 nm A (染毒孔吸光度值)=6个平行孔的吸光度平均值 A (染毒溶液背景)=6个平行孔的吸光度平均值 A (培养基背景)=6个平行孔的吸光度平均值 A(空白对照组)=6个平行孔的吸光度平均值 A (最大释放组)=6个平行孔的吸光度平均值:a光度儀-λ mmmmm'HA 空白对.1k1-a鑛.养基w景+.;麵聽難x 勝:。
2.根据权利要求1所述的基于乳酸脱氢酶测定的卷烟烟气细胞毒性评价方法，其特征在于:在开展细胞毒性评价前，需对染毒所用细胞株的细胞接种密度进行优化，选择LDH最大释放量与空白对照组吸光度值相差最大，且细胞处于指数增长期的细胞个数作为最优细胞接种密度，本发明中CHO细胞的最佳接种密度为10000个/孔。
3.根据权利要求1所述的基于乳酸脱氢酶测定的卷烟烟气细胞毒性评价方法，其特征在于:细胞裂解液使用时其终浓度为1%。
4.根据权利要求1所述的基于乳酸脱氢酶测定的卷烟烟气细胞毒性评价方法，其特征在于:LDH基质液的反应时间为15min。
5.根据权利要求1所述的基于乳酸脱氢酶测定的卷烟烟气细胞毒性评价方法，其特征在于:烟气染毒溶液包括烟气粒相物萃取液和烟气气相物吸收液，烟气粒相物萃取液、烟气气相物吸收液细胞毒性浓度的染毒区间分别包括50 μ g/ml-250 μ g/ml和100 μ g/ml-400μ g/ml范 围。
【文档编号】C12Q1/02GK103820524SQ201410094849
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月16日 优先权日:2014年3月16日
【发明者】陈欢, 杨进, 刘洋, 刘彤, 韩书磊, 吴帅宾, 付立伟, 侯宏卫, 胡清源 申请人:国家烟草质量监督检验中心